FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

이 절차의 전반적인 목표는 FACS를 사용하여 섬유아세포를 분리하여 이러한 세포에서 표현형 변화를 일으키는 것으로 밝혀진 체외 배양을 포기하는 것입니다. 이 방법은 흉터 및 섬유증과 관련된 섬유아세포 아형을 식별하는 방법과 같은 발달 생물학 및 상처 치유의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 섬유아세포의 표현형에 수컷인 플라스틱을 고수하기 때문에 시험관 내 실험을 피할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 피부 섬유아세포에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 복막 섬유아세포 및 복부 유착과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 관심 있는 마우스의 등쪽 피부를 면도하고 제모하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 탈핵된 쥐를 70% 에탄올에 담그고 동물을 깨끗하고 멸균된 표면에 놓아 건조시킵니다.

다음으로, 꼬리 밑부분부터 시작하여 집게를 사용하여 피부를 텐트로 덮고 해부 가위로 가로 절단을 합니다. 그런 다음 근막상 평면을 따라 절개하여 등쪽 조직을 채취합니다. 60 x 100mm 두께의 피부 조각을 제거했다면, 메스의 뭉툭한 모서리를 사용하여 조심스럽게 피하 지방을 제거한다.

그런 다음 수확한 피부를 베타딘으로 헹구고 얼음으로 PBS를 5회 씻습니다. 면도날과 해부 가위를 사용하여 샘플이 약 2-3mm 크기가 균일해질 때까지 멸균 접시에 진피 조각을 다집니다. 그런 다음, 최대 5개의 마우스에서 조직 조각을 dmem에 20ml의 콜라겐분해효소 4를 포함하는 적절한 수의 개별 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

섭씨 37도에서 샘플을 세게 교반합니다. 1시간 후, 튜브를 멸균 후드로 옮기고 불필요한 10ml 주사기를 통해 조직 플러스를 3-5회 통과시킵니다. 샘플을 다시 셰이커에 30분 동안 다시 넣은 다음 10ml 주사기로 3-5개의 피펫을 더 넣습니다.

그런 다음 100미크론 스트레이너를 통해 샘플을 새 50ml 튜브로 여과하고 FBS를 보충한 20ml의 dmem으로 메쉬를 세척하여 총 부피를 최대 40ml까지 가져옵니다. 다음으로, 세포를 스핀다운하고 멸균 유리 피펫을 사용하여 상부 지방층을 흡인합니다. 오염된 지방 부위가 제거되면 새 유리 피펫을 사용하여 나머지 상층액을 제거하고 펠릿을 20ml의 dmem과 FBS에 다시 현탁시킵니다.

이제 75미크론 스트레이너를 통해 세포를 여과하고 10ml의 dmem과 FBS로 메쉬를 헹굽니다. 그런 다음 세포를 다시 스핀 다운하고 방금 설명한 것처럼 지방과 상층액을 제거합니다. 펠릿을 20ml의 FACS 완충액에 재현탁시키고, 염색되지 않은 대조군을 위해 5mL의 부분 표본을 따로 둡니다.

그런 다음 나머지 샘플을 스핀다운하고 상등액을 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. FACS로 섬유아세포를 분리하려면 펠릿을 얼음 위에 500마이크로리터의 계통 항체 배양 혼합물에 재현탁시킵니다. 20분 후, DNase가 보충된 5ml의 FACS 완충액을 세포와 부드럽게 혼합하고 스핀다운합니다.

두 번째 5ml의 DNase로 펠릿을 세척합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 FACS 완충액과 DNase에 세포를 재현탁시키고 생존율 염료 제어를 위해 50마이크로리터의 세포 분취량을 예약합니다. 마지막으로 남은 샘플에 생존도 염료를 추가하고 다이어그램에 따라 세포를 정렬합니다.

긍정적 선택 접근법 대신 계통 부정적 고갈 접근법을 사용하면 특정 하위 모집단에 대한 사전 선택을 피할 수 있습니다. 풀 전사체 마이크로어레이 분석은 살아있는 수확 및 조직 이식 방법론에 의해 분리된 배양된 섬유아세포가 Pearson 제품-모멘트 상관 계수 0.92로 전사체 전체 수준에서 높은 수준의 유사성을 갖는 것으로 나타났습니다. 이에 비해 배양된 섬유아세포는 살아 있는 채취된 배양되지 않은 섬유아세포와 크게 달랐으며, 이는 배양된 섬유아세포보다 살아있는 채취된 섬유아세포를 분석하는 것의 중요성을 확립했습니다.

개발 후, 이 기술은 발달 생물학 및 상처 치유 분야의 연구자들이 섬유아세포의 이질성을 확인하고 흉터 및 기타 형태의 섬유증을 유발하는 하위 집단을 식별할 수 있는 길을 열었습니다.