Name: 의 측면 루트 유도 성 시스템 애기 장대과 옥수수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 학습하세요 측면 뿌리 유도 시스템을 사용하여 Arabidopsis thaliana와 옥수수에서 뿌리 발생을 동기적으로 연구하는 방법을. 이 체외 배양 기법은 세포학적 및 분자 수준에서 뿌리 발달 메커니즘을 규명하는 데 필수적인 도구입니다.

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저자는 기술 지원과 사진 촬영에 대해 Davy Opdenacker에게 감사를 표합니다. 원고를 개선하는 데 도움이 되는 제안을 해주신 Annick Bleys 박사님께 진심으로 감사드립니다. 이 작업은 벨기에 연방 과학 정책국의 Interuniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 'MARS', FWO 보조금 G027313N 및 과학기술혁신청(IR)의 재정 지원을 받았습니다.

1. 애기 장대 LRIS 프로토콜 참고 : 텍스트는 &quot;작은&quot;또는 &quot;큰&quot;규모의 실험을 의미한다. 이러한 마커 라인 분석 및 조직 학적 염색법 6, 14 등의 소규모 실험은 단지 몇 개의 샘플을 필요로한다. 이러한 정량적 실시간 QRT-PCR 마이크로 어레이 9-11 또는 RNA 시퀀싱 같은 대규모 실험은 샘플의 더 많은 양을 필요로한다. 따라서, 샘플 1000 모종이 Vanneste 등의 알에 의해 사용되었다 ~의. (11) 양이 루트 세그먼트 절개 후 마이크로 어레이 실험을 수행 할 수 있습니다. DAY 1 <ol><li> 애기 씨의 살균 참고 : 종자 살균을위한 다음 절차 중 하나를 선택합니다. 그들 중 임의의 프로토콜의 다음 단계에 적합하다. 가스 멸균 (1.1.2) 액체 살균 (1.1.1)을 통해 두 가지 장점을 제공합니다 : 큰 감각을 처리 할 때이 시간이 적게 걸립니다씨앗 어, 더 피펫 개별 샘플에 대한 발생이 없기 때문에, 및 소독 종자 장기간 저장 될 수있다. 그러나, 건조기 및 취급에주의가 필요합니다. <ol><li> 액체 살균 <ol><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 종자의 수를 붓는다. 2 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 1.5 ML 튜브에 20 mg의 (~ 800 씨앗) 또는 40 밀리그램 (~ 1600 씨앗)까지 사용할 수 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. 반전 또는 부드럽게 2 분 동안 흔들어. </li><li> 15 분 동안 1 ml의 살균 용액으로 70 % 에탄올을 교체합니다. (신선한 살균 솔루션 준비 : 3.85 ml의 차아 염소산 나트륨 (NaOCl에) 주식 (12 %) (주의 :이) 후드를 연기 5 μL 트윈 (20), 물 10 ㎖까지의 모든 씨앗이 올 있는지 확인하기 위해 튜브를 여러 번 전환. 용액과 접촉. </li><li> 반복하여 층류 공기 유동 캐비닛, 5 분 동안 종자 5 회 1ml의 멸균 증류수로 멸균 용액을 대체 린스LY 신선한 멸균 증류수 1 ㎖로 교체. </li></ol></li><li> 가스 멸균 <ol><li> 2 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 종자의 수를 붓는다. 여러 개의 독립적 인 라인 작업을 할 때 각각의 튜브를 사용하여, 그들을 플라스틱 마이크로 원심 분리기 튜브 상자 또는 홀더에 열 준비. 하나의 튜브에서 씨앗의 수가 500 (12.5 mg)을 초과하는 경우, 성공을 보장하기 위해 멸균 튜브의 적절한 수의 씨앗을 분할. 이웃 튜브의 캡은 서로를 가리지 않도록해야합니다. 이 살균뿐만 아니라 건조기에 있어야 같이, 하단 박스의 덮개를 함께 장착한다. </li><li> 유리 비커와 함께, 데시 케이 터의 그릇에 상자를 놓고 (주의 :이 후드를 연기). </li><li> (: 사용 흄 후드주의) 12 %의 NaOCl 100 mL로 비커를 입력합니다. 데시 케이 터에 뚜껑을하는 듯했으나 비이커 저장하는 작은 구멍을 둡니다. </li><li> (CAU을 37 % 염산 (발연)의 3 ML을 추가TION : 사용은 작은 구멍을 통해 비커에 후드를) 연기 빠르게 건조기를 닫습니다. CL 2 - 가스 형성으로 인해 약간의 시간에 대한 솔루션 의지 거품. 시스템을 남기기는 O / N (또는 적어도 8 시간)을 마감했다. </li><li> 데시 케이 터의 뚜껑을 제거합니다. 상자를 꺼내 운송 중에 오염을 방지하기 위해 뚜껑을 커버한다. </li><li> , 층류 공기 흐름 캐비닛에 상자를 넣어 뚜껑을 제거하고 가스 방출을 허용하도록 실온에서 약 1 시간 동안 씨앗을 둡니다. 참고 : 씨앗 안전하게 4 ° C에서 최대 2 주 동안 폐쇄 마이크로 원심 분리기 튜브에 건조를 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 애기 장대에서 측면 루트 유도 <ol><li> 측면 루트 억제 (NPA 처리) <ol><li> 체외 성장을위한 성장 매체를 준비합니다. 배지는 무라 시게 및 반 강도 스쿡 염 혼합물 (15), 0.1 g / 리터 미오 - 이노시톨, 10g / L 수 크로스를 포함하고 0.5로 버퍼링G / L 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 산 (MES). </li><li> 1 M KOH와 5.7 pH를 조정합니다. 식물 조직 한천 8g / L를 첨가하고 121 ℃에서 20 분 동안 오토 클레이브 매체. </li><li> 디메틸 설폭 시드 (DMSO) (: 장갑을 사용주의) NPA의 25 mM의 주식 솔루션을 준비합니다. 층류 공기 유동 캐비닛 (병을 손에 유지 될 수있는 온도이다) 약 65 ° C까지 멸균 배지를 냉각하고, 10 μM NPA의 최종 농도를 얻기 위해 25 mM의 NPA 스톡 용액을 첨가. </li><li> 부드럽게 10 초 동안 병을 흔들어 또한에 균질화. 사각형 페트리 접시 당 배지 50 ㎖ (12cm X 12cm)를 따르십시오. 주 : 대규모 실험의 경우, 환경 전송을 보장하기 위해 나일론 메쉬 (20 ㎛의)을 적용한다. 고압 증기 멸균 (그림 1A)를위한 메쉬 (9cm X 9cm)를 준비합니다. 멸균되면 무균 핀셋 (도 1b)을 사용하여 성장 배지에 메쉬를 적용한다. 부드럽게 인트를 사용하여 성장 배지에 메쉬를 밀어(: 무균 조건에서 작업주의)는 성장 매체 (그림 1B)와 잘 접촉되어 있는지 확인 drigalsky을 rilized. </li><li> NPA-접시에 씨앗을 뿌리고. , 경우 대규모 실험이 계획되어있다 (1.2.2.3 참조) 샘플링을 용이하게하기 위해 (50) 씨의 2 조밀하고 잘 정렬 된 행을 뿌리 참고. <ol><li> 액체 살균 경우, 200 μL 피펫을 사용하여 NPA-접시에 씨앗을 뿌리다. 3 잘라 - 위해 멸균 조건 (또는 팁 멸균 전)에 피펫 팁의 끝 4 MM은 씨앗을 피펫 할 수 있습니다. 피펫 위로 씨앗을 다시 중단 할 몇 번 다운 후 10 약 150 μL 멸균 물을 피펫 - (20) 씨와 팁의 맨 아래에있는 씨앗 침전물 때까지 기다립니다. (주의 : 무균 조건에 대한 작업) 참고 : 끝으로 부드럽게 한천 또는 메쉬를 터치하면, 씨앗과 물 한 방울은 그것 (그림 1C)에서 발표 될 예정이다. </li> &lt;가스 멸균 경우 리&gt;, 접착 표면을 보장하기 위해 씨앗을 복용하기 전에 멸균 toothpicks.Pinch에게 한천에 이쑤시개를 이용하여 씨앗을 뿌리다. 이쑤시개를 사용하여 하나 씨앗 하나를 들고 플레이트 (그림 1D)에 씨앗을 배포 할 수 있습니다. (: 무균 조건에서 작업주의) 또는 씨앗에 멸균 물을 추가하고 1.2.1.5.1에​​ 기술 된 바와 같이 뿌리다. </li></ol></li><li> 통기성 접착 테이프로 번호판을 봉인하고 최소 2 일 최대 일주일 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 그들에게 접시를 저장합니다. 이것은 계층화 동기화 보장하고보다 효율적인 발아 필요하다. 주 : 대안 적으로, 종자는 파종 전에 성층 적은 냉장고 공간을 필요 마이크로 원심 분리기 튜브, 증류수에 침지 될 수있다. 이 경우, 4 ° C에서 적어도 하나의 주 튜브를 저장하고, 즉시 (1.2.1.7 참조​​) 파종 후 생장 캐비닛 판을 이동. 3 일 </리&gt; <li> 성장 캐비닛에 판을 이동 (연속 빛 (110 μE 분 -2 S-1), 21 ° C를) 거의 수직 위치에 오일 (발아 2 일 및 성장 3 일)에 대한 (80-90 °) 매체의 루트에 성장하지를 보장합니다. 8 일 </li></ol></li><li> 측면 루트 유도 (NAA 처리) <ol><li> 1.2.1.1 및 1.2.1.2에 기재된 것과 같은 성장 배지를 준비한다. (: 장갑을 사용주의) DMSO에서 NAA의 50 mM의 주식 솔루션을 준비합니다. 아래로 65​​ ° C로 멸균 매체 쿨 10 μm의 NAA의 최종 농도 얻기 위해 매체에 NAA 솔루션을 추가 (주의 : 무균 조건에서 작업을). <ol><li> 부드럽게 10 초 동안 병을 흔들어 또한에 균질화. 사각형 페트리 접시 당 배지 50 ㎖ (12cm X 12cm)를 따르십시오. </li></ol></li><li> 그 SUP 10 μM NPA 보충 된 성장 배지를 함유하는 플레이트로부터 모종을 전송할10 μm의 NAA와 plemented. <ol><li> 모종의 자엽에서 곡선 핀셋의 팔을 걸고 부드럽게 판에서 제거합니다. 만 뿌리가 완전히 바람직 아래로 NPA 성장 매체와 접촉 성장하는 모종을 전송합니다. </li><li> 작은 거리에 걸쳐 NAA 함유 증식 배지 표면 위에 뿌리 탈지. 식물 뿌리가 성장 매체와 잘 접촉되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 핀셋 성장 배지 표면에 부드럽게 루트를 누른다. 주 : 대규모 실험의 경우, 핀셋 개의 상부 모서리에서 메쉬를 올려 메쉬와 전사와 접촉하지 않는 모든 묘목을 제거한다. 확인 메시는 작은 거리 (그림 1E)를 통해 한천 표면에 메쉬를 감추고하여 NAA 함유 매체와 좋은 접촉합니다. </li></ol></li><li> 통기성 테이프로 새 판을 밀봉 (성장 캐비닛에 콘을 배치연속적인 빛 샘플링까지 유도 후 원하는 시간에 대한 수직 위치 (110 μE 분 -2 S-1), 21 ° C를). 주 : 대규모 실험의 경우, 메시 한꺼번에 직접 루트 세그먼트를 잘라내어 부드럽게 메쉬의 표면을 긁어 그들을 샘플 메스를 사용한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. LRIS 옥수수 프로토콜 <ol><li> 옥수수 커널의 계층화 <ol><li> 최소 1 주일 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 옥수수 커널을 품어. 주 :이 프로토콜은 B73 옥수수 근친 라인을 사용하여 개발되어왔다. </li></ol></li><li> 옥수수 커널의 살균 DAY 1 주 : 옥수수 묘목 멸균 조건에서 재배 할 필요는 없지만, 그것은 종이 롤 곰팡이 성장을 방지하는 옥수수 커널을 살균 및 멸균 재료와 함께 작동하도록 권장체계. <ol><li> 멸균 유리 비커에 옥수수 커널의 필요한 번호를 넣습니다. </li><li> (물에 6 %의 NaOCl) 살균 용액 (: 사용 흄 후드주의) 100 ㎖를 추가합니다. </li><li> 자기 교반 막대를 추가하고 5 분 동안 실온에서 낮은 교반 속도 (약 250 RPM)에서 자석 교반기에 비커를 놓습니다. </li><li> 신선한 멸균 물 100ml와 솔루션을 대체하여 5 분 동안 다섯 번 씻어. </li></ol></li><li> 옥수수 커널 파종 <ol><li> 오염의 위험을 감소시키고, 종이 타올의 롤을하기 위해 장갑을 착용 할 것. </li><li> 두 장 (약 92cm X 24cm)의 총 길이와 손 타월 용지 두 뻗어을 눈물과 깨끗한 표면 (그림 2A)에 서로의 상단에 배치합니다. </li><li> 시트 길이 (약 92cm X 12cm) (그림 2A)를 통해 두 번 접습니다. </li><li> T를 통해 상단에서 약 2cm에서 10 커널을 배포하는 핀셋을 사용하여그는 용지의 전체 길이, 양쪽 끝 (그림 2B)에서 무료로 각각의 커널과 8cm 사이 8cm의 공간을 유지하면서. 커널의 잔뿌리가 아래로 용지 (그림 2B)를 향하도록되어 있는지 확인합니다. </li><li> 씨앗 장소에서 (그림 2B)를 유지하면서 부드럽게, 길이에 걸쳐 용지를 굴립니다. 압연을 용이하게하기 위해, 먼저 무균 물 종이 스프레이 선택적이다. </li><li> 약 6cm 직경 14cm 높이 (예를 들어, 250 ML의 원심 분리기 튜브)의 멸균 유리 튜브의 용지 롤을 넣고 랙 (그림 2C)에 배치합니다. </li></ol></li><li> 옥수수의 측면 루트 유도 <ol><li> (DMSO에 용해) 50 mM의 NPA 주식 솔루션 (: 장갑을 사용주의)를 준비합니다. </li><li> 각 튜브를 들어, 멸균 유리 비이커에 125 ㎖의 멸균 수에 50 mM의 NPA 스톡 용액 125 μL를 첨가하여 50 μM NPA 용액을 만든다. </li><li> 잘 믹스튜브에서 롤 페이퍼 위에 50 μM NPA 용액 125 ㎖에 붓는다. 종이 롤 용액을 흡수하여 완전히 침지 될 것이다. 참고 : 다른 크기 용지 롤 및 튜브를 사용하는 경우, 그에 따라 볼륨을 조정합니다. 액체는 충분한 흡수를 보장하기 위해 중간 관에 도달한다. </li><li> 삼일 (27 ° C, 연속 빛, 70 % 상대 습도)에 대한 성장 캐비닛에 용지 롤 시스템을 놓습니다. 이 솔루션은 시간 (그림 2D)를 통해 증발하기 때문에 용지 롤이 추가로 50 μm의 NPA 솔루션을 추가하여 젖은 상태로 있는지 확인합니다. 4 일 </li><li> (DMSO에 용해)의 50 mM NAA 주식 솔루션 (: 장갑을 사용주의)를 준비합니다. </li><li> 각 튜브를 들어, 멸균 유리 비이커에 125 ㎖의 멸균 수에 50 mM의 스톡 NAA 125 μL를 첨가하여 50 μM의 NAA 용액을 제조 하였다. </li><li> 조심스럽게 종이 롤에 남아있는 NPA 솔루션의 대부분을 짜내 및 배치5 분 동안 멸균 M은 (: 장갑을 사용주의)을 씻어. 조심스럽게 종이 롤에서 대부분의 물을 짜내. 이 세척 단계를 세 번 반복합니다. </li><li> 잘 믹스와 튜브의 용지 롤을 통해 50 μM의 NAA 솔루션을 붓는다. 그들이 완전히 담가되어 있는지 확인합니다. </li><li> 유도 후 원하는 기간 동안 성장 캐비닛 (27 ° C, 연속 빛, 70 % 상대 습도)에 용지 롤 시스템을 놓습니다. </li></ol></li><li> 옥수수의 외래성 크라운 뿌리에 측면 루트 유도 참고 : LRIS를 기본 루트에 측면 뿌리를 유도하는 상술 한 바와 같이. 그러나, 옥수수와 함께 그들의 측면 뿌리와 다른 외떡잎, 기본 루트와 배아 정액 뿌리에서, 개발 모종 동안 주로 중요하다. 식물 성장의 후기 단계에서, 포스트는 부정근 배아 줄기에 발생하고 또한 새로운 루트 시스템 (16)을 형성하는 측면 뿌리를 개발한다. LRIS도 사용 될 수 있습니다d는 배아 기본 루트에 LRIS에 약간의 조정에 따라이 후 배아 우발적 인 크라운 뿌리에 측면 뿌리를 유도한다. <ol><li> 용지 롤을하려면, 외부 측면에 손 타월 종이 각각 두 개의 층, 및 내 발아 용지 두 레이어 논문의 샌드위치를​​ 만들 수 있습니다. 발아 용지의 두 시트 사이에 살균 커널 (단계 2.2 2.1 참조) 놓습니다. 발아 용지, 핸드 타올 용지에 비해 용지의 개방 나중에 쉽게 롤 만들 것입니다 루트 머리와 측면 뿌리에 의해 침투 될 경향이 덜 될 것입니다. 한편, 핸드 타월 용지 두 외부 층은 액체의 흡수를 촉진 할 것이다. </li><li> 700 mL 유리 튜브에 롤을 삽입하고 그들을 경찰청없이 멸균 물을 부어. 그들이 완전히 담가되어 있는지 확인합니다. </li><li> 성장 캐비닛의 살균 커널 발아 (단계 2.4.9 참조). </li><li> 우발적 인 크라운 뿌리까지 모종을 성장(B73 6 일간) 등장하기 시작합니다. 용지 롤이 필요한 경우 멸균 물을 추가하여 항상 젖은 유지되어 있는지 확인합니다. </li><li> 세척 단계 후 50 μM의 NAA 솔루션 경찰청 솔루션을 대체하여 측면 루트 개시 유사한 유도 다음 사일 (단계 2.4.4에 2.4.1 참조) 25 μm의 NPA 용액에 전송한다 (단계 2.4 참조 2.4.9에 .5). </li></ol></li></ol>

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애기 LRIS 프로토콜에서, 오직 완전히 NPA 함유 증식 배지와 접촉 성장한 묘목을 전송하는 것이 중요하다. 이 측면 루트 개시는 전체 루트 길이에 걸쳐 차단되는 것을 보장한다. 전송 중에 묘목 부상 방지하기 위해, 만곡 된 포셉 팔 종묘의 자엽 하에서 후크 될 수있다. 전송시, 묘목의 뿌리가 NAA 함유 한천 배지와 충분한 접촉에 있는지 확인하십시오. 이것은 작은 거리에 걸쳐 한천 표면에 뿌리를 감추고에 의해 달성 될 수있다. 이것은 전체 루트 길이에 걸쳐 횡 루트 개시의 효율적인 동기화되도록 유도한다. 뿌리는 부정적인 측면과 성장 루트 유도에 영향을주지 않고 노광 성장 될 수있다. 옥수수 LRIS 프로토콜에서는 커널 잔뿌리 D가 증가 할 루트를 보장하기 위해 아래로 용지를 향해 대면하는 것이 중요ownwards 올바른 측 16 용지에 부착합니다. NPA 처리의 삼일 후, 모종은 작은 촬영, 기본 루트와 정액 뿌리 (16)</s...

이 토양에서 앵커리지 및 물 섭취와 영양분을 보장 이후 루트 시스템은 식물 성장에 중요하다. 루트 시스템의 팽창은 주로 측면 뿌리의 생산에 사용하기 때문에, 그 개시 및 형성은 널리 연구되고있다. 측면 뿌리는 설립자 세포 1이라고 pericycle 세포의 특정 부분 집합으로 시작됩니다. 옥수수와 같은 외떡잎에, 그들은 사부 극 3에서 발견되는 반면, 같은 애기 장대와 같은 대부분의 dicots, 이러한 세포, protoxylem 기둥 2에 있습니다. 설립자 세포는 특정 세포주기 유전자의 발현에 이어 증가 옥신 반응 (4)에 의해 표시된다 (예를 들어, 사이클린 B1 1 / CYCB1는 1), 그 후 그들이 비대칭 배사 부문 (5)의 첫 번째 라운드를 겪는다. 조정 배사와 periclinal 부문의 일련의 후 측면 루트 primordium 최종적으로 부상 할 것으로 형성된다utonomous 측면 루트. 이러한 이벤트가 풍부한이나 동기화도 있기 때문에 위치 및 측면 루트 개시 타이밍은, 그러나 예측하지 않습니다. 여기에는이 과정을 연구하기 transcriptomics 분자 접근법의 사용을 방해한다. 이를 해결하기 위해, 횡 루트 유도 성 시스템 (LRIS)는, 6 개발되었다 (7).이 시스템에서는, 묘 먼저 따라서 횡 루트 개시를 막고, 옥신 전송 및 축적을 억제하는 N -1- naphthylphthalamic 산 (NPA)로 처리 8. 이어서 합성 옥신 -1- 나프탈렌 초산 (NAA)를 함유하는 배지에 종묘를 전송함으로써, 전체 pericycle 층함으로써 대규모 고가 옥신 레벨 유도부 횡 루트 개시 세포 분열 (6)에 응답한다. 이와 같이,이 시스템은 후반의 특정 스테이지에 대해 농후 루트 샘플의 수집을 용이하게, 고속 동기 및 광범위한 측면 뿌리 시작 (initiation)에 이르게RAL 루트 개발. 이어서, 이들 샘플은 횡 루트 형성 동안 게놈 전체의 발현 프로필을 결정하기 위해 사용될 수있다. LRIS 다른 식물 종에이 시스템을 적용하는 측면 루트 애기 장대의 시작과 옥수수 9-13,하지만 필요에 대해 이미 상당한 지식을 나왔고 더 게놈 서열대로보다 명확하게하고 경제적 중요한에게 지식을 전달하는 관심이 높아지고있다 종. 여기, 애기 장대와 옥수수 LRISs의 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 다음, 시스템의 사용의 예는 옥수수 LRIS 얻은 transcriptomics 데이터가 다른 식물 종에 걸쳐 횡 루트 개시 동안 보존 된 기능을 가질 기능적 동족체를 식별하기 위해 사용할 수있는 방법을 예시하여 제공된다. 다른 종의 식물이 제안에 대해 마지막으로, 지침 LRIS을 최적화합니다.

<table><tbody><tr><td>ARABIDOPSIS LRIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seeds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis seeds</td><td></td><td></td><td>Col-0 ecotype</td></tr><tr><td>Gas sterilization of seeds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 1.5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock micro-centrifuge tubes</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu</td></tr><tr><td>유리 건조제</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>파이렉스</td></tr><tr><td>유리 비커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 마이크로 원심분리기 튜브 상자 또는 홀더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>표백제 종자 살균</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>에탄올, abs. 100% a.r. 70%</td></tr><tr><td>로 희석차아염소산나트륨(NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>멸균수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>성장매체</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige 및 Skoog 염 혼합물</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>미오 이노시톨</td><td>시그마 알드리치</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 술폰산 (MES)</td> <td>DUCHEFA Biochemie BV</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-설탕 Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td>분석용 1050211000 펠릿(최대 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>식물 조직 배양 Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>Lateral Root Induction Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie BV</td><td>번호 N0926.0250</td><td>10 &마이크로; M (애기장대)</td></tr><tr><td>1-나프탈렌 아세트산 (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>번호 N0903.0050</td><td>10 &마이크로; M (애기장대)</td></tr> <tr><td>디메틸 설폭 사이드 (DMSO)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td> 전사 용 메쉬 만들기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylon 메쉬</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>합성 나일론 메쉬 20 &micro; m</td></tr><tr><td>파종 및 묘목 처리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>square 페트리 접시</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml DURAN 튜브</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>CLS430304 Corning&nbsp; 50 ml 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>컷 피펫 팁</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, 고압클레이브 전 팁 5mm 절단</td></tr><tr><td>통기성 테이프&nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>카탈로그 번호 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont 핀셋 유형 a nr 5; Dumont 핀셋 유형 e nr 7</td></tr><tr><td><강한>성장 조건</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>성장실</td> 21 &<td></td><td></td><td>deg; C, 연속 빛</td></tr> <tr><td>< 강한 > 재료 < / 강한 ></td> <td>< 강한 > 회사 < / 강한 ></td> <td>< 강한 > 카탈로그 </td> <td> Comments </td></tr> <tr><td> MAIZE LRIS </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td> 씨앗 </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>옥수수 커널</td><td></td><td></td><td>B-73</td></tr><tr><td>Bleach 커널 살균</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass 비커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자석 교반기&nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨(NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>멸균수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강한>측면뿌리 유도 화학 물질</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-나프틸프탈람산(NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie BV</td><td>번호 N0926.0250</td><td>50 &마이크로; M (옥수수 1 차 뿌리), 25 &micro; M (옥수수 외래 뿌리)</td></tr> <tr><td>1- 나프탈렌 아세트산 (NAA)</td> <td>DUCHEFA Biochemie BV</td><td>번호 N0903.0050</td><td>50 &마이크로; M (옥수수)</td></tr> <tr><td>디메틸 설폭 사이드 (DMSO)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>파종 및 묘목 처리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>종이 핸드 타월</td><td>Kimberly-Clark Professional *</td> <td>6681</td><td>SCOTT 핸드 타월 - 롤 / 화이트; 시트 크기 (24 x 46 cm)</td></tr> <tr><td>종자 발아 종이</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38 # 종자 발아 종이</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont 핀셋 유형 a nr 5; Dumont 핀셋 유형 e nr 7</td></tr><tr><td>250 ml (원심분리기) 튜브</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>약 5.6 cm 지름과 14.7 cm 높이&nbsp;</td></tr><tr><td>700 ml 튜브</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>실린더, 라운드 풋 튜브, D 60&nbsp; x 250</td></tr><tr><td>랙</td><td></td><td></td><td>, 옥수수 튜브용, 집에서 만든</td></tr><tr><td>멸균수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>성장 조건</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>성장 캐비닛</td><td></td><td></td><td>27 &deg; C, 연속광, 70% 상대 습도</td></tr></tbody></table>

의 측면 루트 유도 성 시스템<em&gt; 애기 장대</em&gt;과 옥수수

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

측면 뿌리 발달은 뿌리 시스템에 크게 기여하므로 식물 성장에 중요합니다. 그러나 측면 뿌리 시작에 대한 연구는 뿌리 내부의 소수의 세포에서만 예측할 수 없는 방식으로 발생하기 때문에 지루합니다. 이 문제를 피하기 위해 LRIS(Lateral Root Inducible System)가 개발되었습니다. 옥신 수송 억제제와 합성 옥신으로 묘목을 연속적으로 처리함으로써 1차 뿌리에서 고도로 제어된 측면 뿌리 시작이 동시에 발생하여 원하는 발달 단계의 풍부한 샘플링을 가능하게 합니다. LRIS는 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 위해 처음 개발되었지만, 다른 식물에도 적용할 수 있습니다. 따라서 옥수수 (Zea mays)에 사용하도록 조정되었습니다. 두 공장에서 LRIS의 여러 단계에 대한 자세한 개요가 제공됩니다. 이 시스템과 비교 전사체학의 조합으로 CYCLIN B1에 대해 여기에 설명된 바와 같이 다른 종에서 애기장대 측면 뿌리 개시 유전자의 기능적 상동체를 식별할 수 있었습니다. 1 (CYCB1; 1) 옥수수의 세포주기 유전자. 마지막으로, 다른 식물 종을 위해 LRIS를 개발할 때 고려해야 할 원칙에 대해 논의합니다.

LRIS의 응용 프로그램 측면 루트 개시 과정의 비교 Transcriptomics를 수행하는 LRIS의 하나의 응용은 다른 종에서 횡 루트 형성시와 비교하여 유전자 발현 양상의 상관 관계이다. 비교 transcriptomics는 다른 종의 측면 루트 개발 과정에 참여 orthologous 유전자를 찾아 낼 수있는 가능성을 만들어 접근한다. 이미 형성된 루트 축에 포함 된 셀의 서브 세트로부터 새로운 장기의 형성으로 구성되어 측면 루트 개시는 그들의 뿌리 구조를 제어 할 속씨 공유 주요 메커니즘이다. 결과적으로,이 공통 조상에서 본 기존 경로로부터 진화 및 진화에 걸쳐 보존 된 가능성이 높다. 실제로, 측면 루트 개시의 일반적인 잠재적 규​​제는 다른 종에서 발견 된 &lt;SUP&gt; 17, 18. <p class="jo...

LRIS(Lateral Root Inducible System)는 측근의 동기 유도를 허용하며 Arabidopsis, thaliana 및 maize에 대해 제공됩니다.

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

측근 유도 시스템의 전반적인 목표는 호르몬 처리를 통해 식물의 측근 개시를 동시다발적으로 유도하는 것입니다. 식물의 뿌리는 숨겨져 있어 연구하기가 매우 어려운 것으로 알려져 있습니다. 본 연구진은 세포학적, 조직학적 및 분자 수준에서 측근 개시 과정을 연구할 수 있는 인 비트로(in vitro) 시스템을 개발하였습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 식물이 배지와 적절하게 접촉하며 자라지 않아 측근이 균일하게 유도되지 않는 문제로 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 균일한 유도를 보장하기 위해 고려해야 할 핵심 단계들을 보여주는 데 도움이 됩니다. 이 시스템은 원래 작은 식물인 Arabidopsis에서 개발되었으나, 옥수수, 벼 또는 보리와 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다.먼저, 멸균 핀셋을 사용하여 20-micron 나일론 메쉬를 NPA가 첨가된 배지에 배치합니다. 드리가리스(drigalski)를 사용하여 메쉬를 배지 위로 가볍게 눌러 배지와 잘 밀착되도록 합니다. 그다음, 멸균 이쑤시개를 한천(agar)에 살짝 찍어 이쑤시개 표면에 끈적한 표면을 만듭니다.이쑤시개를 사용하여 가스 멸균된 종자 묶음을 준비된 플레이트에 고르게 분산시킵니다. 플레이트를 통기성 접착 테이프로 밀봉하고 4°C 암실에서 최소 2일에서 최대 1주일 동안 보관합니다. 이는 층적 처리를 위해 필요하며, 동기화된 효율적인 발아를 보장합니다.3일째 되는 날, 플레이트를 배양실로 옮겨 2일간 발아시킨 후, 80~90도 각도로 세워 3일 동안 성장시킵니다. 8일째에 메쉬에 완전히 밀착하여 자란 뿌리와 반대로 메쉬에 밀착되지 않은 뿌리를 식별합니다. 뿌리가 메쉬에 밀착되지 않은 모든 유묘를 제거합니다.묘소가 포함된 메쉬를 10 micromolar NAA가 첨가된 플레이트로 옮깁니다. 플레이트에 올린 후, 메쉬가 배양 배지와 잘 접촉되도록 필요에 따라 배지 표면 위에서 메쉬를 가볍게 훑어줍니다. 모든 묘소에서 균일한 유도를 보장하기 위해, NPA 첨가 배지에서 메쉬에 접촉하며 자라지 않은 묘소들은 폐기하고, NAA 첨가 배지에서는 필요 시 메쉬를 적절히 훑어주는 것이 중요합니다.새 플레이트를 통기성 테이프로 밀봉하고, 유도 후 원하는 시간 동안 생장실 내에 수직으로 세워 둡니다. 샘플을 수집할 준비가 되면, 메스로 메쉬 위에서 뿌리 세그먼트를 한꺼번에 절단하고 메쉬 표면을 부드럽게 긁어 샘플을 채취합니다. 이제 옥수수의 측근 유도 시스템의 일부 단계를 보여드리겠습니다.필요한 수의 옥수수 알갱이를 멸균된 유리 비커에 넣어 옥수수 알갱이의 멸균을 시작합니다. 그다음, 비커에 6% 차아염소산나트륨 수용액 100 milliliters를 넣고 마그네틱 바를 추가합니다. 비커를 마그네틱 교반기 위에 올리고 상온에서 5분 동안 저속으로 교반합니다.표백액을 조심스럽게 제거합니다. 100 milliliters의 신선한 멸균수로 교체하여 종자를 5분 동안 헹굽니다. 이 단계를 5회 반복합니다.장갑을 착용하고 핸드 페이퍼 타월 두 장을 뜯어 깨끗한 표면 위에 겹쳐 놓습니다. 그 다음, 종이를 길이 방향으로 반으로 접습니다. 핀셋을 사용하여 상단에서 약 2cm 떨어진 지점부터 종이 전체 길이에 걸쳐 커널 10개를 배치하되, 각 커널 사이의 간격을 8cm로 유지하고 양 끝단에 8cm의 여유 공간을 둡니다.배아의 뿌리 부분이 아래를 향하고 종이 쪽을 향하게 하십시오. 씨앗이 제자리에 있도록 유지하면서 종이를 길이 방향으로 조심스럽게 마십시오. 필요한 경우, 종이에 멸균수를 분무하면 이 과정을 더 쉽게 진행할 수 있습니다.롤을 멸균된 유리 튜브에 넣고 추가 튜브들을 랙에 결합합니다. 50 micromolar NPA 용액 125 milliliters를 튜브 내의 종이 롤 위에 붓습니다. 종이 롤이 용액을 흡수하여 완전히 젖게 됩니다.종이 롤 시스템을 배양기(growth cabinet)에 3일 동안 둡니다. 배양 기간 동안 종이 롤이 젖은 상태를 유지하도록 필요에 따라 NPA 용액을 추가하십시오. 측근 개시의 균일한 유도를 위해 종이 롤이 NPA 용액으로 계속 적셔져 있어야 하지만, 뿌리가 액체 자체에 잠기지 않도록 확인하는 것이 중요합니다.NPA 처리 3일 후, 옥수수 묘는 작은 줄기와 약 2~3cm 길이의 뿌리를 가집니다. 4일째 되는 날, 페이퍼 롤에서 남아 있는 NPA 용액의 대부분을 부드럽게 짜내고, 롤이 충분히 젖을 때까지 멸균수에 담가 둡니다. 약 5분 후, 페이퍼 롤에서 물의 대부분을 부드럽게 짜냅니다.세척 단계를 3회 반복합니다. 마지막 헹굼 후, 물기를 최대한 짜내고 다시 튜브에 넣습니다. 종이 롤이 완전히 젖을 때까지 50 µM NAA 용액을 튜브 안의 종이 롤 위에 붓습니다.그 후, 유도 후 원하는 시간 동안 페이퍼 롤 시스템을 배양기로 옮깁니다. NAA에서 배양되지 않았거나 NAA에서 1시간 동안 배양된 oxen 반응 마커 라인 pDR5-GUS 유묘와 비교했을 때, NAA에서 2시간 동안 배양된 유묘는 측근 개시를 유발하는 초기 사건 중 하나인 oxen 반응을 나타냅니다. 이러한 분열은 약 2시간 후부터 팁에서부터 위쪽으로 이동하기 시작하며, NAA에 노출되는 시간이 길어질수록 증가합니다.세포 주기 마커 라인인 pCYCB1;1-Gus를 사용하면, NAA 처리 시작 후 약 6시간부터 측근 형성을 유도하는 첫 번째 세포 분열을 관찰할 수 있습니다. 마이크로어레이와 정량적 rt-PCR을 이용하여 측근 유도 과정 중 애기장대와 옥수수 뿌리의 다양한 영역에서 여러 유전자의 발현을 평가할 수 있습니다. 애기장대와 옥수수 모두에서 식물이 더 오랜 시간 성장하면, 유도된 분열을 통해 측근의 발달과 성장이 일어납니다.옥수수를 이용한 이 시스템의 개념 증명으로서, 비교를 위해 서로 다른 조건에서 성장시킨 묘들을 준비하였습니다. 물에서 10일 동안 성장시킨 묘는 측근이 동시다발적으로 발생하지 않았으며 축을 따라 넓게 간격을 두고 배치되어 있습니다. NPA에서 10일 동안 성장시킨 묘에는 측근이 전혀 형성되지 않았습니다.NPA에서 3일 동안 성장시킨 후 NAA 처리를 한 유묘는 측근의 대규모 및 동기화된 유도를 보여줍니다. 이 영상에서는 뿌리 분기 과정에 대한 근본적인 새로운 통찰력을 발견하는 데 매우 필수적인 것으로 밝혀진 측근 유도 시스템을 구축하는 방법을 보여드렸습니다. 우리는 이것이 Arabidopsis와 옥수수에서 어떻게 작동하는지 보여주었으나, 이는 선택한 다른 식물 종에도 쉽게 적용될 수 있습니다.행운을 빕니다.

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Biology

생물학

우리는 애기 장대 씨앗에서 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA)를 조립하는 절차를 제시한다. SCBA는 유전자와 체외에서 탐색 할 수있는 강력한 도구가 될 수 있도록 표시 방식 휴면 종자의 빛 신호에 대한 응답으로 배유 컨트롤 종자 발아. SCBA는 배유가 배아의 성장에 영향을 미칠 것으로 의심되는 모든 상황에서 적용 할 수있는 원리입니다.

유전자 탐구하는 종피 침구 분석<em&gt; 체외</em&gt; 어떻게 배젖 컨트롤 종자 발아에<em&gt; 애기 장대</em

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

발달적으로 중요한 많은 유전자는 세포 또는 조직 특이적 발현 패턴을 가지고 있습니다. 본 논문은 야생형과 비교하여 옥수수잎-칼집 경계와 lg1-R 돌연변이에서 다르게 발현되는 유전자를 확인하기 위한 LM RNA-seq 실험에 대해 설명합니다. 여기에서 논의된 실험적 고려 사항은 다른 발달 현상의 전사체 분석에 적용됩니다.

레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

이 프로토콜은 광시트 현미경 검사를 위한 식물 샘플 준비 방법을 보여줍니다. 이 설정은 식물을 젤 표면에 수직으로 장착하고 통제 된 밝은 조건에서 자라도록하는 것이 특징입니다. 이를 통해 표준화된 조건에서 식물 기관 발달을 장기간 관찰할 수 있습니다.

겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

향상 된 프로토콜은 입자 사격 후 보 리 aleurone 세포에서 기자 구문에서 일시적인 유전자 발현의 측정에 대 한 제공 됩니다. 96 잘 접시 효소 분석 실험 연 삭 자동화 된 곡물의 조합을 절차에 대 한 높은 처리량을 제공 합니다.

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

여기, 우리 세대를 설명 하 고 유전자 변형 애기 thaliana 의 집합의 응용 프로그램 세 가지 주요 meristems, 싹 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에는 레이어의 활성화 유도할 수 있는, 조직 관련 식 라인.

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

식물 형태 유전자는 반발성 유전자형의 유전적 변형을 개선하는 데 사용될 수 있다. 여기에 설명된 것은 3개의 중요한 공공 옥수수 근친선에 대한 아그로박테리움-매개유전형형(QuickCorn) 프로토콜이다.

아그로박테리움-형태유전자를 이용한 리칼시트 옥수수 근친선 미성숙 배아 변형 중재

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 장기와 조직의 최소한의 처리로 개발 프로그램을 해부할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표적화된 세포로부터 고품질의 RNA를 산출합니다. qRT-PCR 또는 RNA-seq와 같은 다운스트림 분석 도구는 조직 및 세포 유형별 발현 프로파일을 밝힙습니다.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

이 프로토콜은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 자세한 요약을 제공합니다. 진균 Verticillium longisporum 및 Verticillium dahliae에 대해 예시된 세 가지 상이한 뿌리 감염 시스템이 기술된다. 잠재적 응용 분야와 가능한 다운스트림 분석이 강조되고 각 시스템에 대한 장단점이 논의됩니다.

식물 뿌리를 토양 매개 미생물로 감염시키는 접종 전략

우리는 간단한 실험실 도구를 사용하여 Arabidopsis 및 Medicago의 루트 시스템 아키텍처 (RSA)를 검사합니다. 묘목은 메쉬 위에 수경 재배되고 아트 브러시를 사용하여 RSA를 드러냅니다. 스캐닝 또는 고해상도 카메라를 사용하여 이미지를 촬영한 다음 ImageJ로 분석하여 특성을 매핑합니다.

플랜트 루트 시스템 아키텍처 특성을 매핑하기 위한 간단한 프로토콜

학습하세요 측면 뿌리 유도 시스템을 사용하여 Arabidopsis thaliana와 옥수수에서 뿌리 발생을 동기적으로 연구하는 방법을. 이 체외 배양 기법은 세포학적 및 분자 수준에서 뿌리 발달 메커니즘을 규명하는 데 필수적인 도구입니다.

의 측면 루트 유도 성 시스템

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