Name: 생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9 매개 단일대립유전자 삭제 기술을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 전사 조절을 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 기능적 게놈학 및 줄기 세포 다능성 연구에 활용됩니다.

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유익한 토론을 해주신 Mitchell 연구실의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research), 캐나다 혁신 재단(Canada Foundation for Innovation) 및 온타리오 연구 혁신부(Ontario Ministry of Research and Innovation)의 지원을 받았습니다(JAM이 보유한 운영 및 인프라 보조금).

<ol><li>Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+long-range+cis-regulatory+module+causes+complete+loss+of+limb-specific+Shh+expression+and+truncation+of+the+mouse+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb.</a> Development. 132 (4), 797-803 (2005).</li>
<li>Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+gene+control+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range gene control and genetic disease.</a> Adv Genet. 61, 339-388 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.</a> Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+identification+in+mouse+embryonic+stem+cells+using+integrative+modeling+of+chromatin+and+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features.</a> BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
<li>Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid-specific%2C+developmental-stage-independent+enhancer+far+upstream+of+the+human+%27beta-like+globin%27+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).</li>
<li>Amano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+dynamics+at+the+Shh+locus%3A+limb+bud-specific+differential+regulation+of+competence+and+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription.</a> Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
<li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genomic+deletion+efficiency+mediated+by+clustered+regularly+interspaced+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCas9+nuclease+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li>
<li>Mlynarczyk-Evans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosomes+alternate+between+two+states+prior+to+random+X-inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation.</a> PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+base+mispairs+by+Taq+DNA+polymerase%3A+implications+for+single+nucleotide+discrimination+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).</li>
<li>Keane, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+variation+and+its+effect+on+phenotypes+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation.</a> Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).</li>
<li>Yalcin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-based+characterization+of+structural+variation+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome.</a> Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

저자는 이해 충돌에 조브의 정책을 읽고 공개 충돌이 더이 없다.

CRISPR / Cas9 매개 게놈 편집 기술은 게놈 수정에 대한 간단 빠르고 저렴한 방법을 제공한다. 기능 증강 특성에 대한 monoallelic 증강 삭제를 생성하고 분석하기 위해 여기에 설명 된 방법은 F1 마우스 세포에서 SNP를 활용합니다. 이러한 유형의 접근법의 이점은 : 1) monoallelic 인핸서 삭제가 중요한 증강제, 즉 두 대립 유전자에서 치사 셀에 이르는 조절 유전자의 단백질 수준에서 큰 감소를 삭제하거나 변경 될 때 발생하는 교란 효과를 생성하지 표현형; 2) monoallelic 삭제 주파수가 동형 접합 결실을 얻기 어렵다 낮은 경우; 그러나, 유전자 발현 분석에서의 대립 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 하나는 monoallelic 결실 클론을 분석 할 수있다; 3) monoallelic 삭제를 선별 프라이머의 4 세트를 사용하면 혼동 부분 또는 대형 삭제를 포함하는 클론의 제거를 허용다운 스트림 분석. 대립 유전자 특이 적 프...

전사 조절 요소에 의한 비정상적인 유전자 발현이 질병을 초래할 수있다 이러한 요소 개발 1 변형시 유전자 발현 시공간 미세 조정이 중요하다. 게놈 넓은 협회 연구에 의해 확인 된 많은 질병 관련 지역 비 코딩 지역에 있고 전사 증강 3-4의 기능을 가지고 있습니다. 강화제를 파악하고 그들이 자주 몇 킬로베이스 거리가 조절하는 유전자의 위치와 조직 - 특이 적 방식으로 5-6으로 활성화 될 수 있으므로 복잡 조절하는 유전자로 일치. 증강 예측은 일반적으로 히스톤 수정 마크, 중재자-cohesin 단지를 기반으로 세포 유형 특정 전사의 결합은 7-10 요인 있습니다. 예측 증강의 유효성 검사는 가장 자주 인핸서는 리포터 유전자 11 ~ 12의 발현을 활성화하는 벡터 기반의 분석을 통해 이루어집니다. 이러한 데이터는 V를 제공추정 인핸서 서열의 규제 가능성에 대한 aluable 정보는하지만 자신의 내생 게놈 맥락에서 그 기능을 공개하거나 조절하는 유전자를 식별하지 않습니다. 게놈 편집 기능 상실 분석에 의해 자신의 내생 적 맥락에서 전사 조절 인자의 기능을 연구하는 강력한 도구 역할을한다. 게놈 편집, 즉 CRISPR / Cas9 게놈 편집 시스템의 최근의 진보는, 게놈 기능의 조사를 용이하게한다. CRISPR / Cas9 시스템은 많은 생물학적 시스템에 사용하기 쉽고 적용 할 수 있습니다. Cas9 단백질 가이드 RNA (gRNA) (13)에 의해 게놈의 특정 사이트를 대상으로합니다. SpCas9 / gRNA 단지는 protospacer 인접 모티브 (PAM) 시퀀스, NGG 14 ~ 15에 &#39;5이어야 목표 게놈 시퀀스의 게놈을 스캔합니다. 목표에 gRNA의 gRNA에 상보적인 20 뉴클레오티드 (NT) 시퀀스의 염기쌍는 doubl 결과 SpCas9 클레아 활동을 활성화전자 가닥 브레이크 (DSB)가 PAM 시퀀스의 상류 3 염기쌍. 특이도가 gRNA 종자 지역의 전체 염기 쌍을 통해 달성되면, 6-12은 PAM에 인접한 NT; 반대로, 종자의 보통 16-17을 허용하는 &#39;5 불일치. 가입 비 동종 말 (NHEJ)의 DNA 수리 또는 상동 감독 수리 (HDR) mechanisms.NHEJ의 DNA 수리가 종종 방해 할 수있는 대상 사이트에서 몇 bp의 삽입 / 삭제 (삽입과 삭제)을 작성 중 하나를 소개 DSB는 복구 할 수 있습니다 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF). 관심 영역의 측면 게놈 두 gRNAs에서 큰 결실을 생성하기 위해, 18 ~ 19을 사용할 수있다. 이 접근법은 궤적 제어 영역 또는 종래 증진제 9,18,20-22보다 큰 수퍼 증강제로 클러스터 전사 인핸서의 연구에 유용하다. Monoallelic 삭제는 전사의 시스 -regulation 연구를위한 귀중한 모델입니다. 관찰 장증강의 monoallelic 삭제 후 성적 수준에서 전자는 두 대립 유전자의 전사가 세포 적합성에 영향을 미치는 잠재적 영향을 때 발생할 수있는 혼란 효과없이 유전자 조절에서 해당 증강의 역할에 상관 관계. 감소 된 발현을 평가하기 그러나, 야생형 대립 유전자에서 삭제를 구별하는 능력없이 어렵다. 또한, 두 개의 대립 유전자를 구별하는 능력없이 각 대립 유전자의 결실을 유전형 특히이 PCR에 의해 전체 야생형 영역을 증폭하기 어렵다되는 1 메가 23&gt; 10킬로바이트 큰 결실에 대한 도전이다. 뮤스 castaneus으로 건너 뮤스의 musculus (129)에 의해 생성 된 F1 ES 세포의 사용은 두 가지 대립 유전자가 대립 유전자 특이 PCR 18,24에 의해 구별 할 수 있습니다. 이러한 세포의 하이브리드 유전자는 대립 유전자 특정 삭제 검사 및 발현 분석을 용이하게한다. 평균적으로이 두 게놈 사이의 모든 125 BP는 SNP에게있다, 표현과 유전자형에 대한 프라이머 설계 유연성을 제공하는 분석한다. 하나의 SNP의 존재는 프라이머 융해 온도 (Tm)에 영향을 미치는 두 대립 (25)의 식별을 허용 실시간 정량 PCR (qPCR에) 증폭 특이성을 타겟팅 할 수있다. 또한, 프라이머의 3 &#39;말단 내의 불일치 크게 원하지 대립 타겟 (26)의 증폭을 방지 프라이머로부터 연장하는 DNA 폴리머 라 아제의 능력에 영향을 미친다. CRISPR / Cas9 게놈 편집 시스템 (도 1)를 사용하여보다 큰 1킬로바이트의 특정 대립 유전자 인핸서 삭제 이후 발현 분석 F1 ES 세포의 사용은 다음의 프로토콜에 설명한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> 시스 -reg을 연구하는 CRISPR / Cas9를 사용하여 그림 1. 증강 삭제유전자 발현의 위험률. 뮤스의 musculus 129 뮤스 castaneus 사이의 교차에 의해 생성 (A) F1 ES 세포는 대립 유전자 특정 삭제를 허용하는 데 사용됩니다. (B)는 두 개의 RNA를 가이드 (gRNA)는 인핸서 영역의 큰 Cas9 매개 결실을 유도하기 위해 사용된다. (C) 프라이머 세트가 많은 모노 - 및 이중 대립 유전자 결실을 식별하는 데 사용된다. 오렌지 프라이머 내부 프라이머이며, 보라색 프라이머는 외부 프라이머 및 녹색 프라이머는 gRNA 측면 프라이머되어 있습니다. 유전자 발현의 (D)의 변화는 대립 유전자 특정 qPCR에를 사용하여 모니터링됩니다. RFU 상대 형광 단위를 의미한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>gRNA 어셈블리에 사용되는 고충실도 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>타겟 염기서열을 이 벡터에 클로닝하여</td></tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>Codon에 최적화된 SpCas9 및 EGFP pCas9_GFP gRNA plasmid를 생성합니다. 동시 발현 플라스미드</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>네온 형질주입 시스템 100 &마이크로; L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Microporator 형질주입 기술</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>게놈 DNA 추출 시약</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>고속 플라스미드 미니 키트</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>맥시 플라스미드 키트 내독소 무료&nbsp;</td><td></td> CFX Life Technologies 4472942 qPCR 시약용 Geneaid <td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 선택 믹스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>역전사 시약</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin with EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS without Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA fraction V (7.5%)</td><td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Max Efficiency DH5&alpha; competent cells</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ES cell 인증</td><td></td><td>FBS는 마우스 ES 세포에서 다능성</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential aminoacid</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>밀봉 테이프</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>무알코올 세포 동결 용기</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>F1 ES 세포 배양을 위한 억제제</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>F1 ES 세포 배양을 위한</td></tr><tr><td>억제제 LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>F1 ES 세포 배양을 위한 억제제</td></tr></tbody></table>

생성 crispr은 / cas9 중재 monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers는 위치 및 방향에 독립적인 방식으로 조직 특이적 유전자 발현을 조절하여 세포 정체성을 제어합니다. 이러한 인핸서(enhancer)는 종종 유전자 간 영역(intergenic region)에서 조절되는 유전자로부터 멀리 떨어져 있거나 심지어 다른 유전자의 몸체 내에 위치합니다. 인핸서 활성의 위치 독립적 특성으로 인해 인핸서를 조절하는 유전자와 일치시키는 것이 어렵습니다. 인핸서 영역의 결실은 인핸서 활성에 대한 직접적인 증거를 제공하며 내인성 유전자 전사에서 인핸서의 역할을 밝히는 황금 표준입니다. 기존의 상동 재조합 기반 결실 방법은 최근 게놈 편집 기술의 발전으로 능가되어 수많은 모델 유기체의 게놈에 대한 빠르고 정확한 위치 변경을 가능하게 합니다. CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집은 맞춤형 발현 플라스미드의 가이드 RNA에 의해 Cas9을 게놈으로 쉽게 표적화할 수 있기 때문에 많은 세포 유형 및 유기체의 게놈을 빠르고 비용 효율적으로 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 필수 유전자 조절 요소의 동형접합적 결실은 치사를 유발하거나 세포 표현형을 변화시킬 수 있는 반면, 전사 강화제의 단일대립유전자 결실은 이러한 혼란스러운 문제 없이 유전자 발현의 시스 조절을 연구할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 F1 마우스 배아 줄기(ES) 세포(Mus musculus129 x Mus castaneus)에서 CRISPR/Cas9 매개 결실에 대한 프로토콜입니다. 단일대립유전자 결실, 스크리닝 및 발현 분석은 두 대립유전자 사이의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 의해 촉진되며, 이 세포에서 평균 125bp마다 발생합니다.

여기에 설명 된 프로토콜 CRISPR / Cas9 게놈 편집 (도 1)를 이용하여 생성 monoallelic 인핸서 삭제 세포에서 유전자 발현의 시스 -regulation 공부 F1 ES 세포를 사용한다. 유전자형 유전자 발현의 gRNA 및 대립 유전자 특이 적 프라이머를 디자인이 방법에서 중요한 요소이다. 각 대립 유전자 특이 프라이머 세트는 대립 유전자 특이성을 확인하는 qPCR에 의해 검증되어야합니다. 그들의 각각의 게놈 DNA 목표를 증폭 대립 유전자 특이 적 프라이머 (그림 2)에 이상적이다. 이상적으로 이러한 프라이머는 3 &#39;끝에 SNP가 있습니다. 그들이 잘못 유전자형 25 대 정확한 그들의 증폭 5 코네티컷 값 차이의 최소 표시하면 이하 대립 유전자 - 특이 프라이머가 사용될 수있다. 이상 5 &#39;말단에서 3에서 4 번째 염기보다&#39;...

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

본 절차의 전반적인 목표는 대립유전자 특이적 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 마우스 배아줄기세포의 유전자 전사 조절을 연구하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 하이브리드 게놈을 사용하여 단일 대립유전자 결실을 생성하고 분석한다는 점입니다. 이를 통해 생존 가능성이 낮을 수 있는 단일 대립유전자 강화 결실을 분석해야 할 필요성을 제거합니다.이 방법은 기능 유전체학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 특정 인핸서가 어떤 유전자를 조절하는지, 그리고 해당 유전자의 활성이 특정 인핸서 하나에 얼마나 의존하는지 등이 있습니다. 이 방법은 줄기세포 다능성에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 시스템에도 적용 가능합니다.예를 들어, 이는 줄기세포가 뉴런, 혈구 또는 근육으로 분화하여 운명이 어떻게 바뀌는지 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 사용할 가이드 RNA(gRNA)의 서열을 설계, 구축 및 확인한 후, 엔도톡신 제거 플라스미드를 ES 세포에 형질전환할 준비를 합니다. 원심분리기를 사용하여 1.5 milliliter 튜브에 Mus musculus 129와 Mus castaneus를 교배하여 생성한 1×10⁶개의 F1 배아줄기세포를 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다.원심분리 후 상층액을 제거하고 키트 제조사에서 제공한 재부유 버퍼 100 µL를 추가합니다. 표적 DNA 영역을 결실시키려면 P Cas9 GFP 5-prime 및 3-prime gRNA 플라스미드를 각각 5 µg씩 추가합니다. 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 마이크로포레이터의 전자 피펫 팁을 사용하여 전기천공 혼합액 100 µL를 흡입하되, 팁 내부에 공기가 들어가지 않도록 주의하십시오. 그 후, 피펫을 트랜스펙션 장치에 연결하십시오.적절한 프로토콜을 선택하고 시작 버튼을 누르십시오. 전기천공법이 진행되는 동안 팁을 관찰하십시오. 설정이 올바르게 되었다면, 튜브 전극에서 작은 기포가 발생해야 합니다.스파크가 발생하면 공기 방울이 존재한다는 것을 나타내며, 이는 트랜스펙션을 방해합니다. 이러한 현상이 발생할 경우, 새로운 세포 배치를 사용하여 전기천공법을 반복해야 합니다. 전기천공법 후, 트랜스펙션된 세포를 10 mL의 ES 세포 배지가 담긴 10 cm 젤라틴 코팅 디쉬에 분사하십시오.형질전환된 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 48시간 후, 유세포 분석기를 사용하여 cast nine GFP 양성 ES 세포를 분류 및 분리합니다. 그 다음, 10 mL의 ES 세포 배지가 들어 있는 10 cm 젤라틴 코팅 디쉬에 1~1.5 × 10⁴개의 GFP 양성 세포를 분주합니다.이와 같이 낮은 밀도로 플레이팅하면 개별 ES 세포 콜로니를 분리하기가 용이해집니다. 4~5일 후, 현미경을 사용하여 구형의 개별 ES 세포 콜로니를 식별하십시오. 피펫을 사용하여 각 콜로니를 젤라틴으로 전처리하고 30 µL의 tripsom이 포함된 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.모든 콜로니를 피킹하여 배지에서 해리시킨 후, 대부분의 웰이 70% 이상의 합쳐짐(confluence) 상태가 될 때까지 이산화탄소 배양기 내 37°C에서 세포를 배양합니다. 이 과정은 보통 약 2일이 소요됩니다. 세포를 분할할 준비가 되면, 배지를 제거하고 30 µL의 tripsom을 첨가합니다.세포를 5분 동안 배양합니다. 그 다음, 각 웰에 트립신을 중화시키기 위해 180 µL의 ES 세포 배지를 첨가합니다. 피펫으로 상하 분주하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.각 웰에서 70 µL를 웰당 130 µL의 ES 세포 배지가 들어 있는 젤라틴 코팅된 세 개의 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 37 °C에서 배양합니다. 플레이트의 합쳐짐 정도(confluency)가 70~85%에 도달하면, 다음 섹션에서 설명하는 대로 각 클론의 유전자형 분석 및 발현 분석을 수행하는 데 사용합니다.동반 문서에 설명된 대로 세포 스톡을 동결하십시오. 여기에서는 원하는 결실이 일어났는지 클론을 스크리닝하기 위해 네 세트의 프라이머를 설계합니다. 여기에는 내부 프라이머, 외부 프라이머, 그리고 5-prime 및 3-prime gRNA 타겟 사이트 모두를 위한 gRNA 인접 프라이머가 포함됩니다.여기에 표시된 웹사이트를 방문하여 129 및 Cas 유전형에 해당하는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism) 또는 snip 트랙을 확보하는 것으로 시작하십시오. 이 링크는 Mitchell Lab CRISPR 웹페이지로 연결됩니다. 해당 페이지에서 제공된 링크를 클릭하십시오.해당 사이트는 MM-9 마우스 게놈 어셈블리 내의 129 및 Cas 게놈 사이의 snip을 표시하는 트랙이 포함된 UCSC 게놈 브라우저로 리디렉션됩니다. 다음으로, 삭제할 영역의 좌표를 입력하고 "go"를 클릭하십시오. 원하는 삭제 부위의 중앙에서 snip이 3개 이상 포함된 약 500 base pairs 영역으로 확대하십시오.SNP가 적은 경우 대립유전자 특이적 프라이머 설계가 까다로울 수 있습니다. 완전한 대립유전자 특이적 프라이머를 설계하는 것이 불가능한 경우에는 부분적 대립유전자 특이적 프라이머를 사용할 수 있습니다. 다만, qPCR 결과 분석 시 결실 클론과 비결실 클론 간의 CT 값을 비교해야 함을 유의하십시오.이제 상단 패널에서 "View"를 클릭하십시오. 드롭다운 메뉴에서 DNA를 선택하십시오. "Get DNA in Window" 페이지가 나타납니다.서열 서식 옵션에서 전체 대문자를 선택한 다음, Get DNA를 클릭하여 대상 서열을 전체 대문자 형식으로 표시합니다. 이 서열을 복사하여 Word 문서 파일에 붙여넣으십시오. 그런 다음, 해당 서열을 129 cast snip 트랙과 비교하여 snip 위치를 강조 표시하고 129 snips를 소문자로 표시하십시오.129 서열 작업을 완료한 후, 이를 복사하여 fasta 형식의 서열 두 개를 생성하십시오. 하나는 129용이고 다른 하나는 Cas용입니다. Cas 서열에서는 각 snip 위치에 정확한 염기를 대입하고, 해당 snip을 소문자로 표시하십시오.다음으로, 해당 서열에 대응하는 게놈인 129 또는 Cas로 라벨을 붙입니다. 그런 다음, 브라우저에 Primer3Plus 주소를 입력하십시오. 적절한 영역에 snip이 치환된 129 서열을 붙여넣으십시오.기본 설정을 사용하여 프라이머를 설계하십시오. 내부 대립유전자 특이적 프라이머를 설계하려면 Task 오른쪽의 드롭다운 메뉴를 클릭하여 Primer List를 선택한 다음 Pick Primers를 클릭하십시오. 정방향 및 역방향 프라이머 목록이 표시되는 새 페이지가 열립니다.선택 상자를 확인하여 3-프라임 말단 또는 3-프라임 말단으로부터 4개 염기 이내에 소문자로 표시된 snip이 있는 정방향 또는 역방향 프라이머를 선택하십시오. 3-프라임 말단에 snip이 있는 프라이머는 qPCR 중에 대립유전자 특이성이 증가함을 유의하십시오. 화면 하단의 "Send to Primer3 Manager"를 클릭하십시오.선택한 프라이머가 표시되는 새 페이지가 열립니다. 두 번째 프라이머를 선택하려면 프라이머 목록 페이지로 돌아가고, 뒤로 가기 버튼을 클릭하여 메인 페이지로 돌아가십시오. 작업 드롭다운 메뉴에서 Detection을 선택하십시오.메인 페이지가 새로고침되면 하단에 좌측 및 우측 프라이머 서열 입력 상자가 나타납니다. 첫 번째 프라이머 서열을 해당 상자에 붙여넣으십시오. 다음으로, Main 탭 옆에 있는 General Settings 탭으로 이동하여 산물 크기 범위(product size range) 설정을 80에서 200 base pairs로 변경하십시오."Pick Primers"를 클릭합니다. 첫 번째 프라이머 서열에 대해 가능한 다섯 가지 프라이머 쌍을 표시하는 페이지가 열립니다. 프라이머 왼쪽의 확인란을 체크하여 프라이머 쌍 목록에서 프라이머 세트를 선택하고 화면 하단의 "Send to Primer3 Manager"를 클릭합니다. 이것들이 129 내부 대립유전자 특이적 프라이머가 됩니다.이 단계들을 반복하여 cast 대립유전자를 위한 프라이머를 설계하십시오. 그런 다음, 이 기술을 외부 대립유전자 특이적 프라이머 및 비대립유전자 특이적 프라이머 설계에 적용하십시오. 마지막으로, 동봉된 문서에 기술된 대로 qPCR을 사용하여 프라이머의 대립유전자 특이성을 테스트하십시오.이전에 준비한 96-well 플레이트에서 genomic DNA를 추출합니다. 플레이트를 짧게 원심분리하여 well 바닥에 맺힌 응결수를 가라앉힙니다. 이 DNA는 결실 스크리닝을 위한 템플릿으로 사용됩니다.다음으로, 384-well 플레이트에서 각 클론에 대해 qPCR을 수행하고 중복 실험을 진행합니다. 2단계 PCR을 수행한 후 검출 기능을 포함한 멜팅 커브 분석을 실시합니다. 런이 완료되면, 먼저 내부 대립유전자 특이적 프라이머를 사용하여 각 대립유전자의 증폭 여부를 확인합니다.한쪽 대립유전자가 증폭되지 않거나 대립유전자 간의 CT 값 차이가 5 사이클 이상인 경우, 해당 클론들이 이형접합 결손(heterozygous deletion)을 가지고 있음을 시사합니다. 두 대립유전자 모두 증폭되지 않는 것은 동형접합 결손(homozygous deletion)을 가지고 있음을 시사합니다. 다음으로, 외부 대립유전자 특이적 프라이머를 사용하여 각 대립유전자의 증폭 여부를 확인하십시오.표적 결실 크기가 1 KB보다 큰 경우, 외부 프라이머를 이용한 증폭은 결실이 존재할 때만 일어납니다. CT 값이 22에서 28 사이이면 결실이 확인된 것입니다. 표적 결실 크기가 1 KB보다 작은 경우에는 전기영동을 통해 앰플리콘 크기를 확인하십시오.대립유전자 특이적 내부 프라이머를 사용하여 qPCR로 결실 클론의 96-웰 플레이트를 스크리닝하였습니다. 회색 막대는 Cas 특이적 프라이머로부터, 검은색 막대는 129 특이적 프라이머로부터의 증폭을 나타냅니다. 내부 프라이머에서 낮은 CT 값이 나타나거나 증폭이 일어나지 않는 것은 표적 결실을 의미합니다.하나 또는 두 대립유전자에 결실이 있는 클론을 외부 프라이머로 스크리닝합니다. 외부 프라이머를 이용한 증폭을 통해 결실 여부를 확인합니다. 단일 대립유전자 결실이 있는 클론의 경우, gRNA 표적 부위 양옆의 프라이머를 사용하여 결실되지 않은 대립유전자에 인델(indels)이라 불리는 삽입 또는 결실이 없는지 확인합니다.삭제되지 않은 대립유전자의 표적 부위에 큰 인델(indel)이 없는 단일 대립유전자 클론만을 후속 발현 분석에 사용합니다. 여기에는 129 또는 Cas SCR 삭제 클론의 대표적인 결과가 제시되어 있습니다. SCR은 ES 세포에서 최근에 기술된 Sox2 특이적 인핸서입니다.빨간색 막대는 Sox2 Cas 대립유전자의 발현을 나타내고, 파란색 막대는 Sox2 129 대립유전자의 증폭을 나타냅니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, 129 또는 Cas 대립유전자의 SCR 결손은 CIS에서의 Sox2 발현을 감소시켰습니다. 이 영상을 시청한 후에는 CRISPR 기술을 사용하여 대규모 결손을 생성하는 방법과 대립유전자 특이적 프라이머를 사용하여 결손된 클론의 유전자형을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

generating-crisprcas9-mediated-monoallelic-deletions-to-study

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

이 프로토콜 설계 및 다중화 비활성화 융해 단백질 SID4X-dCas9-리아로 알려진 또한 증강 간섭 (증강 인자-i)와 강화의 대상으로 수행 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜 유전자 발현을 조절 하는 강화의 식별을 가능 하 게 일반적인 대상 유전자 규제 강화 간의 관계의 해 부를 촉진 한다.

증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

이 논문은 CRISPR/Cas9 시스템과 세 가지 표현형 기반 스크리닝 전략을 사용하여 중심체 관련 단백질-E(CENP-E) 녹아웃 세포의 구축을 보고합니다. 당사는 CENP-E 녹아웃 세포주를 활용하여 약물 개발 및 생물학 연구에 유용한 CENP-E 억제제의 특이성과 독성을 검증하기 위한 새로운 접근법을 확립했습니다.

CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout 세포주 생성

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

배우세요 CRISPR/Cas9 매개 단일대립유전자 삭제 기술을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 전사 조절을 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 기능적 게놈학 및 줄기 세포 다능성 연구에 활용됩니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

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