NMR에 의해 실시간 효소 반응 속도 측정을위한 해산 동적 핵 편광 계측

본 실험의 전반적인 목표는 동적 핵 분극 증강 핵자기공명(dynamic nuclear polarization enhanced nuclear magnetic resonance)을 통해 효소 공정을 실시간으로 추적하는 것입니다. 동적 핵 분극(DNP)으로 증강된 액체 상태의 자기공명은 다음과 같은 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 세포 내 또는 생체 내(in vivo)에서 한 쌍의 분자를 어떠한 방식으로도 변경하지 않고 이 분자 쌍의 효소 전환 속도를 어떻게 결정할 것인가 하는 점입니다. 저희 실험실에 용해 DNP(dissolution DNP) 장비를 설치하고, 로잔의 Arnaud Comment 실험실에서 박사 학위를 취득한 Riccardo Balzan 박사가 합류하게 된 것은 저희 연구에 있어 큰 진전입니다.

DNP는 500 megahertz NMR 분광계에서 수행할 수 있는 실험의 민감도를 현저하게 향상시킵니다. 이 DNP 장비는 프랑스에 최초로 설치된 장비이며, 이 장비를 정상적으로 작동시키기 위해 NMR 팀의 모든 구성원이 참여했음을 밝히고 싶습니다. 특히 연구 엔지니어인 Gildas Bertho와 maitre de conferences인 Fatiha Kateb의 공로를 언급하고 싶습니다. 이 기술의 주요 장점은 기질과 그 내인성 유도체를 초 단위의 시간 분해능으로 직접 실시간 정량화할 수 있다는 점입니다.

편극 용액을 위해, 탄소 13 관찰용으로 중수와 중수성 에탄올을 2:1 부피비로 혼합하고 33 millimolar의 TEMPO 라디칼이 도핑된 1.12 molar의 탄소 13 표지 피루브산 나트륨 용액 2 milliliters를 준비합니다. 크라이오스탯 소프트웨어 인터페이스에서 cooldown 버튼을 클릭하여 냉각 절차를 통해 동적 핵 편극(dynamic nuclear polarization, DNP) 크라이오스탯의 온도를 낮춥니다. 충전 절차를 통해 DNP 크라이오스탯에 액체 헬륨을 수집합니다.

크라이오스탯 소프트웨어 인터페이스의 filling 버튼을 클릭하십시오. 그런 다음 DNP 편광기와 함께 제공된 시료 용기에 최적화된 편광 용액 300 µL를 넣으십시오. 시료가 들어 있는 시료 용기를 액체 질소 조에 천천히 담가 동결시키십시오.

동결 절차 후 시료 용기에 남아 있을 수 있는 액체 질소를 제거하기 위해, 시료 용기를 액체 질소 조에서 꺼내어 거꾸로 회전시킵니다. 다음으로, 먼저 시료 용기를 시료 홀더에 삽입하여 시료를 크라이오스탯(cryostat)에 넣습니다. 그런 다음 마이크로파 도파관을 시료 홀더에 삽입하기 전에 시료 홀더를 메인 크라이오스탯 인서트에 배치합니다.

1 Kelvin 냉각 절차를 시작하여 크라이오스탯 온도를 낮춥니다. 크라이오스탯 소프트웨어 인터페이스에서 1 Kelvin 냉각 버튼을 클릭합니다. 마이크로파 소스를 켜고, 크라이오스탯 소프트웨어 인터페이스에서 마이크로파 켬 버튼을 클릭하여 샘플에 조사합니다.

커넥터를 시계 반대 방향으로 90도 회전시킨 후 당겨서 NMR 콘솔 검출 채널의 동축 케이블을 분광계 코일에서 분리하십시오. 검출 채널의 동축 케이블을 크라이오스탯 NMR 코일의 동축 커넥터에 연결하십시오. 그런 다음, 방향 핀(orientation pin)에 유의하며 NMR 콘솔 케이블의 수커넥터를 크라이오스탯 NMR 코일의 암커넥터에 삽입하십시오.

커넥터를 90도 방향으로 시계 방향으로 강하게 밀어 회전시킵니다. 보정되지 않은 낮은 flip angle 펄스를 5분 간격으로 반복하는 단순 pulse-acquire 시퀀스를 사용하여 cryostat 위치에서 고체 상태의 NMR 열 신호를 측정합니다. 측정을 설정한 후, 소프트웨어의 커맨드 라인에 zg를 입력하고 키보드의 enter 키를 누릅니다.

분극 절차를 시작한 후, 열적 신호 측정에 사용된 것과 동일한 절차 및 조건으로 고체 상태에서 DNP 강화 NMR 신호를 측정하십시오. 커넥터를 반시계 방향으로 90도 회전시켜 당겨서 NMR 콘솔 검출 채널 동축 케이블을 크라이오스탯 NMR 코일에서 분리하십시오. 그런 다음 검출 채널의 동축 케이블을 분광계 코일의 동축 커넥터에 연결하십시오.

방향 핀에 주의하며 NMR 콘솔 케이블의 수커넥터를 분광계 코일의 암커넥터에 삽입하십시오. 커넥터를 단단히 밀어 넣은 후 시계 방향으로 90도 회전시킵니다. 20 µg/mL bovine serum albumin이 포함된 반응 버퍼를 사용하여 1 U/mL 농도의 토끼 근육 LDH 용액을 새로 조제하십시오.

다음으로 반응 버퍼 478 µL, LDH 용액 2 µL, 그리고 분광계 필드 안정화(또는 락킹)를 위한 중수 20 µL를 혼합합니다. 그 후, 500 µL의 용액을 5 mm NMR 튜브에 넣습니다. 전송 튜브를 과분극 용액을 전송에 사용된 헬륨 가스로부터 분리하는 자동 맞춤형 주입 장치에 연결합니다.

장치는 500 µL의 과분극 용액을 샘플 튜브로 자동 주입합니다. 용해 전, 500 µL의 샘플이 담긴 5 mm NMR 튜브를 11.74 T NMR 분광계의 등중심점에 배치하십시오. 용해 인서트 보일러에 5 mL의 중수소를 치환한 물을 넣으십시오.

크라이오스탯 소프트웨어 인터페이스에서 prepare heater 버튼을 클릭하여 저항 와이어를 통해 중수(deuterated water)를 가압하고 가열하여 온도가 약 180~200 °C에 도달하도록 합니다. 크라이오스탯 소프트웨어 인터페이스에서 SS Operations 버튼을 클릭하십시오. 그런 다음 용해 인서트에서 마이크로파 가이드를 제거하십시오.

용출 인서트를 샘플 홀더 아래로 밀어 넣습니다. 용출 인서트는 샘플 홀더 바닥에 닿아야 하며, 중수(deuterated water)가 크라이오스탯으로 누출되는 것을 방지하기 위해 샘플 컨테이너와 누설 없는 연결이 되도록 단단히 밀어 넣어야 합니다. 하드웨어 트리거를 눌러 공압 밸브 작동의 미리 정해진 시간 시퀀스인 용출 시퀀스를 시작합니다.

용해 직후, 주입 장치는 500 µL의 과분극 용액을 NMR 분광계에 배치된 시료와 혼합합니다. 용해 후, 기질과 생성물의 자화 진행 과정을 추적하기 위해 1.5초 간격으로 10도 플립 각도 펄스-획득 시퀀스를 연속적으로 적용하여 분광계 내 시료로부터 NMR 과분극 신호를 측정합니다. 측정을 설정한 후, 소프트웨어의 명령줄에 zg를 입력하고 엔터를 누릅니다.

자화가 완전히 이완되면, 약 3T1에 해당하는 약 3분 간격의 90도 플립 각도 펄스-획득 시퀀스 시리즈를 통해 NMR 열 신호를 측정합니다. 측정을 설정한 후, 소프트웨어의 명령줄에 zg를 입력하고 엔터 키를 누릅니다. 여기에서 반복적인 10도 플립 각도 펄스로부터 얻은 스펙트럼의 시간 경과는 이 기술의 민감도와 시간 분해능을 보여줍니다.

피루브산 기질과 젖산 생성물의 피크 식별 후, 대사산물의 신호 적분을 통해 정량을 수행합니다. 효소 활성은 선형 모델 피팅을 통한 생성물 신호의 시간 경과 분석으로 결정합니다. 측정값을 검증하기 위해, 생성물과 기질의 신호 비율로부터 초기 반응 속도를 계산하여 동일한 양을 평가합니다.

숙련된 경우, 적절하게 수행한다면 효소 활성의 전체 측정은 약 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 NMR을 위해 고분극 기질을 생성하고, 이를 효소가 포함된 용액에 주입하며, DNP 강화 NMR을 사용하여 효소 활성을 추적하는 방법에 대해 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도할 때는 신선한 효소와 공동 기질로 효소 용액을 세심하게 준비하고, 시료 튜브 내에 기포가 생기지 않도록 하는 것이 중요합니다.

액체 상태의 DNP 강화 자기공명 기술의 발전으로, 이제 연구자들은 생성물 형성 속도를 측정함으로써 다양한 유형의 세포 내 기질 섭취 및 그 효소적 변환을 탐구할 수 있게 되었습니다. 극저온 장비와 고자기장을 다루는 것은 매우 위험할 수 있음을 유의하십시오. 이러한 측정을 수행하는 동안에는 극저온 냉매에 대한 개인 보호구 착용 및 자성 물체의 부재 확인과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

전형적인 NMR과 달리, 용해 DNP 기반 NMR은 기질과 현재의 기술 수준에 따라 실험 시간 윈도우가 최대 수 분으로 제한됩니다. 이는 1차원 분광법 이상의 단계로 나아가는 데 걸림돌이 됩니다. 용해 DNP NMR이 전형적인 다차원 NMR 수준의 다재다능함을 갖추기 위해서는 추가적인 발전이 필요합니다.