생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

본 절차의 전반적인 목표는 대립유전자 특이적 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 마우스 배아줄기세포의 유전자 전사 조절을 연구하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 하이브리드 게놈을 사용하여 단일 대립유전자 결실을 생성하고 분석한다는 점입니다. 이를 통해 생존 가능성이 낮을 수 있는 단일 대립유전자 강화 결실을 분석해야 할 필요성을 제거합니다.

이 방법은 기능 유전체학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 특정 인핸서가 어떤 유전자를 조절하는지, 그리고 해당 유전자의 활성이 특정 인핸서 하나에 얼마나 의존하는지 등이 있습니다. 이 방법은 줄기세포 다능성에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 시스템에도 적용 가능합니다.

예를 들어, 이는 줄기세포가 뉴런, 혈구 또는 근육으로 분화하여 운명이 어떻게 바뀌는지 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 사용할 가이드 RNA(gRNA)의 서열을 설계, 구축 및 확인한 후, 엔도톡신 제거 플라스미드를 ES 세포에 형질전환할 준비를 합니다. 원심분리기를 사용하여 1.5 milliliter 튜브에 Mus musculus 129와 Mus castaneus를 교배하여 생성한 1×10⁶개의 F1 배아줄기세포를 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다.

원심분리 후 상층액을 제거하고 키트 제조사에서 제공한 재부유 버퍼 100 µL를 추가합니다. 표적 DNA 영역을 결실시키려면 P Cas9 GFP 5-prime 및 3-prime gRNA 플라스미드를 각각 5 µg씩 추가합니다. 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.

기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 마이크로포레이터의 전자 피펫 팁을 사용하여 전기천공 혼합액 100 µL를 흡입하되, 팁 내부에 공기가 들어가지 않도록 주의하십시오. 그 후, 피펫을 트랜스펙션 장치에 연결하십시오.

적절한 프로토콜을 선택하고 시작 버튼을 누르십시오. 전기천공법이 진행되는 동안 팁을 관찰하십시오. 설정이 올바르게 되었다면, 튜브 전극에서 작은 기포가 발생해야 합니다.

스파크가 발생하면 공기 방울이 존재한다는 것을 나타내며, 이는 트랜스펙션을 방해합니다. 이러한 현상이 발생할 경우, 새로운 세포 배치를 사용하여 전기천공법을 반복해야 합니다. 전기천공법 후, 트랜스펙션된 세포를 10 mL의 ES 세포 배지가 담긴 10 cm 젤라틴 코팅 디쉬에 분사하십시오.

형질전환된 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 48시간 후, 유세포 분석기를 사용하여 cast nine GFP 양성 ES 세포를 분류 및 분리합니다. 그 다음, 10 mL의 ES 세포 배지가 들어 있는 10 cm 젤라틴 코팅 디쉬에 1~1.5 × 10⁴개의 GFP 양성 세포를 분주합니다.

이와 같이 낮은 밀도로 플레이팅하면 개별 ES 세포 콜로니를 분리하기가 용이해집니다. 4~5일 후, 현미경을 사용하여 구형의 개별 ES 세포 콜로니를 식별하십시오. 피펫을 사용하여 각 콜로니를 젤라틴으로 전처리하고 30 µL의 tripsom이 포함된 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.

모든 콜로니를 피킹하여 배지에서 해리시킨 후, 대부분의 웰이 70% 이상의 합쳐짐(confluence) 상태가 될 때까지 이산화탄소 배양기 내 37°C에서 세포를 배양합니다. 이 과정은 보통 약 2일이 소요됩니다. 세포를 분할할 준비가 되면, 배지를 제거하고 30 µL의 tripsom을 첨가합니다.

세포를 5분 동안 배양합니다. 그 다음, 각 웰에 트립신을 중화시키기 위해 180 µL의 ES 세포 배지를 첨가합니다. 피펫으로 상하 분주하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.

각 웰에서 70 µL를 웰당 130 µL의 ES 세포 배지가 들어 있는 젤라틴 코팅된 세 개의 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 37 °C에서 배양합니다. 플레이트의 합쳐짐 정도(confluency)가 70~85%에 도달하면, 다음 섹션에서 설명하는 대로 각 클론의 유전자형 분석 및 발현 분석을 수행하는 데 사용합니다.

동반 문서에 설명된 대로 세포 스톡을 동결하십시오. 여기에서는 원하는 결실이 일어났는지 클론을 스크리닝하기 위해 네 세트의 프라이머를 설계합니다. 여기에는 내부 프라이머, 외부 프라이머, 그리고 5-prime 및 3-prime gRNA 타겟 사이트 모두를 위한 gRNA 인접 프라이머가 포함됩니다.

여기에 표시된 웹사이트를 방문하여 129 및 Cas 유전형에 해당하는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism) 또는 snip 트랙을 확보하는 것으로 시작하십시오. 이 링크는 Mitchell Lab CRISPR 웹페이지로 연결됩니다. 해당 페이지에서 제공된 링크를 클릭하십시오.

해당 사이트는 MM-9 마우스 게놈 어셈블리 내의 129 및 Cas 게놈 사이의 snip을 표시하는 트랙이 포함된 UCSC 게놈 브라우저로 리디렉션됩니다. 다음으로, 삭제할 영역의 좌표를 입력하고 "go"를 클릭하십시오. 원하는 삭제 부위의 중앙에서 snip이 3개 이상 포함된 약 500 base pairs 영역으로 확대하십시오.

SNP가 적은 경우 대립유전자 특이적 프라이머 설계가 까다로울 수 있습니다. 완전한 대립유전자 특이적 프라이머를 설계하는 것이 불가능한 경우에는 부분적 대립유전자 특이적 프라이머를 사용할 수 있습니다. 다만, qPCR 결과 분석 시 결실 클론과 비결실 클론 간의 CT 값을 비교해야 함을 유의하십시오.

이제 상단 패널에서 "View"를 클릭하십시오. 드롭다운 메뉴에서 DNA를 선택하십시오. "Get DNA in Window" 페이지가 나타납니다.

서열 서식 옵션에서 전체 대문자를 선택한 다음, Get DNA를 클릭하여 대상 서열을 전체 대문자 형식으로 표시합니다. 이 서열을 복사하여 Word 문서 파일에 붙여넣으십시오. 그런 다음, 해당 서열을 129 cast snip 트랙과 비교하여 snip 위치를 강조 표시하고 129 snips를 소문자로 표시하십시오.

129 서열 작업을 완료한 후, 이를 복사하여 fasta 형식의 서열 두 개를 생성하십시오. 하나는 129용이고 다른 하나는 Cas용입니다. Cas 서열에서는 각 snip 위치에 정확한 염기를 대입하고, 해당 snip을 소문자로 표시하십시오.

다음으로, 해당 서열에 대응하는 게놈인 129 또는 Cas로 라벨을 붙입니다. 그런 다음, 브라우저에 Primer3Plus 주소를 입력하십시오. 적절한 영역에 snip이 치환된 129 서열을 붙여넣으십시오.

기본 설정을 사용하여 프라이머를 설계하십시오. 내부 대립유전자 특이적 프라이머를 설계하려면 Task 오른쪽의 드롭다운 메뉴를 클릭하여 Primer List를 선택한 다음 Pick Primers를 클릭하십시오. 정방향 및 역방향 프라이머 목록이 표시되는 새 페이지가 열립니다.

선택 상자를 확인하여 3-프라임 말단 또는 3-프라임 말단으로부터 4개 염기 이내에 소문자로 표시된 snip이 있는 정방향 또는 역방향 프라이머를 선택하십시오. 3-프라임 말단에 snip이 있는 프라이머는 qPCR 중에 대립유전자 특이성이 증가함을 유의하십시오. 화면 하단의 "Send to Primer3 Manager"를 클릭하십시오.

선택한 프라이머가 표시되는 새 페이지가 열립니다. 두 번째 프라이머를 선택하려면 프라이머 목록 페이지로 돌아가고, 뒤로 가기 버튼을 클릭하여 메인 페이지로 돌아가십시오. 작업 드롭다운 메뉴에서 Detection을 선택하십시오.

메인 페이지가 새로고침되면 하단에 좌측 및 우측 프라이머 서열 입력 상자가 나타납니다. 첫 번째 프라이머 서열을 해당 상자에 붙여넣으십시오. 다음으로, Main 탭 옆에 있는 General Settings 탭으로 이동하여 산물 크기 범위(product size range) 설정을 80에서 200 base pairs로 변경하십시오.

"Pick Primers"를 클릭합니다. 첫 번째 프라이머 서열에 대해 가능한 다섯 가지 프라이머 쌍을 표시하는 페이지가 열립니다. 프라이머 왼쪽의 확인란을 체크하여 프라이머 쌍 목록에서 프라이머 세트를 선택하고 화면 하단의 "Send to Primer3 Manager"를 클릭합니다. 이것들이 129 내부 대립유전자 특이적 프라이머가 됩니다.

이 단계들을 반복하여 cast 대립유전자를 위한 프라이머를 설계하십시오. 그런 다음, 이 기술을 외부 대립유전자 특이적 프라이머 및 비대립유전자 특이적 프라이머 설계에 적용하십시오. 마지막으로, 동봉된 문서에 기술된 대로 qPCR을 사용하여 프라이머의 대립유전자 특이성을 테스트하십시오.

이전에 준비한 96-well 플레이트에서 genomic DNA를 추출합니다. 플레이트를 짧게 원심분리하여 well 바닥에 맺힌 응결수를 가라앉힙니다. 이 DNA는 결실 스크리닝을 위한 템플릿으로 사용됩니다.

다음으로, 384-well 플레이트에서 각 클론에 대해 qPCR을 수행하고 중복 실험을 진행합니다. 2단계 PCR을 수행한 후 검출 기능을 포함한 멜팅 커브 분석을 실시합니다. 런이 완료되면, 먼저 내부 대립유전자 특이적 프라이머를 사용하여 각 대립유전자의 증폭 여부를 확인합니다.

한쪽 대립유전자가 증폭되지 않거나 대립유전자 간의 CT 값 차이가 5 사이클 이상인 경우, 해당 클론들이 이형접합 결손(heterozygous deletion)을 가지고 있음을 시사합니다. 두 대립유전자 모두 증폭되지 않는 것은 동형접합 결손(homozygous deletion)을 가지고 있음을 시사합니다. 다음으로, 외부 대립유전자 특이적 프라이머를 사용하여 각 대립유전자의 증폭 여부를 확인하십시오.

표적 결실 크기가 1 KB보다 큰 경우, 외부 프라이머를 이용한 증폭은 결실이 존재할 때만 일어납니다. CT 값이 22에서 28 사이이면 결실이 확인된 것입니다. 표적 결실 크기가 1 KB보다 작은 경우에는 전기영동을 통해 앰플리콘 크기를 확인하십시오.

대립유전자 특이적 내부 프라이머를 사용하여 qPCR로 결실 클론의 96-웰 플레이트를 스크리닝하였습니다. 회색 막대는 Cas 특이적 프라이머로부터, 검은색 막대는 129 특이적 프라이머로부터의 증폭을 나타냅니다. 내부 프라이머에서 낮은 CT 값이 나타나거나 증폭이 일어나지 않는 것은 표적 결실을 의미합니다.

하나 또는 두 대립유전자에 결실이 있는 클론을 외부 프라이머로 스크리닝합니다. 외부 프라이머를 이용한 증폭을 통해 결실 여부를 확인합니다. 단일 대립유전자 결실이 있는 클론의 경우, gRNA 표적 부위 양옆의 프라이머를 사용하여 결실되지 않은 대립유전자에 인델(indels)이라 불리는 삽입 또는 결실이 없는지 확인합니다.

삭제되지 않은 대립유전자의 표적 부위에 큰 인델(indel)이 없는 단일 대립유전자 클론만을 후속 발현 분석에 사용합니다. 여기에는 129 또는 Cas SCR 삭제 클론의 대표적인 결과가 제시되어 있습니다. SCR은 ES 세포에서 최근에 기술된 Sox2 특이적 인핸서입니다.

빨간색 막대는 Sox2 Cas 대립유전자의 발현을 나타내고, 파란색 막대는 Sox2 129 대립유전자의 증폭을 나타냅니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, 129 또는 Cas 대립유전자의 SCR 결손은 CIS에서의 Sox2 발현을 감소시켰습니다. 이 영상을 시청한 후에는 CRISPR 기술을 사용하여 대규모 결손을 생성하는 방법과 대립유전자 특이적 프라이머를 사용하여 결손된 클론의 유전자형을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.