배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

이 절차의 전반적인 목표는 뇌 기형 장애에 대한 새로운 후보 유전자를 식별하고 생체 내에서 그 원인 역할을 직접 확인하는 것입니다. 이 전략은 뇌 발달 및 상관 병리학과 관련된 분자 경로를 발견함으로써 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 전략의 주요 장점은 뇌 질환과 관련된 새로운 유전자를 발견하고 새로운 진단 도구를 개발하는 데 도움이 된다는 것입니다.

이 접근법을 사용하여 우리는 비정상적인 신경 세포 이동으로 인한 뇌 기형인 뇌실 주위 결절성 이형증(periventricular nodular heterotopia)의 발병기전에서 C6orf70 유전자의 결정적인 기여를 밝힐 수 있었습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 엔지니어인 Fabienne Schaller가 맡을 것입니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 그리고 기관 및 국가 지침에 따라 절차를 위해 E15 임신 쥐를 준비합니다.

동물이 적절하게 마취되었는지, 눈에 안과 연고가 바르는지, 복부를 적절하게 면도 및 소독했는지 확인하십시오. 날카로운 가위를 사용하여 피부와 꼬리 복부 근육 정중선을 2cm 수직으로 절개한 후 복강에서 자궁 뿔 하나를 조심스럽게 노출시킵니다. 섭씨 37도의 예열 생리식염수를 적가하여 배아에 수분을 공급합니다.

시술 내내 자궁을 촉촉하게 유지하십시오. DNA를 주입하려면 머리에 쉽게 접근할 수 있는 배아를 한 손에 부드럽게 잡습니다. 그런 다음 다른 손을 사용하여 마이크로 인젝터에 연결된 유리 모세관을 정중선에서 1mm, 2-3mm 깊이에 위치한 좌측 측심실에 조심스럽게 삽입합니다.

마이크로인젝터를 사용하여 약 1마이크로리터의 DNA에 빠른 녹색을 주입하여 주입을 육안으로 모니터링할 수 있습니다. DNA를 세포에 전기천공하려면 먼저 3 x 7mm 전극 표면에 생리식염수를 떨어뜨립니다. 그런 다음 주입된 쪽에 양극을 놓고 주입되지 않은 우심실에 음극을 놓습니다.

발 제어 페달을 사용하여 950밀리초 간격으로 5개의 전기 펄스를 전달합니다. 전기천공법 후 자궁 뿔을 복강으로 되돌리고 무균 식염수를 추가하여 배아가 더 자연스럽게 위치할 수 있도록 하고 수술 중 체액 손실을 설명합니다. 흡수성 수술용 봉합사로 근육벽을 봉합한 다음 간단한 단속 스티치를 사용하여 피부를 봉합합니다.

최대 48시간 동안 또는 기관 지침에 명시된 대로 수술 후 진통제를 제공합니다. 쥐를 깨끗한 집 우리로 되돌려 놓고 마취에서 나올 때까지 모니터링하십시오. 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 4%파라포름알데히드로 뇌를 고정한 후 PBS에서 10분 동안 세척합니다.

세탁하는 동안 PBS에 50ml의 4% 한천을 준비하여 용해된 아가로스의 온도가 섭씨 50도를 초과하지 않도록 합니다. 아가로스를 플라스틱 임베딩 틀에 붓고 뇌를 아가로스에 넣습니다. 내장된 뇌를 섭씨 4도에 놓고 아가로스가 최소 한 시간 동안 중합되도록 합니다.

아가로스가 뇌 주위에서 여분의 아가로스를 중합한 후, 뇌의 전방 후방 접근이 블레이드에 수직이 되도록 하여 뇌를 비브라톰 베이스 플레이트에 붙입니다. 접착제가 마를 때까지 몇 분 동안 기다린 후 접착된 뇌가 있는 플레이트를 비브라톰 챔버에 넣습니다. 비브라톰을 PBS로 채우고 100미크론 두께의 섹션을 자르기 시작합니다.

절편 후 절편을 현미경 슬라이드로 옮기고 과도한 액체를 제거합니다. 그런 다음 장착 매체 몇 방울을 추가하고 섹션 위에 커버 슬립을 놓습니다. 밤새 말리십시오.

레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 10배 배율을 사용하여 단면을 이미지화합니다. 이미지를 분석하려면 먼저 정량적 이미지 분석에 적합한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 8비트로 변환합니다. 그런 다음 하나의 대표적인 GFP 양성 형광 세포를 선택하고 추정치를 클릭하고 자유 손 선택 도구를 사용하여 세포의 경계를 그려 모양을 수동으로 정의합니다.

소프트웨어는 셀의 직경과 강도 임계값을 자동으로 유지합니다. find cells(세포 찾기)를 클릭하면 소프트웨어가 피질 전체에 걸쳐 형질주입된 세포를 국소화할 수 있습니다. 그런 다음 필요한 경우 가양성을 수동으로 제거합니다.

피질의 전체 두께를 개별 섹션에서 정규화 된 8 개의 관심 영역으로 나누고, 영역 도구를 클릭하고, 8 개의 줄무늬 1과 8 줄무늬는 각각 심실 영역과 피질 판의 상단에 해당합니다. 다음으로, 적용을 클릭하여 소프트웨어가 전체 피질에서 GFP 형질 주입된 세포의 상대적 위치를 계산할 수 있도록 합니다. 마지막으로 수량 저장(Save quantification)을 클릭하여 분석을 위해 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다.

어레이 CGH 및 전체 엑솜 염기서열분석을 통해 C6orf70이 발달 유전자 이상에 대한 후보 유전자로 확인되었습니다. 정량적 PCR은 PHF10 및 DLL1과 함께 이 유전자가 쥐의 대뇌 피질에서 발현되는 것을 확인했습니다. 다음 이미지는 녹색 형광 단백질 구조체를 단독으로 사용하거나 C6orf70 코딩 서열을 표적으로 하는 shRNA와 결합하거나 상대적으로 비효율적인 불일치 구조체와 결합하여 전기천공을 한 후 E20 쥐 뇌의 대표적인 신피질 관상 절편을 보여줍니다.

필라멘트 A knock down은 손상된 신경 세포 이동을 제어하기 위해 사용되었습니다. C6orf70 또는 Filament A를 표적으로 하는 shRNA를 사용한 자궁 내 전기천공법은 흰색 화살표로 표시된 바와 같이 심실 영역 내에서 GFP 양성 세포의 정지를 유도한 반면, GFP를 단독으로 발현하거나 불일치 구조체와 조합하여 발현하는 세포는 신경 세포 이동을 변경하지 않았습니다. 이 절차를 시도하는 동안 신경 세포 증식, 이동 또는 성숙 중 어떤 피질 발생 상태를 분석하고자 하는지 염두에 두는 것이 중요합니다.

설치류 배아 뇌에서 자궁 내 전기천공술을 수행하는 방법을 배우려면 오랜 훈련 기간, 기술 및 정기적인 연습이 필요하다는 것을 잊지 마십시오.