Name: 마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 학습하세요 마우스 임신 중 산모 혈관 변화를 평가하는 입체측정 및 면역조직화학 기법을 활용한 방법입니다. 이 기술은 태아 성장에 필수적인 나선동맥 리모델링을 정량적으로 분석하여 재현 가능한 결과를 제공합니다.

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저자는 도움이 되는 토론을 해준 Colucci 연구실의 모든 구성원에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 웰컴 트러스트(Wellcome Trust)[094073/Z/10/Z], 영양블라스트 연구 센터(Centre for Trophoblast Research) 및 영국 심장 재단(British Heart Foundation)의 지원을 받았습니다.

이 논문에서 논의 된 모든 절차는 영국 홈 오피스 규정에 따라이며 캠브리지 윤리 검토위원회에 의해 승인됩니다. 1. 표본 수집 <ol><li> 오후에 (남성 당 2 여성까지) 성인 남성과 8~12주 세 여성 C57BL / 6 마​​우스를 사용하여 시간 제한 교배를 설정합니다. 이른 다음 날 아침에 교미의 표시로 질 플러그의 존재를 확인합니다. 아침 마크 gd0.5에서 플러그의 존재. </li><li> gd9.5에서 자궁 전위에 의해 동물을 안락사 및 복강을 엽니 다. 혈관 확장의 원인이 이산화탄소에 의한 안락사를합니다. </li><li> 부드럽게 자궁 동맥 (그림 1, 점선 화살표)을 결찰하는 치실을 사용합니다. 자궁 경부 주위뿐만 아니라, 난소 각 자궁, 근위부의 끝에서 동맥 주위에 치실을 묶어. 참고 :이 붕괴 동맥을 초래할 수 있으므로 혈관을 파열하지 마십시오. </li> &lt;리&gt; 자궁 뿔과 자궁 경부의 끝에서 세 결찰 점 원심 전체 자궁을 절개, 해부 가위를 사용하여 신속하게 자궁을 해부하다. </li><li> 모두 뿔이 자궁 경부에서 반대 방향으로 같은 긴 축을 따라 정렬되도록 준비된 폴리스티렌 조각에 자궁을 놓습니다. 부드럽게 스트레칭 2-3 25 G 바늘을 사용하여 제자리에 고정. </li><li> 준비 50 ML 원뿔 튜브에 폴리스티렌을 담가. 10 % 포르말린에 50 ㎖까지 최고. 실온에서 5-6 시간 동안 수정. </li><li> 포르말린 용액을 취소하고 5 분 50 ㎖ 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)로 교체. </li><li> 중앙에 자궁 경부에 근위 양쪽 끝 부분에있는 결찰 점과 근위 두 개의 자궁 뿔을 절제 주입 부위 주변에 여분의 지방을 잘라 내고 포르말린의 흔적을 제거하는 5 분 동안 PBS로 두 번 씻는다. </li><li> 처리 될 때까지 (최대 2 주) 4 ° C에서 70 % 에탄올에 샘플을 저장합니다. 주의 : ETHanol는 가연성이다. </li><li> . 표 1의 파라미터를 이용하여 자동화 된 처리 시스템을 사용하여 그들이 자궁의 긴 축에 수직 인 평면을 따라 절단 할 수 있도록 개별적으로 파라핀 뿔 임베드. 이는 각각의 주입 부위의 최대 면적은 블록 (도 2a)의 중간 분석에 노출되는 것을 보장한다. 옵션 : 원하는 경우이 블록의 랜덤위한 편리한 시점이다. </li><li> 마이크로톰을 사용하여, 블록 7 μm의 두께 직렬 섹션을 자른다. 헤 마톡 실린 및 에오신으로 모든 49 μm의 간격에서 하나의 섹션을 얼룩 (H &amp; E는 2.1 절 참조). SMA 염색 및 기타 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 실온에서 나머지 부분을 저장합니다. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> 해결책 </td><td style="width:43px;"> 시간<html></td><td style="width:97px;"> 온도 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; 크실렌 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 크실렌 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 크실렌 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 파라핀 </td><td> 1 시간 </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 파라핀 </td><td> 1 시간 </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 파라핀 </td><td> 1 시간 </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> 파라핀 </td><td> 1 시간 </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> 표 1. 자궁 조직의 처리에 사용되는 설정을 자동으로 조직 처리를위한 설정 개요 2. STEReological 평가 <ol><li> H &amp; E 염색 <ol><li> 실온에서 10 분 동안 100 % 크실렌 욕에 슬라이드 랙에 장착 된 슬라이드를 침지 Deparaffinize 섹션. 주의 : 크실렌 가연성과의 접촉과 흡입을 통해 독성이 의심되는 발암 물질이다. 이 작품은 개인 보호 장비 (PPE)를 사용하여, 흄 후드에서 수행해야합니다. </li><li> 추가로 10 분 동안 깨끗한 자일 렌을 포함하는 목욕에 슬라이드를 담가. </li><li> 순차적으로 각 5 분, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올 및 정제수를 함유하는 욕조에 담궈 슬라이드. </li><li> 5 분 동안 순수로 희석하고, 50 % 길 없음 3 마톡 실린 용액에 담가 슬라이드. 주의 : 헤 마톡 실린 섭취와 눈에 접촉하면 유해 함이다. 취급시 적절한 개인 보호구를 착용 할 것. </li><li> 10 분 동안 수돗물 흐르는 염색 통에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 10 초 동안 (70 % 에탄올을 1 % 염산 10 M)에 1 % 산 / 알콜 용액을 슬라이드 담가수돗물 흐르는 염색 통에 씻는다. </li><li> 30 초 동안 에오신 솔루션에 슬라이드를 담그고 10 분 동안 수돗물 흐르는 염색 통에 씻는다. </li><li> 흄 후드 내에서, 순차적으로 각 5 분 동안 70 % 에탄올, 95 % 에탄올 및 100 % 에탄올을 함유하는 욕조에 담궈 슬라이드. </li><li> 10 분 동안 자일 렌을 포함하는 목욕에 슬라이드를 담가. </li><li> 마운트 크실렌 계 장착 매체를 이용하여 커버 슬립. 현미경 슬라이드를 시각화하기 전에 흄 후드에서 가로 철저히 건조. </li></ol></li><li> 선박의 크기와 리모델링 상태의 Stereological 평가 <ol><li> 각 주입 사이트에 대해 midsagittal 포인트 가까이있는 부분을 결정합니다. 태아 개발 태반 사이의 융모 첨부 midsagittal 점의 좋은 지표 역할을한다. </li><li> 분석을위한 midsagittal 점에 가까운 49 μm의 간격으로 3 섹션을 선택합니다. 선택한 슬라이드를 스캔합니다. INC을 피하기 위해더 둘레 주입 부위 (16)에 위치되는 것으로 도시되었다 luding 정맥, 각 이식 장소 (도 2a)의 중앙 2/4의 해석을 제한. </li><li> 루멘 크기를 평가하기 위해, 용기의 내부 및 주위에 그릴이 형상의 영역을 기록한다. 전체 용기의 크기, 내피 세포, 혈관 주위 세포와 백혈구 벽내 포함한 용기의 외벽 주위에 그릴. 주 : 루멘 총 혈관 크기의 비는 용기의 개조 상태에 대한 프록시이다. 혈관 부분을 따라서 절단 한면을 통해 코일로서, 하나의 슬라이드에 동일한 동맥의 여러 단면이있을 수있다. 같은 동맥을 여러 번 측정하지 마십시오. </li><li> 최대 규모의 roundest 루멘 각각 주입 사이트의 5 배에서 측정 값을 기록한다. 중으로 각 이식 장소를 (세 부분이 서로 49 μm의 이격)를 측정한다. 이 15 측정 represe의 평균큰 용기의 평균 직경 NTS. </li><li> 일부 샘플의 더 큰 용기 overrepresentation을 피하​​기 위해, 각각의 주입 부위에서의 혈관의 동일한 수를 측정한다. </li></ol></li></ol> 면역 조직 화학을 사용하여 3. 질적 평가 <ol><li> 탈 파라핀과 재수 <ol><li> 실온에서 10 분 동안 100 % 크실렌 욕에 내열 슬라이드 랙에 장착 된 슬라이드를 침지 Deparaffinize 섹션. </li><li> 추가로 10 분 동안 깨끗한 자일 렌을 포함하는 목욕에 슬라이드를 담가. </li><li> 순차적으로 각 5 분, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올 및 70 %의 정제수를 함유하는 욕조에 담궈 슬라이드. </li></ol></li><li> 항원 검색 <ol><li> 정제 된 물에 10 mM 시트르산 나트륨 완충액을 준비하고, 10 M 염산을 사용하여 pH를 6으로 조정한다. </li><li> 충분한 와트를 포함하는 국내 압력 밥솥에 400 ml의 나트륨 구연산 버퍼와 장소 600 mL로 보유 할 수있는 내열 용기를 채우어 컨테이너의 절반을 잠수함합니다. 느슨하게 비등 할 때까지 압력 밥솥과 열 뚜껑을 연결합니다. </li><li> 장소 슬라이드 구연산 나트륨 버퍼에 랙 단단히 압력 밥솥의 뚜껑을 고정합니다. 일단 가압, 3 분 동안 끓여 할 수 있습니다. </li><li> 압력 밥솥의 압력을 감소하고 내부 용기를 제거합니다. 슬라이드를 실온에서 10 분 동안 시트르산 나트륨 완충액 식히. </li><li> 세척을 5 분 동안 정제수를 함유하는 욕에서 슬라이드. </li><li> 소수성 장벽 펜을 사용하는 섹션을 둘러싸. </li><li> 5 분 동안 PBS에 잠수하여 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 내생 퍼 옥시 다제 및 비 특정 바인딩 차단 <ol><li> 실온에서 30 분간 가온 챔버 내에 정제수에 희석 3 % 과산화수소와 섹션을 인큐베이션. 주의 : 과산화수소가 눈, 피부 및 섭취에 크게 자극을 일으킬 수 있습니다. 적절한 개인 보호구를 착용 할 것. </li><li> 과량의 과산화수소 용액을 누르고 SLI 씻어DES는 두 번 트리스에 잠수하여 2 분마다 식염수 (TBS)을 버퍼. </li><li> 마우스 면역 글로불린은 제조업체의 지침에 따라 제조 마우스 키트에 마우스에서 시약을 차단에 섹션을 품어. </li><li> 워시는 2 분마다 두 번 TBS에서 슬라이드. </li></ol></li><li> 부드러운 근육 굴지의 면역 <ol><li> (키트에 제공됨) 항체 희석액을 제조하고, 실온에서 5 분 동안 배양 섹션, 또는 제조자의 지시에 따라. </li><li> 희석 1 : 항체 희석액 100 마우스 항 - 인간 평활근 액틴 (DAKO M0851). 최종 면역 글로불린 농도가 두 솔루션에 해당하는 것을 보장 항체 희석액 마우스의 IgG2a 아이소 타입 컨트롤을 희석. </li><li> 희석 항체 또는 이소 제어 솔루션 중 하나와 초과 항체 희석액과 덮개 부분을 누릅니다. 실온에서 30 분간 가온 챔버 내에 배양한다. </li><li> 워시에 대한 TBS에 두 번 슬라이드2 분마다. </li><li> 비 오티 닐화 항 - 마우스 이차 항체를 희석하고, 실온에서 10 분 동안 배양 섹션, 또는 제조자의 지시에 따라. </li><li> 워시는 각각 2 분 동안 한 번 각 TBS와 PBS로 슬라이드. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 3,3&#39;- 디아 미노 (DAB) 솔루션을 준비합니다. DAB 용액 부분을 커버하고 과량의 발색을 방지 섹션을 모니터링하도록 보장까지 4 분 동안 배양한다. 주의 : DAB 가연성과의 접촉과 흡입을 통해 독성이 의심되는 발암 물질이다. 취급시 적절한 개인 보호구를 착용 할 것. </li><li> 염색의 원하는 강도에 도달하면 정제 물에 슬라이드를 담가. </li><li> 20 초 동안 50 %의 길 3 번 헤 마톡 실린과 Counterstain과 물이 맑은 실행될 때까지 수돗물 흐르는 염색 통에 씻는다. </li></ol></li><li> 탈수 및 설치 <ol><li> 흄 후드 내에서 순차적으로 70 % ETH를 포함하는 화장실에 슬라이드를 담가anol, 95 % 에탄올 및 5 분마다 100 % 에탄올. </li><li> 10 분 동안 자일 렌을 포함하는 목욕에 슬라이드를 담가. </li><li> 마운트 크실렌 계 장착 매체를 이용하여 커버 슬립. 종래 현미경 슬라이드를 시각화에 흄 후드에서 가로와 완전히 건조 </li></ol></li></ol>

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</ol>

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여기에 제시된 프로토콜은 성공적인 임신에 필요한 혈관의 변화를 평가함으로써 재현 방법을 제공하도록 설계된다. 이 평가에 필수적인 조직 절편의 품질이다. 모두 정확하게 안정적으로 자궁 동맥 중요한 단계입니다 결찰뿐만 아니라 주입 사이트의 임신 주수를 결정하는 단계를 포함한다. 등의 고정 시간, 조직 처리 프로토콜, 같은 파라미터에서의 변화는 결과에 영향을 미칠 수있다. 바이어스 stereological 평가, 각 이식 장소에서 용기의 동일한 수를 측정하는 것이 중요하다. 그것은 주입 사이트와 세중의 각 주입 사이트 당 5 혈관을 측정하는 것이 좋습니다. 이 15 측정의 평균은 5 최대 규모의 선박의 평균 크기를 나타냅니다. - / - IL2rg - 또한 alymphoid Rag2의 데이터에 / - 마우스는 여기에 표시된, 우리는이 PROT 발견억제 NK 세포 (14) 중 하나를 포함 불충분 한 산모의 면역 기능의 모델의 숫자에 유용 ocol. 동맥 리모델링에 결함이 또한 장애인 영양막 세포의 침윤 (18)의 모델에 표시되어 있고 여기에 설명 된 기술은 이러한 경우에 혈관을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 최적화 된 마우스의 중간 임신에서 탈락 혈관 재 형성의 조사를 위해이 프로토콜을 검증하지만, 다른 모델 시스템 (예 : 쥐) 또는 다른 기관에서 작동하는이 프로토콜을 적용하는 것도 생각할 수있다. 우리가 북한에 의존 리모델링이 견고 gd9.5에서 평가 될 수 있음을 발견하지만, 이러한 산모의 혈관이 완전히 개조되어 gd12.5, 다른 시점에 대한 개정 될 수있다. 이 시점에서, 혈관 영양막 침입 깊이는 16이며,이 시점은 혈관 변화 영양막의 역할을 조사 더 적합 할 수있다. 추가 양적 판독이 요구되는 경우,조사자는 또한 SMA 스테인드 섹션들의 수를 증가시키고, 각각의 주입 부위에서 부분적으로 개조 된 선박의 백분율을 평가할 수있다. 이 프로토콜의 제한은 조직 학적 검사의 기술적 인 성격이다. 기능 분석은, 그러나, 단지 느리게 (예 도플러 초음파로 19) 가능 해지고있다. 이러한 기술 및 전문 기술을 획득하고 유지하기위한 장치를 더 높은 비용을 필요로하지만, 조직 학적으로 관찰 할 수있는 변화의 효과를 생체 내에서 판독 길이를 제공하는 장점이있다. 모든 stereological 시험의 가능한 단점은 연구자의 주관입니다. 이를 위해, 모든 샘플을 개별적으로 분석하는 두 개의 독립적 인 시험관을 사용하여이 문제를 피하는 것을 도울 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜이 많은 혈액 것을 말하고, 인터페이스에 도달하는 방법에 대한 통찰력을 주지만, 그것은 COMPL 함께 결합하는 것이 유리할 수있다플라스틱을 통해 맥관 구조에서 임의의 주어진 시간에 혈액의 총량을 평가하는 방법은 16 ementary 캐스트. 이 프로토콜의 강도는 두 개의 독립적 인 접근 방식을 결합한 것입니다. 혈관 변화는 제 Stereology를 정량적으로 평가되고, 결과는 다음을 사용하여 면역 조직 화학 질적 검증된다. 결과의 신뢰성을 추가로 샘플을 랜덤으로 강화 될 수있다. 이 프로토콜 작성된 샘플은 쉽게 또한 엄격 midgestation에서 임신 표현형을 평가하기 위해, 이러한 decidualisation 임신 (MLAp) 또는 관심의 세포 면역의 mesometrial 림프 골재의 개발과 같은 임신의 다른 매개 변수를 조사하기 위하여 사용될 수있다. 동맥 리모델링 여성과 이러한 변화의 실패 복잡하지 않은 임신을위한 중요한 단계는 큰 산과 증후군 (GOS), 즉 전자 간증, 태아 성장 제한 및 토대입니다사산. 우리는 신중하게 GOS의 병태 생리의 일부 특성을 모방 마우스 모델에서 임신 표현형을 평가하기 위해 여기에 기술을 제시한다.

eutherian 임신 동안 영양소, 가스 및 노폐물의 교환은 태반에 의해 매개된다. 여성의 생식 기관에서 자궁 동맥 자궁에 혈액의 주요 도관이다. 주입 후, 전문 선박에이 지점 fetoplacental 유닛으로 탈락의 basalis를 통해 코일 나선형 동맥을했다. 직경 특히 자궁 자연 살해 (UNK) 세포, 백혈구에 의해 둘러싸여있다 이러한 나선형 동맥의 탄력성, 태반 1, 2에 볼륨을 사용할 수 혈액의 속도를 지시. 나선형 동맥의 리모델링의 결과로 올바른 혈역학 적 변화는 임신 성공을 위해 중요하다. 기전은 인간과 생쥐 사이 임신 상세히 다르지만, 두 종의 리모델링 과정의 최종 결과는 평활근 층을 잃게 팽창 높은 컨덕턴스 혈관이다. 마우스에서, UNK의 (IF 인터페론 세포 유래N-) γ 주위 중반 임신 3-5에서 이러한 변화를 유도하는 것이 필요하다. NK 세포 또는 IFN-γ의 신호 전달 경로의 구성 요소 중 하나가 결여 된 마우스에서는 이러한 변화를 겪게 못하고 이는 fetoplacental 부에 적절한 혈액 공급의 중요성을 강조하고, 감소 된 태아 성장 -6,7-와 연관된다. 초기 인간 임신 중, 간질 및 혈관 extravillous 영양막 세포의 침략과 UNK 세포와의 상호 작용은 혈관의 변화를 유도하고 태아의 성장 8-10을 촉진하기위한 중요하다. UNK 세포는 과립구 대 식세포와 같은 사이토 카인 및 케모카인 (11)를 통해 인간 영양막 세포 침윤을 조율 할 수있다 - 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 12. 얕은 영양막 세포의 침윤이 같은 자간전증 9 감소 동맥 리모델링과 임신 합병증과 연관되어 있습니다. 이 프로토콜은 중요한을 설명 앤 Croy의 선구적인 작업을 기반으로면역 조직 화학 염색과 우아한 전송 실험 5,13 통해 성공적인 혈관 재에 대한 면역 체계, 특히 북한에서 파생 된 IFN-γ의 역할. 여기에서 우리는 나선형 동맥의 리모델링 상태를 평가하는 빠르고 경제적 인 방법을 설명합니다. 우리 연구실은 정기적으로 중간 임신 (임신 일 (GD) 9.5) 14이 평가되지만, 리모델링 과정은 gd8.5 12.5 (15) 사이에 발생한다. 자동 슬라이드 스캐너의 출현은 크게 섹션에서 용기 루멘 영역의 평가를 촉진하고 우리는이 혈관 직경을 측정보다 더 재현 방법이 될 것을 알았다. SMA의 면역 검출의 추가는 stereological 평가에서 얻은 결과의 직접적인 확인이 가능합니다. 모든 stereological 기술과 같이, 적어도 두 개의 시험관 맹검 실험으로 평가를 수행 할 것을 권장한다. 직렬로 절단 할 때이를 위해 랜덤 단계를 도입 할 수있다팅은 샘플 슬라이드를 평가하는 연구자가 샘플을 제공하는 실험 그룹에서 알고하지 않도록. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 신중 임신 관련 합병증의 마우스 모델의 문맥에서 정의 부계 및 모계 유전형을 가진 마우스에서 나선형 동맥의 재 형성을 평가하기 위해 신뢰할 수있는 도구를 제공하는 것이다. 결과는 정상적인 태아 성장에 필수적인이 프로세스의 UNK 세포에 의존을 강조한다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 마우스 (8-12주)</td> <td>찰스 리버</td><td></td><td></td></tr><tr><td>치실</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌</td><td></td><td></td><td>조직을 고정하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 직선 해부 가위</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr><tr><td>25 G 바늘</td><td>BD&nbsp;</td><td>300600</td><td>조직을 제자리에 고정하는 데 사용</td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 용액, 중성 완충, 10%</td> <td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td>Sigma</td><td>327204-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>자동 조직 처리기</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 랙</td><td>Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr><tr><td>정제수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 용액, Gill No. 3</td><td>Sigma</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y 솔루션</td><td>Sigma</td><td>HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>흄 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>크실렌 기반 마운팅 미디어</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 스캐너</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 스캐너 소프트웨어</td><td>Hamamatsu</td><td>NDP 뷰어</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 삼염기성 이수화물</td><td>Sigma</td><td>32320</td><td>10mM 용액을 만들고 pH를 6으로 조정</td></tr><tr><td>항원 검색에 사용되는</td><td>압력솥</td><td></td><td></td></tr><tr>항<td>원 검색에 사용되는</td><td>가열판</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소수성 장벽 펜</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Tris 완충 식염수</td><td>Sigma</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>마우스 키트에 마우스 Vector</td><td></td><td>BMK-2202</td><td>배경</td></tr><tr><td>마우스 반인간 평활근 액틴</td><td>DAKO</td><td>M0851</td> 마우스 <td></td></tr><tr><td>IgG2a 동형 제어</td>와 교차 반응 <td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>가습 챔버</td><td>시그마</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-디아미노벤지딘 용액</td><td>시그마</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

태반은 산모와 태아 사이의 가스와 영양분과 같은 요인의 교환을 매개하고 모체 순환계에서 혈액 공급에 대한 특정 요구를 가지고 있습니다. 모계의 자궁 혈관 구조는 이러한 일시적인 요구에 적응해야 하며, 이 동맥 리모델링 과정의 성공은 태아 성장에 영향을 미친다. 모계 면역 체계의 세포, 특히 자연살해(NK) 세포는 이 과정에서 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 마우스 임신 중 모계 나선형 동맥의 리모델링 정도를 평가하는 방법을 설명합니다. 헤마톡실린 및 에오신 염색 조직 절편을 스캔하고 혈관의 크기를 분석합니다. 보완적 검증 방법으로, 일반적으로 임신 중기에 동맥 혈관 내에서 사라지는 평활근 액틴(SMA)의 면역조직화학적 검출에 의한 리모델링 과정의 성공에 대한 정성적 평가도 제시합니다. 이러한 방법을 함께 사용하면 임신 표현형의 중요한 매개변수를 결정할 수 있습니다. 이러한 결과는 생쥐 임신의 다른 종점과 결합하여 임신 관련 합병증의 기저에 있는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Rag2 - / - IL2rg - / - 마우스는 NK 세포 (17)를 포함하여 모든 성숙 림프구를, 부족, 자신의 자궁 동맥 중순 임신 5,14 주위에 congenic 야생형 C57BL / 6 (WT) 쥐에서 볼 수있는 혈관의 변화를 받아야하지. 마우스 stereologically H &amp; E 염색 부분에 시각화 및 정량화 할 수있다 전반적으로 작은 혈관을 나타내는 상당히 작은 내강 표면 영역, (그림 2) 표시 - / - / - - IL2rg이 감소 리모델링 Rag2의 결과. 또한, (루멘 비율 용기)의 상​​대 두께는 혈액 공급의 감소 및 높은 혈액 유속을 시사 이들 마우스에서 나선형 동맥 높다. 이 양적 평가는 SMA의 면역 검출을 이용하여 확인 하였다. WT 마우스는 혈관 내에 미디어 SMA의 대부분을 잃게하는 것이 특징 인중반 임신에 의한 나선형 동맥의. 이 NK 세포 기반 프로세스가 수행되지 않는 경우, SMA는 혈관에 남아있는 미디어 용이 혈관 (도 3) 주위에 링으로 면역 검출 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> 그림 1 : gd9.5에서 마우스 자궁, 자궁 뿔, 자궁 경부 (파란색)의 상대적 위치를 보여주는 개략도 그리기 및 주요 자궁 동맥 (빨간색).. 자궁 뿔 (화살표)와 결찰 포인트 (점선 화살표)의 긴 축이 있습니다 지적했다. 면역 조직 화학 염색에 대한 부분은 뷰의 평면을 따라 절단한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> 그림 2 :. 중반 임신에서 동맥 리모델링의 Stereological 평가 (A) 예 ASSE탈락의 basalis의 중앙 2/4의 내강과 (WT)의 여성에서 H &amp; E 염색 섹션에 총 선박 분야의 ssment gd9.5에서 (수직 검정에 의해 경계가는 점선). 높은 배율에서 혈관, 적색 라인은 총 용기 영역, 황색 점선은 루멘을 획정 영역을 획정 점선. 막대 = 500 μm의 (왼쪽), 50㎛의 (오른쪽). 자궁의 장축 방향이 수평 라인이다. WT (C57BL / 6) 및 Rag2에서 총 선박 지역 (오른쪽 패널)에 내강 영역 (왼쪽 패널) 및 내강 면적의 비율 (B) 정량 - / - Il2rg - / - 생쥐 (C57BL / 6 배경에). 각각의 데이터 포인트는 15 측정 (섹션 당 5 측정, 주입 사이트 당 3 절)의 평균을 나타냅니다. 바 그룹 당 n = 4 임신에서 11-13 주입 사이트의 의미 나타냅니다; 두 개의 꼬리, 짝 맨 - 휘트니 테스트에서 p- 값. WT : 야생형. <img alT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3 :. 탈락의 basalis의 평활근 액틴의 면역 검출 (WT) (위)과 Rag2에 대표 SMA 염색 - / - IL2rg - / - gd9.5에서 (C57BL / 6 배경에, 아래) 마우스. 바 = 100 μm의. WT : 야생형.

이 프로토콜은 생쥐의 임신 중 모계 혈관 구조의 변화를 평가하는 기술을 설명합니다. 입체학적 방법을 사용하여 탈피나선동맥의 리모델링을 정량적으로 평가하고 결과는 면역조직화학을 사용하여 정성적으로 확인했습니다.

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

이 프로토콜의 전반적인 목적은 생쥐 임신 기간 동안 정상적인 태아 및 태반 성장에 필요한 모체 혈관 변화를 평가하는 것입니다. 따라서 이 방법은 임신 중 발생하는 모체 혈관 적응을 정밀하게 특성화하는 데 유용하며, 이러한 적응은 태아 성장에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 견고하고 재현 가능한 입체 분석(stereological readout) 결과를 제공하며, 이는 면역조직화학법을 통해 잔존 혈관 평활근 액틴을 시각화함으로써 검증될 수 있다는 점입니다.임신 기간 동안 자궁 조직의 준비 방향이 현저하게 변하며 이는 본 절차의 성공에 핵심적이므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 임신 9.5일차에, 교배 시기가 확인된 임신한 C 57 black six 마우스의 난소 근처 자궁각 아래로 치실을 조심스럽게 통과시킨 후, 치실을 부드럽게 하지만 단단히 묶어 자궁 동맥을 결찰합니다. 동맥이 허탈되는 것을 방지하기 위해 반대편 자궁각 아래와 자궁경부 주변에 대해서도 동일하게 결찰을 반복합니다.그 다음, 뿔의 끝부분에 있는 세 군데의 결찰 지점과 자궁경부 원위쪽의 자궁 전체를 빠르게 절제하십시오. 자궁경부로부터 서로 반대 방향으로 두 자궁각이 동일한 장축을 따라 정렬되도록 폴리스티렌 조각 위에 자궁을 배치합니다. 그런 다음 25게이지 바늘 2~3개를 사용하여 조직을 조심스럽게 늘려 위치를 고정하십시오.폴리스티렌을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고, 실온에서 최대 50 mL의 10% formalin으로 자궁 조직을 고정합니다. 자궁 조직은 매우 섬세하므로 손상이나 찢어짐을 방지하기 위해 고정 전 세심하게 다뤄야 합니다. 5~6시간 후, formalin을 50 mL의 PBS로 교체하여 5분 동안 세척합니다.그런 다음 양 끝의 결찰 지점과 중앙의 자궁경부 결찰 지점 근처에서 자궁각을 절제합니다. 착상 부위에서 과도한 지방을 제거하십시오. 이어서 포르말린의 잔여물을 완전히 제거하기 위해 자궁을 PBS로 5분씩 두 번 더 세척하고, 표에 표시된 매개변수로 설정된 자동 처리 시스템을 사용하여 조직을 4°C의 70% ethanol에 보관합니다.각 뿔을 자궁의 장축에 수직인 평면을 따라 절단할 수 있도록 파라핀에 개별적으로 매립합니다. 절단 시 착상 부위 전체에서 동일한 단면 프로파일을 확보할 수 있도록 모든 시료를 동일한 방향으로 매립하는 것이 매우 중요합니다. 마이크로톰을 사용하여 7 µm 두께의 연속 절편을 제작한 후, 49 µm마다 한 장의 절편을 hematoxylin and eosin으로 염색하고, 이후의 하위 분석을 위해 절편들을 상온에서 보관합니다.각 이식 부위의 혈관 크기와 조직 리모델링 상태를 평가하기 위해, 정중면 지점에 가까운 49 micron 간격의 섹션 3개를 선택합니다. 선택한 슬라이드를 스캔한 후, 정맥이 포함되지 않도록 각 이식 부위의 중앙 4분의 2 영역으로 분석 범위를 제한합니다. 내강 크기를 평가하려면 혈관 내부 주변의 관심 영역을 선택하고 해당 영역의 넓이를 기록하여 전체 혈관 크기를 구합니다.내피세포, 기생충 및 벽내 백혈구를 포함하여 혈관 외벽 주변에 관심 영역(region of interest)을 지정하십시오. 마지막으로 동일한 동맥을 중복 측정하지 않도록 주의하며, 면역결핍 Rag2 IL2 receptor gamma chain knockout 마우스에서 나타나는 리모델링 감소 결과로 인해 내강이 가장 크고 둥근 각 이식 부위의 혈관 5개로부터 측정값을 3회 반복 기록하십시오. 이 동물들은 전체적으로 더 작은 혈관임을 나타내는 현저히 작은 내강 표면적을 보이며, 이는 여기 야생형 마우스에 대해 나타난 바와 같이 H&E 염색으로 시각화하고 입체 분석법으로 정량화할 수 있습니다.또한, 이들 마우스의 나선동맥에서 혈관 벽 대비 내강 비율이 더 높게 나타나는데, 이는 면역결핍 마우스에서 혈액 공급이 감소하고 혈류 속도가 더 빠름을 시사합니다. 이 대표 실험의 정량적 평가는 평활근 액틴(smooth muscle actin)의 면역조직화학적 검출을 통해 확인되었으며, 야생형 나선동맥의 혈관 중막에서는 임신 중기까지 대부분의 평활근 액틴이 소실됩니다. 그러나 NK 세포에 의해 유도되는 이 과정이 일어나지 않으면 혈관 중막에 평활근 액틴이 남아 있게 되며, 이는 혈관 주변의 갈색 염색 고리 형태로 검출될 수 있습니다. 절편 준비가 완전히 완료되면, 필요한 동물의 수를 줄이기 위해 며칠 이내에 면역조직화학을 통한 측정 및 검증을 합리적으로 완료할 수 있습니다.이 프로토콜은 유세포 분석과 같은 다른 기술과 결합하여 모체 백혈구 집단이나 면역 기능을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 대부분의 임신 기간 동안 발생하는 모체 혈관 적응을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 단계별 절차와 필요한 장비에 대한 설명을 포함 손쥐 spinotrapezius 근육의 소설 동맥 결합 모델을 보여줍니다. 우리는 수술과 intravital 및 공 촛점 현미경을 사용하여 혈관 네트워크 리모델링 및 기능 vasodilation에 관한 관련 결과 측정을 설명합니다.

Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델

이 원고는 여성 쥐 생식 및 부인과 조사에 대 한 실험 모델을 설계 하에 수행 하는 초음파의 유틸리티를 설명 합니다. Ultrasonographic 평가 수행 하는 방법에 대 한 단계별 설명을 표시 됩니다.

초음파에 쥐 실험 생식 조사에

마우스 널리 임신 생물학을 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 임신 종료는 이러한 연구는 경도 조사 하는 걸로 하 고 동물의 큰 숫자의 사용을 필요로 필요 합니다. 따라서 조기 발견에 대 한 높은 주파수 초음파의 비-침략 적 기법 및 임신 마우스에서 후 이식 이벤트 모니터링 설명 합니다.

마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

가벼운 자궁내 hypoperfusion 배아 일 17에 쥐의 자 궁과 난소 동맥의 주위에 감싸인 금속 microcoils와 동맥 협 착 증에 의해 제작 되었다. 이 절차는 태아 hypoperfusion 및 자궁내 성장 제한 생산.

Microcoil 협와 가벼운 자궁내 Hypoperfusion의 쥐 모델

태아 마우스의 높은 주파수 초음파 이미징 영상 해상도 개선 하 고 심장 개발 및 구조적 결함의 정확한 비-침략 적 특성을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 실시간 태아 쥐 심장 초음파에서 vivo에서수행 하도록 설계 되었습니다.

태아 마우스 심장 혈관 이미징 높은 주파수 초음파 (30/45 m h Z) 시스템을 사용 하 여

고해상도 초음파는 임신 상태, 임신 연령 및 임신 손실을 결정하여 임신 시간 임신 마우스를 요구하는 실험을 간소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 임신을 모방할 수 있는 잠재적인 함정 (이미지 아티팩트)뿐만 아니라 마우스 임신을 평가하는 방법을 설명하는 프로토콜입니다.

내 마우스가 임신? 고주파 초음파 평가

이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

임신 확립은 복잡한 배아와 자궁 누화를 포함하는 역동적인 과정입니다. 이러한 과정에 대한 산모의 자궁 환경의 정확한 기여는 여전히 활발한 조사 영역으로 남아 있습니다. 여기에서는 이러한 연구 질문을 해결하기 위해 생체 내 동물 모델을 설계하는 데 도움이 되는 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

난소 절제된 마우스 모델에서 임신 확립에 대한 자궁 기여도를 연구하는 방법

저산소 조건(자간전증의 한 측면 모델링)에서 배양된 태반 외식에서 분리된 소형 EV(sEV)가 임신하지 않은 성인 암컷 마우스의 혈액-뇌 장벽을 파괴하는지 여부를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

저산소성 인간 태반의 작은 세포외 소포에 의한 생쥐 혈액-뇌 장벽의 파괴

이 프로토콜은 마우스 모델에서 자궁 손상을 유도한 후 후속 임신 중에 다운스트림 분석을 수행하는 절차를 설명합니다.

외과적 자궁 손상과 후속 임신 결과에 대한 마우스 모델

배란 전 기간 동안 난소 혈류의 변화는 배란에 필수적입니다. 도플러 초음파 검사는 난소 혈류역학 및 관류를 평가하기 위해 인간과 대형 동물에서 사용되었습니다. 마우스의 배란 전 및 배란 전후 단계에서 난소 혈역학을 평가하기 위해 도플러 초음파를 적용하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

생쥐의 난소 혈관 기능의 실시간 이미징 및 정량화를 위한 도플러 초음파 검사

학습하세요 마우스 임신 중 산모 혈관 변화를 평가하는 입체측정 및 면역조직화학 기법을 활용한 방법입니다. 이 기술은 태아 성장에 필수적인 나선동맥 리모델링을 정량적으로 분석하여 재현 가능한 결과를 제공합니다.

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

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