Name: FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T10:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 배우세요 쥐 피부 섬유 아세포를 FACS로 직접 격리하는 방법을. 체외 배양 없이 생리학적 표현형을 유지하여 상처 치유와 섬유증 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 (HPL에) NIH 보조금 R01 GM087609, (MTL에) (HPL에) 앤서니 슈, NIH 보조금 U01의 HL099776의 명예에 잉그리드 라이 빌 슈의 선물, Hagey 실험실에서 보조금에 의해 부분적으로 지원 소아 재생 의학 및 오크 재단 (MTL에, GCG와 HPL). GGW 의학의 스탠포드 대학, 스탠포드 의료 과학자 훈련 프로그램에 의해 지원 및 NIGMS 훈련 보조금 GM07365했다. ZNM는 성형 외과 재단 연구 활동 그랜트와 Hagey 가족 기금에 의해 지원되었다. MSH는 캘리포니아 재생 의학 연구소 (CIRM) 임상 연구원 교육 교부금 TG2-01159, 악안면 외과 의사의 미국 사회 (ASMS) / 악안면 외과 재단 (MSF) 연구 그랜트 수상하고, 이식 및 조직 공학 원정대 수상에 의해 지원되었다.

이 프로토콜은 실험 동물 관리에 스탠포드 대학 행정 패널에 의해 승인 된 방법을 따른다. 쥐 진피 1. 소화 <ol><li> 케타민 100 ㎎ / ㎏ + 자일 라진 (20) ㎎ / ㎏ + 아세 프로 마진 3 ㎎ / ㎏의 복강 내 주사하여 마취 후 경추 탈구로 쥐를 안락사. 참고 : 다양한 연령과 배경을 사용할 수 있습니다. </li><li> 면도와 지느러미 피부를 털을 뽑다. 약 100,000 세포 등쪽 피부 조각 X 100mm 60mm로부터 분리 될 수있다. </li><li> 깨끗한 건조 멸균 표면에 70 % 에탄올 대신에 마우스를 담근다. </li><li> 즉시 멸균 해부 가위를 사용하는 등의 마우스 피부를 수확. 암컷 마우스에서 유방 조직을 포함한 피. </li><li> 꼬리의 기초부터 텐트까지 피부에 집게를 사용하여 문헌-근막면을 따라 절개하기 전에 가로 절단을합니다. </li><li> 조심스럽게 수확하는 동안 어떤 피하 지방을 포함하지 않도록피부. 어떤 피하 지방의 수확 피부를 검사하고 조심스럽게 메스의 무딘 가장자리를 사용하여 긁어. </li><li> 얼음에 PBS 세척을 5 배 뒤에 betadine에서 수확 피부를 씻어. 주 : 오염을 방지하기 위해 가능한 무균에 가까운 피부를 유지하는 것이 중요하다. </li><li> 면도날을 사용하여 샘​​플이 2-3mm 조각 균일 일관성 때까지 멸균 접시에 가위를 해부 피부를 말하다. </li><li> DMEM에 1 ㎎ / ㎖의 농도로 50 ml의 20 ㎖의 콜라게나 제 IV를 함유하는 원뿔형 튜브를 준비한다. 튜브 당 다섯 생쥐 기초 튜브로 진피를 나눈다. </li><li> 수조 나 오븐 중 1 시간 동안 37 ℃에서 배양하는 동안 샘플을 격렬하게 교반한다. </li><li> 인큐베이터에서 샘플을 제거하고 멸균 후드에 바늘 3 ~ 5 배없이 10 ML의 주사기를 통해 전달합니다. </li><li> 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 샘플을 놓고 추가로 30 분 동안 격렬하게 흔들어. </li><li> 멸균 후드, 10 ml의 피펫을 사용하여 위 3 ~ 5 배 아래 샘플을 피펫. 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 필터를 통해 샘플을 피펫. </li><li> 세포의 수율을 최대화하고 40 ml의 총 부피를 가지고 동일한 필터를 10 % FBS DMEM 20㎖를 전달한다. 4 ℃에서 8 분 300g에서 원심 분리기. </li><li> 먼저 뜨는 나머지 이전에 상부 지방층을 제거하기 위해 큰 관심을 가지고, 멸균 유리 피펫을 이용하여 상층 액을 제거합니다. 참고 :이 단계는 지방 세포의 오염을 감소하는 것이 중요합니다. </li><li> 20 ml의 10 % FBS DMEM으로 펠렛을 재현 탁. </li><li> 70 μm의 필터를 통해 세포 / DMEM 서스펜션을 전달합니다. </li><li> 4 ℃에서 8 분 동안 300g에 10 ml의 10 % FBS DMEM과 필터 원심 분리기 필터링 된 현탁액을 씻어. </li><li> 다시 처음으로 남아있는 지방 층을 제거하기 위해주의하면서 멸균 유리 피펫을 이용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> RBC 상당한 오염이있는 경우 (펠릿 가시적 적색), 펠릿을 다시 일시20 mL의 ACK 용해 완충액 RT에서 5 분 동안 배양한다. 그렇지 않으면 24 단계로 건너 뜁니다. </li><li> FACS 완충액 (PBS, 10 % FBS, 0.1 % 아 지드 화 나트륨)의 동일 부피 (20 ㎖)을 첨가 한 후 혼합하고 흠없는 대조군으로 제쳐 5 ml의 분취 량을 유지한다. 4 ℃에서 8 분 동안 300g에 남아있는 샘플을 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 얼음에 펠렛을 넣어. FACS 시간을 사용할 수없는 경우 세포는이 시점에서 내려 고정 될 수있다. </li></ol> FACS에 의한 섬유 아세포 2. 분리 <ol><li> 각각의 펠릿에 대한 계보 항체 배양 믹스 500 μl를 확인합니다. , CD45 (1 : 200), Tie2의 (1시 50분), 테르을 : 먼저 튜브에 DNase의 (10 μg의 / ㎖)를 포함 외과 버퍼의 475 μl를 추가 한 다음 형광 접합 CD31 (100 1)를 추가하여이 작업을 수행 -119 (1 : 200), 및는 EpCAM (1 : 100)은 각각의 항체에 대한 항체를 각 희석액을 달성한다. </li><li> 리니지 항체 배양 믹스 500 μL의 각 펠렛을 다시 중단하고 20 분 동안 얼음이 현탁액을 품어. </li><li> 5 추가샘플의 DNase (10 μg의 / ㎖)를 포함하고 부드럽게 혼합 ml의 외과 버퍼. 4 ℃에서 8 분 300g에서 원심 분리기. </li><li> 상등액을 제거하고, 단계 (26)에서와 같이 5 ㎖의 FACS DNase를 함유 완충액 (10 μg의 / ml) 및 동일한 조건을 이용하여 원심 분리 세포 펠렛을 세척 하였다. </li><li> DNase의 (10 μg의 / ㎖)를 포함 500 μL FACS 버퍼에 펠렛을 재현 탁하고 생존 염료 컨트롤로 옆으로 50 μL 나누어지는했습니다. </li><li> 선택한 염료에 대한 표시 농도의 나머지 샘플 선택의 생존 염료를 추가합니다. </li><li> FACS 분석 (31)을 수행하고 생존 염료 - / CD31- / CD45- / Tie2- / 테르 - 119- / EpCAM- 세포 (그림 2A 참조) 정렬. 정렬 직접 FACS 버퍼에. </li></ol>

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</ol>

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이 논문에 설명 된 프로토콜이 하위 집단을 위해 선택 또는 후속 분석하기 전에 세포 배양에서의 시간이 필요하거나 기존의 방법에 비해, FACS 기반 정렬하여 섬유 아세포를 분리하는 수단을 제공한다. 섬유 아세포의 선별을 피부로부터 채취 필요한 시간은 약 6 시간이고; 그러나, 수확에 사용 된 마우스의 수는이 추정에 영향을 미칠 것이다. 프로토콜의 몇 가지 포인트는 특별한주의가 필요합니다. 첫째는 분리 과정과 원심 분리 소화 다음 소화 상청 상부 지방층을 제거하기 전에 피부에서 지방의 제거에 의해 지방 세포의 오염을 제한한다. 일부 지질 구성 요소가 튜브의 플라스틱 벽에 부착 이후 펠렛 세척을 오염시킬 수 있으므로 세포 펠렛 후 또한 신선한 튜브로 변경하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 두 번째 점은 표피에서 별도의 진피에 세심한주의를 포함표피 - 진피의 접합을 따라. 표피 세포를 오염하는 것은 FACS 고갈 전략에 의해 제거되지만, 여기에 오염을 제한하는 노력이 계속되어야한다...

섬유 아세포는 자주 플라스틱 기판에 부착 스핀들 모양의 세포로 형태 학적으로 정의된다. 합성 섬유 아세포 및 배아 및 성체 기관 (1)의 세포 외 매트릭스를 리모델링을 담당 원리 세포 유형이다. 섬유 아세포는 포유류의 개발에 중요하며, 따라서 각 조직 및 기관에 존재하는 세포 유형 이웃의 동작에 영향을 미치는 세포 외 환경에 실질적으로 기여한다. 섬유 아세포는 엄청난 임상 부담의 원인이 의료 조건의 다양한 세트 뒤에 주요 세포 유형입니다. 병리학 섬유 아세포 활성은 정상 조직의 기능 손상 및 피부 상처 치유, 죽상 동맥 경화증, 전신성 경화증, 혈관 손상 2-5 후 아테롬성 플라크의 형성 다음 조직 (예 : 폐, 간 등) 장기 섬유증, 반흔을 포함한다. 특히 상처 치유, 모두 급성과 만성, D를 포함정상 조직 등에도 유사한 기능이나 그것을 둘러싼, 다양한 병리학 적 상태에 걸쳐 상당한 이환율을 초래 흉터 조직의 eposition. 손상 후,이어서, 구조적 ECM 성분을 분비하는 세포 유형에 인접한 주변 분비 효과를 발휘하고, 흉터 조직 (6)을 증착하여 기계적 안정성을 복원 근섬유 아세포로의 전환이있다. 피부 조직에서 발달 시간에 걸쳐 감겨 수리의 품질 및 해부학 적 부위 사이에 상당한 변화가 존재한다. 인생의 첫 두 학기에 태아는 흉터없이 치유; 그러나,에 성인기에 걸쳐 세 번째 임신에서, 상처와 치유 인간. 사이트 별, 연령별 이외에, 상처 치유의 차이가 존재한다. 피부의 상처 흉터 조직 내의 증착 9 상당한 동안 구강에 상처, 최소 반흔 7,8으로 개조. 논쟁은 C를 지속연령 및 위치 10, 11 모두에 관해서 상처 치유의 결과를 로컬 섬유 아세포의 고유 특성에 비해 환경의 영향을 상대적 oncerning. 피부의 진피 및 이전 배아 (E15) 대 구강 마우스의 치료에 유의 한 차이를 감안할 대 이후 배아 (E18) 진피, 그것은 특정 발달 연령에 다양한 해부학 적 부위 중 섬유 아세포의 인구에 본질적인 차이가 존재하는 것 같다 . 1986 년 해롤드 F. 드보락은 종양이 12을 치유하지 않는 상처입니다 상정. 드보락은 종양이 신체의 상처처럼 동작하고 호스트의 응답 상처 치유를 활성화시킴으로써 그들의 기질을 유도한다는 결론을 내렸다. 많은 연구 이후 암 13-15의 진행에 섬유 아 세포의 기여를 조사하지만, 한 상처 치유, 정체성과 피부 캘리포니아의 기질 구획에 기여하는 섬유 아 세포의 배아 기원의 경우와 같이rcinomas 적절하게 정의되지 않았습니다. 이 질문에 대한 대답은 항암 치료 (16)에 대한 잠재적으로 효과적인 대상으로 종양 관련 섬유 아세포를 노출 최근의 연구 주어진 의료 관련을 맺는다. 식별 및 전향 생체 폐의 섬유 전위 부여 섬유 아세포 계통을 분리하는 것은 효과적으로 급성 및 만성 질환 상태의 넓은 범위에 걸쳐 손상에 대한 반응을 조작 향해 필수적인 단계이다. 1987 년 Cormack는 유두와 망상 진피 (17, 18) 내에서 하나의 내부에있는 섬유 아세포의 두 개체군, 하나를 보여 주었다. 세 번째 모집단은 여포 (19, 20)의 모유두 지역에서 모낭과 관련된 발견되었다. 때 배양, 성장 잠재력, 형태, 및 성장 인자 / 사이토 카인 이러한 섬유 아세포 아형 전시 차이는 21 ~ 24 프로필. 현재까지, 섬유 아세포를 조사 연구 그는terogeneity 크게 적절하게 생체 내에서 섬유 아세포 중 발달 및 기능 다양성의 특성을 실패했습니다. 이것은, 부분적으로, 배양 된 섬유 아세포의 집단에 의존하고, 모든 섬유 아세포 (25)에 의해 표현되는 자기 표면 수용체의 기초 하에서 세포 배양 또는 양성 선별의 균질화 효과의 결과이다. 우리의 실험실에서 최근의 연구는 깊은 표면 마커이 원고 (26)에 제시된 FACS 기반의 분리 방법에 의해 분리 대 교양 교양 섬유 아 세포에서 전사 변화를 보여 주었다. 그 후, 우리는 쥐의 등쪽 진피 내의 특정 섬유 아세포의 계보를 파악하고 Engrailed-1의 배아 식으로 정의이 계보는,, 등의 피부의 결합 조직 증착을위한 일차적 책임이 있다고 결정했다. 상처 치유, 암 기질 형성 등을 포함 섬유증의 급성 및 만성 형태 모두 동안의 계보 기능방사선 섬유증 (27)을 유도. 별개의 섬유 아세포 계통의 특성은 폐의 섬유 성 행동을 조절하기위한 치료를위한 중요한 의미를 가지고있다. 오히려 세포 격리 28, 29을 달성하기 위해 체외 조작에 의존하는 기존의 프로토콜을 사용하는 것보다, 여기에 설명 된 수확 프로토콜 (그림 1)보다 정확하게 생체 내에서 표현형과 동작을 캡처 섬유 아 세포의 수율 정보 분석을하는 데 도움이됩니다.

<table><tbody><tr><td>외과 겸자,</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650916</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위</td>, <td>Kent Scientific</td><td>INS600127</td><td></td></tr><tr><td>Povidone 요오드 준비 용액</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Nair (제모 크림)</td> <td>Church and Dwight Co.</td><td></td><td></td>22600267058</tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Abcam</td><td>ab95133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m 필터</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 필터</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>102421</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103125</td><td></td></tr><tr><td>Tie2</td><td>BioLegend</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>116233</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326)</td><td>eBioscience</td><td>48-5791</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 (PI viability stain)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr></tbody></table>

facs에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

 Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

섬유 아세포는 세포 외 기질을 분비에 대한 책임 원칙 세포의 유형과 여러 장기와 조직의 중요한 구성 요소입니다. 섬유 아세포의 생리와 병리 여러 기관에서 fibroses, 비후성 흉터 다음 화상, 허혈 다음 심장 기능 상실, 암 기질의 형성을 포함하여 임상 기관의 스펙트럼을 기초. 그러나, 섬유 아 세포는 크게 인해 고유의 이질성에, 셀의 잘못 특성화 유형 남아있다. 섬유 아 세포의 분리를위한 기존의 방법은 근본적으로 세포의 표현형과 행동에 영향을 미치는 세포 배양의 시간이 필요합니다. 따라서, 섬유 아세포 생물학을 연구 많은 연구는 체외 조작에 의존하고 정확하게 생체 내에서 섬유 아세포의 동작을 캡처하지 않습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 preservi함으로써, 세포 배양을 필요로하지 않는 성인 마우스의 등쪽 피부 섬유 아세포의 분리에 대한 FACS 기반 프로토콜을 개발생리적 전사 및 각 셀의 프로테옴 프로파일을 겨. 우리의 전략은 혈통 음의 게이트를 통해이 아닌 중간 엽 계통의 배제를 허용 (린 -)가 아니라 특정 표면 마커를 발현하는 섬유 아 세포의 하위 집단의 사전 선택 또는 농축을 방지하고이 이질적인에서 가능한 한 포함 될 수있는 긍정적 인 선택 전략을보다 세포 유형.

이 방법 (도 1)의 유효 기간은 27 일 최근의 간행물에 상세하게 검사 할 수있는 방법의 다수 확인되었다. 이러한 분류 세포 대량 세포와 갓 분류 세포의 단일 세포 전사 분석의 면역 세포를 포함한다. 섬유 아세포를 정렬 직접보다는 더 정확하게 문화에 의존하는 것은 자신의 생체 표현형을 캡처합니다. 오히려 긍정적 인 선택 방식보다 혈통 부정적인 고갈 방식 (그림 2A)를 사용하면 특정 하위 집단에 대한 사전 선택을 방지 할 수 있습니다. 이 접근법의 값은 최근 전술하지 진피의 수준에서 CD26 양성 섬유 아세포의 존재를 식별 Rinkevich 외. (27)에 의해 입증되었다. 섬유 아세포의 배양 과정은 유전자 발현에서 유의 한 변화를 유도하는지 확인하기 위해, 우리는 섬유 아세포에 교양 배양 섬유 아세포를 비교하는 마이크로 어레이를 이용했다. 우리는 섬유 아세포를 배양즉 두 가지 기술이 원고 및 공지 조직 이식편 프로토...

섬유아세포 행동은 다양한 임상 개체의 기초가 되지만, 주로 내재된 이질성으로 인해 특성화가 제대로 이루어지지 않은 상태로 남아 있습니다. 전통적인 섬유아세포 연구는 체외 조작, 생체 내 섬유아세포 거동 마스킹에 의존합니다. 세포 배양이 필요하지 않은 마우스 피부 섬유아세포의 분리를 위한 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 FACS를 사용하여 섬유아세포(fibroblasts)를 분리함으로써, 이러한 세포의 표현형 변화를 유발하는 것으로 알려진 in vitro 배양 과정을 생략하는 것입니다. 이 방법은 흉터 형성 및 섬유화에 관여하는 섬유아세포 아형을 식별하는 방법과 같이, 발생 생물학과 상처 치유 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 섬유아세포의 표현형과 유사한 플라스틱 부착 과정이 포함된 in vitro 실험을 피할 수 있다는 점입니다.이 방법은 진피 섬유아세포에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 복막 섬유아세포 및 복강 유착과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 먼저, 대상 마우스의 등 쪽 피부를 면도하고 제모하십시오. 그런 다음, 털을 제거한 마우스를 70% ethanol에 담근 후, 깨끗하고 멸균된 표면에 놓아 건조시킵니다.다음으로, 꼬리 기저부부터 시작하여 포셉으로 피부를 들어 올린 후 해부 가위로 횡절개합니다. 그런 다음 근막 상면을 따라 절개하여 등 쪽 조직을 채취합니다. 60 by 100 millimeter 크기의 피부 조각이 제거되면, 메스의 뭉툭한 면을 사용하여 피하 지방을 조심스럽게 제거합니다.그런 다음, 채취한 피부를 betadine으로 헹구고, 이어서 얼음 위에서 PBS로 5회 세척합니다. 면도날과 해부 가위를 사용하여 멸균 접시에서 진피 조각들을 샘플 크기가 약 2~3 mm로 균일해질 때까지 잘게 다집니다. 그 후, 최대 5마리 생쥐에서 얻은 조직 파편들을 dmem에 희석된 collagenase 4 20 mL가 들어 있는 적정 개수의 개별 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.시료를 37 °C에서 강하게 교반합니다. 1시간 후, 튜브를 무균 후드로 옮겨 조직 덩어리를 바늘 없는 10 mL 시린지로 3~5회 통과시킵니다. 시료를 다시 쉐이커에 넣고 30분 동안 더 교반한 다음, 10 mL 시린지로 다시 3~5회 피펫팅합니다.그 후, 샘플을 100 micron 거름망을 통해 새로운 50 milliliter 튜브에 여과하고, 총 부피가 40 milliliters가 되도록 FBS가 보충된 dmem 20 milliliters로 메쉬를 세척합니다. 다음으로, 세포를 원심 분리하고 멸균된 유리 피펫을 사용하여 상단의 지방층을 흡입하여 제거합니다. 오염된 지방 부위가 모두 제거되면, 새로운 유리 피펫을 사용하여 나머지 상층액을 제거하고 펠렛을 dmem 및 FBS 20 milliliters에 다시 현탁합니다.이제 75 micron 스트레이너로 세포를 여과하고 메쉬를 10 milliliters의 DMEM plus FBS로 헹굽니다. 그다음 세포를 다시 원심 분리하고, 방금 시연한 것과 같이 지방층과 상층액을 제거합니다. 펠릿을 20 milliliters의 FACS buffer에 재부유시키고, 무염색 대조군을 위해 5 milliliters의 분주액을 따로 떼어 놓습니다.그 다음, 남은 샘플을 원심 분리하여 상층액을 제거하고 펠릿을 얼음에 둡니다. FACS로 섬유아세포를 분리하려면, 얼음 위에서 500 microliters의 lineage 항체 배양 혼합액에 펠릿을 재현탁합니다. 20분 후, DNase가 첨가된 5 milliliters의 FACS 버퍼를 세포와 부드럽게 섞은 뒤 원심 분리합니다.펠렛을 5 mL의 DNase로 다시 한 번 세척하십시오. 그 다음, 세포를 500 µL의 FACS buffer와 DNase에 재부유시키고, 생존 염색제 대조군을 위해 세포 50 µL를 따로 분취하여 보관하십시오. 마지막으로, 남은 샘플에 생존 염색제를 첨가하고 다이어그램에 따라 세포를 분리하십시오.양성 선택 방식 대신 계통 음성 고갈(lineage negative depletion) 접근법을 사용하면 특정 하위 집단이 미리 선택되는 것을 방지할 수 있습니다. 풀 전사체 마이크로어레이(Pull transcriptome microarray) 분석 결과, 생체 수확 및 조직 외식편 방법으로 분리한 배양 섬유아세포는 전사체 전체 수준에서 피어슨 적률 상관계수가 0.92로 매우 높은 유사성을 보였습니다. 이에 비해, 배양된 섬유아세포는 생체 수확한 비배양 섬유아세포와 유의미한 차이를 보였으며, 이는 배양 섬유아세포보다 생체 수확 섬유아세포를 분석하는 것이 중요하다는 점을 입증합니다.이 기술의 개발 이후, 발달 생물학 및 상처 치유 분야의 연구자들은 섬유아세포의 이질성을 확인하고, 흉터 형성 및 기타 형태의 섬유증을 유발하는 하위 집단을 식별할 수 있는 기반을 마련하게 되었습니다.

murine-dermal-fibroblast-isolation-by-facs

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

이 비디오는 출생 후 새끼 쥐의 피부에서 멜라닌 세포와 섬유아세포를 동시에 분리하고 배양하는 빠른 방법을 설명합니다. 이러한 세포는 피부 세포 생물학, 상처 치유 및 흑색종을 연구하기 위해 체외에서 유지 및 조작할 수 있습니다.

1차 쥐 멜라닌 세포 및 섬유아세포의 빠른 배양: 전체 쥐 피부 샘플에서 멜라닌 세포 및 섬유아세포 분리

성체 줄기세포 생물학을 연구하기 위한 이상적인 모델은 쥐의 모낭입니다. 여기에서는 모낭, 줄기세포 및 표피 각질세포의 다양한 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시하며, 쥐 등쪽 피부의 효소 분해와 FACS 분석을 사용합니다.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

이 원고는 인간의 피부에서 유 두와 망상 섬유 아 세포를 분리 하기 위한 FACS 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이는 시험관 문화를 우회 하 고,이는 일반적으로 사용 되는 격리 프로토콜을 통해 명시적으로 불가피 한 것 이었습니다. 발산 된 섬유 아 세포 서브 세트는 기능적으로 구별 되 고 진 피 내에서 차별적 유전자 발현 및 국 소화를 표시 한다.

형광 활성 세포 선별에의 한 인간의 피부에서 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 분리

이 프로토콜은 0-4일 된 마우스의 피부로부터 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양을 동시에 생성하는 신속한 방법을 간략하게 설명한다. 이러한 1차 배양은 피부 세포 생물학, 색소 침착, 상처 치유 및 흑색종을 포함한 다양한 생리학적 관련 과정을 연구하기 위해 시험관 내에서 유지 및 조작될 수 있다.

1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성

우리는 초보자 (예를 들어, 학생)에 의해 수행 할 수있는 쉽고 빠르고 신뢰할 수있는 방법으로 기본 성인 섬유 아아세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 효소 조직 소화와 기계적 동요를 초음파와 결합하여 1 차 섬유 아아아를 얻습니다. 프로토콜은 특정 실험 요구 사항(예를 들어, 인간 조직)에 쉽게 적응될 수 있다.

초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

이 논문은 원발성, 환자 특이적 인간 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포의 분리 및 배양을 위한 explant 배양 기반 방법을 기술한다. 또한, 세포 수축 및 후속 분석을 측정하기위한 새로운 방법이 제시되며, 이는 이들 세포의 환자 별 차이를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

이 프로토콜은 노화 마우스 눈물선을 해리하여 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 생존 가능한 단일 세포를 얻는 최적화된 방법을 설명합니다. 순차적 효소 소화와 부드러운 취급은 세포의 무결성을 유지하여, 세포 유형 특이적 분리 및 노화 관련 눈물샘 변화의 전사체 분석에 적합한 고품질 현탁액을 생성합니다.

노령 눈물 및 침샘에서 단세포 해리, RNA 시퀀싱 및 노령 분수선에서 근상피세포 및 섬유아세포 분리 프로토콜

배우세요 쥐 피부 섬유 아세포를 FACS로 직접 격리하는 방법을. 체외 배양 없이 생리학적 표현형을 유지하여 상처 치유와 섬유증 연구에 활용할 수 있습니다.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

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