Name: 인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 인간 복강의 장기형 모델 구축 방법을 통해 난소암 세포와 미세환경 간 상호작용을 연구하고 잠재적 억제제를 테스트하는 기술을 익히세요.

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모든 레지던트와 주치의, 특히 A.F. Haney 박사(시카고 대학교 산부인과)에게 이생 생검을 수집해 주신 데 대해 감사드립니다. 또한 이 원고를 신중하게 편집해 준 Stacey Tobin과 Gail Isenberg에게 감사드립니다. 이 작업은 시카고 베어스 풋볼 클럽의 자선 수혜자인 베어스 케어(Bears Care), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(NINDS) R21 NS075702, 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 CA111882지원을 받았습니다.

설명하는 모든 연구 프로토콜은 시카고 임상 시험 심사위원회의 대학 (IRB)에 의해 검토되었다. 동의서는 수술 전에 각 환자로부터 얻어진 것으로,이 연구는 시카고 IRB의 대학에 의해 승인되었다. 보호를위한 인체 조직을 처리하고 세포를 오염의 위험을 줄일 때 생물 안전 캐비닛 2 형 장갑을 사용해야합니다. 차 변환되지 않은 기질 세포의 1. 분리 및 문화 <ol><li> 인체 조직 수집 및 준비. <ol><li> 복부 수술 중 제거 된 인간의 대망, 2cm 3의 표본을 확보, 즉시 RT 인산 완충 식염수 (PBS) (그림 2A)에서 조직 몰입. X 2cm 대망 3cm의 조각은 일반적으로 1,000,000 주 인간 중피 세포 (HPMC) 및 20 차 인간 섬유 아세포 또는 정상 대망 섬유 아세포 (NOF)를 산출한다. </li><li> 조직이 3 0.5 XG에 침지 PBS를 스핀 다운분 가능한 한 빨리 후 수집 (&lt;2 PBS의 시간)과 50 ML 원뿔 튜브에 신선한 20 ml의 PBS로 조직을 전송합니다. 15cm 직경, 무균 배양 접시 (그림 2B)에서 메스로 닦지에 의해 5mm 3 조각으로 조직을 잘라. </li></ol></li><li> 일차 인간 중피 세포 분리 8 <ol><li> HPMC를 분리하려면 50 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송하고 고체 조각이 상단 (그림 2C &amp; D)에 떠있는 1 분을 기다립니다. HPMC와 적혈구 (RBC)의 하단에있는 액체에 존재합니다. 튜브의 바닥에서 그리고 새로운 원추형 튜브로 액체를 제거하기 위해 피펫을 사용한다. 3 분 0.5 XG에서 액체를 스핀 다운 및 HPMC / RBC 펠렛에서 뜨는을 대기음. <ol><li> , 다진 조직에 20 ml의 PBS를 추가 조직, 스핀 다운, 상승 피펫 및 HPMC / RBC 튜브에 바닥에서 액체를 제거 할 수 있도록하고 제거 : 과정을 세 번 반복상층 액. 모든 스핀 완료 및 상청액 흡입 후, 펠릿 HPMC 및 RBC를 포함 할 것이다. </li></ol></li><li> 플레이트 10 % 소 태아 혈청 [FBS, 1 % MEM 비타민 [93 ㎎ / ℓ], 1 % MEM 비 필수 아미노산 [81.4 전체 성장 배지 15 ㎖ (DMEM에서 75cm 2 플라스크에 펠릿의 모든 셀 ㎎ / ℓ], 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 [펜 연쇄상, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신). </li><li> 추가 HPMCs을 분리 보조 PBS 세척을 수행합니다. <ol><li> 조직이 정상에 떠위한 보조 PBS 세척를 들어, 200 rpm으로, PBS의 20 ㎖에서 10 분 동안 37 ° C에서 남아있는 고체 조직을 흔들어 후 1 분을 기다립니다. 3 분 0.5 XG에 원심 분리기, 새로운 튜브로 튜브의 바닥에서 액체를 제거하고 뜨는을 대기음. </li><li> 전체 성장 매체의 15 ㎖에 별도의 75cm 2 플라스크에 씻어 보조 PBS에서 모든 HPMC / RBC 플레이트. </li></ol></li><li> 어떤 연구를 분리하려면부피 PBS 용액 : 1 0.25 % 트립신 25 밀리미터 EDTA : HPMC를 emaining, 1 20ml에 10 분간, 200 rpm에서 37 ° C 정도를 다진 조직을 흔들. 조직, 상승 관의 하단에있는 액체를 수집 새로운 50 ML 튜브로, 0.5 GX 3 분에서 스핀 다운을 허용합니다. <ol><li> 뜨는을 대기음 및 전체 성장 매체의 15 ㎖에 별도의 75cm 2 플라스크에 모든 HPMC / RBC를 접시. </li></ol></li><li> 배양 습한 환경에서 37 ° C에서 5 % CO 2에서 도금 셀. 소비 매체를 제거하지 않고 3 일 및 5 일에 완전 성장 배지 15 ㎖에 첨가함으로써 공급 도금 셀. HPMC는 분할 전에 5-7일 배양 할 수있다. <ol><li> 원래의 표현형의 탈분화 및 수정을 최소화하기 위해 모든 실험에서 (통로 2까지) 낮은 통로 HPMC를 사용합니다. 위상차 capabilitie 플라스틱 미분 간섭 대비 기능 또는 4-20x 목적으로 20 배 목적으로 바람직 넓은 필드 현미경을 사용하여의 세포의 모든 이미지를 복용 (현미경의 위상 콘트라스트 필터), 3,3&#39;- 디아 미노 (DAB) 얼룩을 면역 조직 화학 분석 밝은 분야에서 10 배 목표 (). </li></ol></li><li> HPMC가 입방 것을 확인하고 면역 조직 화학 (8) (그림 3A, C, E)를 수행하여 cytokeratin 8 멘틴을 표현한다. </li></ol></li><li> NOF 분리 (8) <ol><li> 1 : 100 배 펜 연쇄상 구균의 1 : 1 혼합물 (1)를 결합하여 콜라겐 유형 III 솔루션 (10 배)의 주식 10 ㎖를 준비 콜라게나 제 3 형의 1,500 유닛 활동 / ㎖를 : PBS에서 히알루의 714 유닛 활동 / ㎖. </li><li> 1 % MEM 비타민 [93 ㎎ / ℓ]와 무 혈청 배지에서 희석 10 배 콜라겐 유형 III 용액 10 ㎖ (DMEM에 6 시간 동안 200 rpm에서 HPMC 분리 후 남아있는 다진 대망의 조직, 37 ° C를 흔들어, 1 % MEM 비 필수 아미노산 [81.4 ㎎ / ℓ], 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 [펜 연쇄상, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신]). 소화 조직은 불투명 한 모양과 일부 섬유 파편 (그림 2E)을 가질 수있다. </li><li> NOF 함유 용액을 원심 분리하여 세포 실온에서 3 분 0.5 XG에 정지에, 뜨는을 대기음 및 전체 성장 매체의 13 ㎖에 75cm 2 플라스크에 펠렛을 접시. </li><li> 이전 용지를 제거하고 24 시간 후 신선한 전체 성장 매체의 15 ㎖로 대체합니다. NOF는 분할 전의 1-3일 배양 할 수있다. 세포가 포화 상태에 도달했을 때 NOF의주의 확산은 중단됩니다. </li><li> 기본 인간 섬유 아세포는 평면, 신장 세포임을 확인하고 멘틴을 표현하지만, 면역 조직 화학 (8)을 수행하여 8 cytokeratin하지 (그림 3B, D, F). 탈분화을 최소화하기 위해 (이상적 통로 (3) 전) 실험 낮은 통로 NOF를 사용하여 원래 표현형의 수정. 세포의 모든 단계 이미지를 복용 플라스틱 DIC 기능이있는 20 배 목적으로 넓은 필드 현미경을 사용하여,밝은 분야에서 10 배의 목표는 면역 조직 화학 DAB 염색을 분석합니다. </li></ol></li></ol> 2.의 Organotypic 문화 (8) 도금 <ol><li> 더 이상으로 5 분 이상 3 ㎖의 0.25 % 트립신 / EDTA 25 mM의 뒤에 PBS 10 mL로 세척하여 75cm 배양 플라스크에서 분리 NOF. 완전 성장 배지의 적어도 3 배 부피의 트립신을 중화. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 트립신 세포를 전송하고 0.5 GX 3 분에서 스핀 다운. 상층 액을 제거하고 전체 성장 미디어 5 ㎖에 다시 세포를 가지고. 문화 플라스크에서 회수 된 세포를 계산하는 셀 카운터를 사용합니다. </li><li> 96 웰, 분명 바닥, 검은 접시에 100 μL 당 2,000-4,000 NOF를 판에 전체 성장 매체의 적절한 볼륨에서 세포를 희석. 도금하기 전에 세포 혼합물에 쥐 꼬리 콜라겐 I는 0.5 μg의 / 100 μl를 추가합니다. 하자 세포는 적어도 4 시간 동안 습한 환경에서 5 % CO 2에서 37 ° C에 앉아서, 또는 세포까지플레이트 표면에 부착합니다. </li><li> 단계 2.1 및 2.2에 설명 된 것과 동일한 방법을 사용하여 배양 플라스크에서 HPMC를 놓습니다. 완전 성장 배지의 적당한 양의 세포를 이미 96- 웰 플레이트에서 콜라겐 I 도금 NOF의 상부에 50 μL 당 10,000-20,000 HPMC를 플레이트에 희석. 세포 실험을 시작하기 전에 적어도 18 시간 동안 습한 환경에서 5 % CO 2에서 37 ° C에서 앉게. </li><li> 완전 성장 배지에서 HeyA8 난소 암 세포를 배양 발현 녹색 형광 단백질 (GFP). HeyA8 난소 암 세포가 형광 요각류 cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1)를 발현하는 렌티 바이러스 벡터의 식으로 표시되어 있습니다. HeyA8 난소 암 세포는 사용 일 (대수 증식기)에 80-90% 합류해야한다. 배양 접시에서 세포를 분리 및 일차 전지에 대한 단계 2.1-2.2에 설명 된 것과 동일한 방법을 사용하여 계산합니다. </li><li> 난소 암 세포는 37 ℃에서 15-20 분 동안 완전 성장 배지로 복구 할뚜껑을 원뿔 튜브 느슨하게 봉인. </li></ol> 3. 접착 분석 (8) <ol><li> 회복 후, 0.5 XG에서 3 분 동안 회전시켜 난소 암 세포 펠렛 후 상청액을 제거하고 50,000 세포 / 100 ㎕의 농도를 달성하기 위해 혈청이없는 배지의 적당한 부피 세포를 희석. </li><li> 소비 매체를 분리 HPMC / NOF의 Organotypic 함께 배양 96 웰 플레이트를 전환하고, 각 웰에 무 혈청 배지에서 암 세포 현탁액 100 ㎕를 추가한다. 4 시간 30 분 동안 습한 환경에서 5 % CO 2에서 37 ℃에서 플레이트를 배양한다. </li><li> 미디어 및 비 - 부착 세포를 제거하기 위해 96 웰 플레이트를 전환. 조심스럽게 부드럽게 잘 각각에 PBS의 100 μl를 피펫, 다시 판을 반전 낮은 전력에서 멀티 채널 피펫을 사용합니다. PBS를 한 번 더 씻어 반복합니다. </li><li> PBS를 제거하고 각 웰에 100 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 추가하는 반전. 판은 20 마일 동안 앉아 허용N 세포를 해결하려면. 20 분 후, 플레이트를 반전 100 μl의 PBS를 추가합니다. </li><li> 웰의 총 형광보고 될 수 있거나 또는 세포의 수를 정량 할 수 있습니다. 정량, 1 백만 세포 / ml의 농도로 HeyA8 세포를 이용한 복제에서 제 1 플레이트 표준 곡선. <ol><li> 아래 100 만 셀을 회전 미디어를 제거하고 20 분 동안 1 ml의 4 % 파라 포름 알데히드에 앉아 할 수 있도록하여 표준 곡선을 확인합니다. </li><li> 스핀 세포는 다시 PBS (재검 세포가 100 만 / ml의 농도를 확인하기 위해) ㎖로 1에서 가져온다. 플레이트 50,000, 40,000, 30,000, 20,000, 10,000, 5,000, 1,000, 잘 중복의 각에 0 세포 및 각 웰에 50 μL의 최종 총 볼륨 PBS를 추가합니다. </li></ol></li><li> 아래는 높은 우물 (표준 곡선에 50,000) 확장, 형광 플레이트 리더 (여기 = 488 nm의, 방출 = 528 ㎚)의 문화 판을 읽어 보시기 바랍니다. organotyp 부착 얼마나 난소 암 세포를 계산하는 표준 곡선을 사용하여각 웰 (도 4A-C)에서 IC 배양. </li></ol> 4. 대량 살상 무기 확산 분석 (10) <ol><li> 난소 암 세포가 회복 후 1 % FBS와 (DMEM에게 1 % FBS 배지의 적당한 부피로 세포를 희석 한 다음 0.5 XG에서 3 분 동안 회전시켜 세포 펠렛과, 1 % MEM을 (단계 2.5 이상 2.6 참조) 비타민 [93 ㎎ / ℓ], 1 % MEM 비 필수 아미노산 [81.4 ㎎ / ℓ], 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 [펜 연쇄상 구균은 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신])를 4,000 세포의 농도를 달성 / 150 μL. </li><li> 각 웰에 FBS 매체를 소비 매체를 제거하고, 1 %에서 암 세포 현탁액 150 μl를 추가 HPMC / NOF의 Organotypic 문화로 96 웰 플레이트를 전환. 72 시간 동안 가습 환경에서 5 % CO 2에서 37 ℃에서 플레이트를 배양한다. </li><li> 아래는 상대적 확산을 평가하기 위해 한 번 형광 플레이트 리더 일 (여자 = 488 nm의, 방출 = 528 ㎚)의 문화 판을 읽고세포의. 48 시간 (그림 5A-C)에서 미디어를 변경, 96 시간 동안 분석을 계속합니다. (접시 바람직하다 반전) 미디어를 변경할 때 문화를 방해하지 않도록주의하십시오. </li></ol> 5. 침략 분석 (8) <ol><li> 3D 문화를 도금하기 전에, 24 웰 배양 플레이트 삽입 (8 μm의 기공 크기)에 200 μL PBS에 7.5 μg의 쥐 꼬리 콜라겐 I를 추가합니다. 판을 품어 O는 / N은, 조심스럽게 즉시 콜라겐 코팅 인서트 (위의 2 단계)에 HPMC / NOF의의 Organotypic 문화를 도금하기 전에 피펫으로 PBS를 제거 할 수 있습니다. </li><li> 단계 3.1에서와 난소 암 세포를 준비한다. 삽입에의 Organotypic 문화에 난소 암 세포를 플레이트에 조심스럽게 삽입의 상단에서 초과 용지를 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 각 웰에 무 혈청 배지에서 난소 암 세포 현탁액 100 ㎕를 추가한다. </li><li> 암 세포를 유도하는 웰 인서트 아래로 완전 성장 배지 750 μl를 추가의 Organotypic 문화에 vasion. 24 시간 동안 가습 환경에서 5 % CO 2에서 37 ℃에서 플레이트를 배양한다. 주 : 문화의 Organotypic 삽입물을 건너 인서트의 바닥면에 남아 침입 난소 암 세포. </li><li> 빈 우물에 삽입물을 이동 한 후, 24 시간 후, 집게와 인서트를 잡고 간단히 PBS의 비이커에 씻어. 1 분의 총 면봉의 양측 각 인서트의 상부 스크럽. 신속하게 잘 각각 750 μL 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 플레이트에 삽입을 배치합니다. 각 삽입 750 μL PBS로 가득 우물에 삽입을 전송하기 전에 10 분 동안 파라 포름 알데히드에 앉아하도록 허용합니다. </li><li> 2.5 배의 배율로 현미경 침략 세포 (인서트의 바닥에 접착 고정)를 조회. 전체 웰이 시야 내에있는 경우, 회피, 10 배의 배율을 조정하고 5 사진, 물론 각 사분면에서 하나의 중앙 부근에 1을가장자리에 너무 가까이있는 이미지를 복용. 물론 각각의 동일한 패턴을 따릅니다. </li><li> 이들 프로토콜에 따라 각 웰 (도 6A-C)에서 필드 당 침략 세포의 평균 수를 얻기 위해 각각의 이미지 셀의 수를 계산하기 위해 제조자의 프로그램을 사용한다. </li></ol>

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복막 미세 환경의의 Organotypic 모델은 난소 암의 보급에 미세 환경의 세포와 타고난 구성 요소를 모두의 개인 및 집단 기능 (들)을 평가하기 위해 설립되었다. 난소 암 세포 부착, 증식, 그리고 침략을 조사하기 위해 3 차원의 Organotypic 문화를 도금 및 사용자 정의에 대한 특정 프로토콜이 제공됩니다. 일차 인간 장간막 중피 세포 및 섬유 아세포는 환자로부터 분리 된 형태 및 정상 변이 환자를 보존 이른 통로에서 사용 하였다. 이 모델에서, 정상 대망 섬유 아세포 및 ECM (일반적으로 콜라겐 타입 I)는 기본 인간 중피 세포 단일 층으로 적층 하였다. 이 모델은 조직 학적으로는 복막 안감을 모방, 우리가 다시 난소 암 세포 부착, 증식 및 침입 8,27 포함 난소 암 전이의 주요 이벤트를 검사 할 수 있습니다. 이전 제한 3D 모델이이 3 차원의 Organotypic 모델은 복강의 중피 라이닝의 구조를 다시 제 반면, 미세 13...

난소암은 가장 치명적인 부인과 악성 종양입니다1. 대부분의 환자는 암이 복막강 전체로 퍼진 후에 진단을 받습니다. 일단 암이 복막강 전체로 퍼지면 종양축소 수술과 화학요법은 암 재발과 화학내성을 예방하기에 충분한 치료법이 되지 못하는 경우가 많아 5년 생존율이 30% 미만입니다. 난소암 전이는 주로 복막강에 국한되며, 위암, 췌장암, 대장암을 포함한 다른 여러 유형의 암은 복막강의 동일한 해부학적 부위로 전이됩니다. 일반적으로 난소암 세포는 나팔관 또는 원발성 난소 종양의 상피내암종에서 분리되어 복막액을 통해 단세포 또는 타원체로 이동하여 망막, 장 및 복벽의 중피가 늘어선 표면에 부착됩니다2. 
종양 미세환경은 많은 암에서 질병 진행과 화학 내성에 중요한 역할을 합니다3-6. 복막강(peritoneal cavity)은 중피 세포 단층이 표면의 대부분을 덮고 있는 독특한 미세환경입니다(그림 1A)7. 중피 내벽(mesothelial lining)은 마찰이 적은 표면을 만드는 장벽 역할을 하며, 이는 암세포 부착을 방지하는 경향이 있습니다8. 이 중피가 늘어선 표면 바로 아래에는 주로 섬유아세포와 세포외 기질(ECM)로 이루어진 층이 있는데, 이는 암세포 부착과 침입을 촉진합니다8. 난소암 세포는 중피 세포 내벽의 변화를 유도하는 인자를 분비하여 난소암 세포의 부착, 침입 및 전이를 강화합니다9,10. 난소암 세포는 인테그린(integrin)과 CD44 매개 기전을 통해 중피 표면에 부착됩니다(그림 1B)11-16. 
역사적으로 난소암과 미세환경의 상호작용을 조사하기 위해 여러 3D 모델이 개발되었습니다. 초기 모델 중 일부는 난소암-ECM 인터페이스17-21, 난소암-중피세포 소통13,14,21-24 또는 둘 다25를 연구했다(우리 검토 26). Niedbala 외. 난소암 세포가 중피 세포나 플라스틱만 단독으로 접착하는 것보다 ECM에 더 빠르고 확고하게 접착한다는 것을 발견했다25. 그러나 이러한 모델은 조직학적으로 복막 미세환경과 유사하지 않았습니다. 따라서 난소암 미세환경을 보다 철저하게 재현하기 위해 3D 조직형 모델을 구축했습니다. 난소암의 복막 파병에서 미세환경의 역할과 암과 복막 세포 간의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위해 우리는 복강강 내막의 3D 유기형 체외 배양 모델을 개발했습니다(그림 1C의 개략도). 제안된 모델은 1차 인간 섬유아세포와 ECM으로 구성되며, 1차 인간 중피 세포층으로 덮여 있으며, 각 세포 유형은 인간 망막에서 분리됩니다. 조직학적으로 이 모델은 정상 복막 또는 난소 내막과 유사하며, 종양 미세환경, 암세포와 정상 조직 간의 상호 작용, 암세포 부착, 침입 및 증식 과정을 연구할 수 있는 표면을 제공합니다8.

<table><tbody><tr><td><강한>1. 일차 세포의 분리 및 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001304</td><td></td></tr><tr><td>Single-edged razor</td><td>blade Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>15cm 배양 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>유리 플라스크</td><td>?</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000044_3616914956</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 함유 DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비타민</td><td>Corning</td><td>25-020-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>셰이커&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Forma 시리즈 II 워터 재킷 CO2 인큐베이터 모델 3100</td><td></td></tr><tr><td>트립신 EDTA, 1x (0.25%)</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Flasks</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>353136</tr><tr><td>T-175 Flasks</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips</td><td>Rainin</td><td>P2, P10, P20, P200 및 P1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 팁</td><td>Corning</td><td>필터 팁 P2, P10, P20, P200 및 P1000</td><td></td></tr><tr><td>시약/장비 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트/설명</td></tr><tr><td>2. 도금 3D 배양</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>Countess Countess</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10313</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I (Rat Tail)</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate, clear bottom, black</td><td>BD 생명과학</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>시약/장비 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>3. 접착 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipet</td><td>Eppendorf</td><td>Xplorer 300</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>Minimax</td><td></td></tr><tr><td>Name of Reagent/ Equipment</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트/설명</td></tr><tr><td>5. 침입 분석</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인서트(8um, 24-well)</td><td>BD Biosciences</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>Q-팁</td><td>면봉</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200m</td><td></td></tr><tr><td>세포 프로파일러</td><td>공개 도메인</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>시약/장비 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>6. 항체 </td>Anti-Integrin &alpha<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>; V&베타; 3 항체, clone LM609</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1976</td><td></td></tr><tr><td>Beta 1&nbsp;</td><td>Oncosynergy</td><td>OS2966</td><td></td></tr><tr><td>알파 5 [CD49e]</td><td>ID Pharmingen</td><td>555615</td><td></td></tr><tr><td>Beta 4 [CD104]</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB 2058</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 복강의의 organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

난소암 전이의 패턴은 혈액성으로 퍼지는 경우가 드물기 때문에 대부분의 다른 상피 종양과 현저히 다릅니다. 대신, 원발성 종양에서 박리된 난소암 세포는 복막액에 의해 복막강 내의 전이 부위로 운반됩니다. 이러한 부위, 특히 복복막과 망막은 중피가 늘어선 표면으로 덮인 기관입니다. 난소암 전파 과정을 조사하기 위해 우리는 시험관 내에서 복막강 내벽을 재구성하는 복잡한 3차원 배양 시스템을 조립했습니다. 1차 인간 섬유아세포와 중피 세포는 인간 망막에서 분리되었습니다. 그런 다음 섬유아세포를 세포외 기질과 혼합하고 1차 인간 중피 세포층으로 덮어 전이하는 난소암 세포가 직면하는 복막 및 난소 표면을 모방했습니다. 그 결과로 도출된 유기형 모델은 그림과 같이 암세포 부착, 침입 및 증식을 포함한 난소암 전파의 초기 단계를 조사하는 데 사용됩니다. 이 모델은 조기 난소암 전파에서 미세환경(세포 및 무세포)의 역할을 조사하기 위한 여러 연구에서 사용되었습니다. 또한 고처리량 스크리닝에 성공적으로 적용되었으며 난소암 전이 억제제를 식별하고 테스트하는 데 사용되었습니다.

배양의 Organotypic 제 콜라겐 타입 I과 차 인간 섬유 아세포를 혼합 한 다음 중피 세포의 5 배 번호 이것 문화를 오버레이하여 조립 하였다. 난소 암 세포 부착, 침입이나 확산을 연구하기 전에 첨가하고 배양은 적어도 18 시간 동안 인큐베이션 하였다. 각 분석은 다중 반복 하였다 (N = 5), 침윤 분석 (N = 3) (N = 3-5) 다른 환자 및 수많은 웰로부터 얻은 3D 배양 접착 각 조건에서 시험 하였다 (N = 5), 확산 . 4 시간 (그림 4) 후 3 차원의 Organotypic 문화에 부착 된 난소 암 세포는 72 시간 (6 시간 HeyA8 세포 배가 시간) (그림 5) 후 문화를 확산하고, 24 시간 (그림 6) 후 침공. HeyA8 난소 암 세포의 부착, 증식과 침윤 인테그린 - 의존성 (도 4-6)이었다. 즉, RGD 펩티드 및 antib 블로킹...

여기에서는 난소암 세포의 부착, 침습 및 증식을 조사하기 위한 도구로서 일차 인간 중피 세포와 세포외 기질로 층을 이룬 섬유아세포로 구성된 복막강 내막의 3차원 체외 모델을 구성하는 프로토콜을 제시합니다.

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

본 실험의 전반적인 목표는 복막 미세환경을 모방한 기관형 모델을 구축하여 난소암 생물학에 대한 이해를 높이는 것입니다. 이 방법은 암세포와 미세환경 사이의 상호작용이 질병의 발병 기전에 어떻게 기여하는지, 그리고 이러한 상호작용의 잠재적 억제제를 어떻게 테스트할 수 있는지와 같은 난소암 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복강 표면을 덮고 있는 중피를 형성하는 실제 인간 일차 세포를 난소암 세포 공동 배양에 사용한다는 점입니다.이 방법은 난소암에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 위암, 췌장암, 결장암과 같이 복강 전체로 전이되는 다른 암 연구에도 적용될 수 있습니다. 수술로 적출한 인체 그물막 표본을 획득하는 즉시 상온의 PBS에 담그십시오. 담근 후 2시간 이내에 그물막을 20 mL의 신선한 PBS가 들어 있는 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 일차 인체 중피세포(HPMC)와 적혈구가 포함된 나머지 PBS 세척액을 새로운 50 mL 원추형 튜브로 옮기고 원심 분리하여 세포를 침전시킵니다.그 다음 튜브의 내용물을 10 centimeter 멸균 배양 접시에 붓고, 두 개의 메스를 사용하여 조직을 5 cubic millimeter 크기의 조각으로 잘게 다집니다. 일차 인간 중피세포(HPMC)를 분리하기 위해, 대망 조각들을 50 milliliter 원심 분리 튜브로 옮기고 1분 동안 기다립니다. 고체 조각들이 위로 떠오르면, HPMC는 적혈구와 함께 튜브 바닥에 가라앉게 됩니다.피펫을 사용하여 중피세포와 적혈구가 포함된 PBS 세척액을 펠렛화된 세포가 들어 있는 튜브로 옮긴 후, 원심분리하여 세포를 가라앉힙니다. 그런 다음 그물망(omentum)에 20 milliliters의 신선한 PBS를 추가하고, HPMC와 RBC가 포함된 PBS를 수집하여 기존의 펠렛화된 세포에 추가하는 과정을 3회 더 반복합니다. 마지막 원심분리 후, 세포를 15 milliliters의 완전 성장 배지가 담긴 75 square centimeter 플라스크에 분주합니다.omentum 샘플에서 추가적인 HPMC를 분리하려면, 남은 고체 조직을 20 milliliters의 PBS에 넣고 200 RPM, 37 degrees Celsius에서 흔들어 줍니다. 10분 후, 고체 조직이 튜브 상단으로 떠오를 수 있도록 샘플을 1분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음, 앞서 시연한 것과 같이 튜브 바닥

modeling-early-steps-ovarian-cancer-dissemination-an-organotypic

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기에 설명된 mesothelial 통관 분석은 fluorescently 표시된 셀 및 촬영된 비디오 현미경 시각화하고 양적 난소암 다세포 spheroids 및 mesothelial 세포 monolayers의 상호 작용을 측정하기 위해 활용합니다. 이 분석은 난소 암 전이의 초기 단계를 모델.

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

이 비디오에서는 복막강 내막의 체외 3차원 모델 개발을 보여줍니다. 이 유기형 배양은 난소암 세포의 부착, 침입 및 증식을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

복강내막의 난소암 전이 모델링: 복막강 내막의 체외 3D 모델을 확립하는 방법

이 비디오에서는 난소 이식 내 난소암 집락화를 연구하기 위해 GFP 발현 난소암 세포와 겹쳐진 생체 외 난소 장기 배양을 확립합니다. 이 프로토콜은 전이를 촉진하는 유백색 반점(milky spot)으로 알려진 망막 내의 면역 세포 구조를 분석합니다.

Modeling Ovarian Cancer Cell Colonization of Omentum: An ex vivo method to establish Milky spot colonization of fluorescently labeled ovarian cancer cells in murine omentum explants(오멘텀의 난소암 세포 집락화 모델링: 쥐 오멘텀 외식에서 형광 표지된 난소암 세포의 밀키 스폿 집락화를 확립하기 위한 생체 외 방법)

복막의 중피 안감에 난소 암 세포의 침공은 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이다. 실시간 분석기를 활용 타원체-중피 세포 공동 배양 모델의 난소 암 세포의 침윤 능력은 전이 과정을 조절하는 인자에 대한 통찰력을 제공하고, 장기간의 시간주기에 걸쳐 정량화 될 수있다.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

우리는 복막 지방 조직, 특히 망막의 난소암 집락화를 연구하기 위해 생체 내 및 생체 외 접근 방식을 모두 구현하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 복막 지방의 전이를 촉진하는 유백색 반점(milky spots)으로 알려진 망막의 면역 세포 구조를 정량화하고 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 및 생체 외 복막 지방이에 밀키 스팟 구조의 난소 암 전이성 식민지를 연구하는 접근 방식

난소 암의 복막 보급의 다단계 과정을 명확히하기 위해, 본 연구는 이러한 종양 세포와 동 소성 접종을 통해 원래의 종양 개발 및 복막 전이의 쥐 실험 모델을 제시한다.

원래 종양 개발의 쥐 실험 모델 및 복막 전이<em&gt;를 통해</em난소 암 세포에&gt; 동소 이식 접종

생리 관련 모델에서 난소 종양의 진행을 연구하기 위해, 다세포 회전 타원체는 시뮬레이션 된 유체의 흐름에 따라 마이크로 디바이스에서 배양 하였다. 이 동적 3D 모델은 난소 암 전이가 발생 셀룰러 및 기계 부품과 복강 환경을 에뮬레이트합니다.

동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

이 프로토콜은 암세포-omentum 상호 작용의 3차원(3D) 생체 외 모델의 확립을 설명합니다. 이 모델은 지방 틈새 시장 내에서 종양 유발 기전을 규명하고 새로운 치료법을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내에서 고급 장액성 난소 암종(HGSOC) 마우스 모델의 개발을 자세히 설명합니다. 쥐 나팔관 오가노이드의 파생, 인간 HGSOC 유전학을 요약하기 위한 유전자 변형, 종양의 생체 내 발달을 위한 동계 마우스의 난소 활액낭에 도입.

고급 장액성 난소 암종 모델링을 위한 나팔관 상피 세포의 마우스 유래 오가노이드 라인 개발

배우세요 인간 복강의 장기형 모델 구축 방법을 통해 난소암 세포와 미세환경 간 상호작용을 연구하고 잠재적 억제제를 테스트하는 기술을 익히세요.

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

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