배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

본 절차의 전반적인 목표는 뇌 기형 질환의 새로운 후보 유전자를 식별하고, 생체 내(in-vivo)에서 이들의 인과적 역할을 직접 확인하는 것입니다. 이러한 전략은 뇌 발달 및 관련 병리와 연관된 분자 경로를 발견함으로써 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 전략의 주요 장점은 뇌 질환과 관련된 새로운 유전자를 발견하고 새로운 진단 도구를 개발하는 데 기여한다는 점입니다.

이러한 접근 방식을 통해 우리는 비정상적인 신경세포 이동으로 인해 발생하는 뇌 기형인 뇌실주위 결절성 이소증의 병인에서 C6orf70 유전자의 결정적인 기여를 밝힐 수 있었습니다. 실험 절차 시연은 저희 실험실의 엔지니어인 Fabienne Schaller가 맡겠습니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로, 그리고 기관 및 국가 지침에 따라 E15 임신 쥐를 준비하십시오.

동물이 적절히 마취되었는지, 안구에 안연고가 도포되었는지, 그리고 복부가 적절히 제모 및 소독되었는지 확인하십시오. 날카로운 가위를 사용하여 미측 복부 중앙선의 피부와 근육에 2 cm 길이의 수직 절개를 가한 후, 복강에서 자궁각 하나를 조심스럽게 노출시킵니다. 배아에 수분을 공급하기 위해 37 °C로 예열된 생리식염수를 한 방울씩 떨어뜨려 적용하십시오.

시술 전 과정 동안 자궁을 촉촉하게 유지하십시오. DNA를 주입하려면, 한 손으로 배아의 머리 부분이 쉽게 접근 가능하도록 부드럽게 잡습니다. 그런 다음, 다른 손을 사용하여 마이크로인젝터에 연결된 유리 모세관을 중앙선에서 1mm 떨어져 있고 깊이 2~3mm 지점에 위치한 좌측 뇌실에 조심스럽게 삽입합니다.

주입 과정을 시각적으로 모니터링할 수 있도록 fast green이 포함된 DNA 약 1µL를 마이크로인젝터를 사용하여 주입하십시오. 세포 내로 DNA를 전기천공하기 위해, 먼저 3x7mm 전극 표면에 생리식염수를 떨어뜨립니다. 그 다음, 양극 전극을 주입된 쪽에, 음극 전극을 주입되지 않은 우심실에 배치하십시오.

발판 스위치를 사용하여 950 millisecond 간격으로 5회의 전기 펄스를 전달합니다. 전기천공법 시행 후, 자궁각을 복강 내로 되돌려 놓고 멸균 식염수를 첨가하여 배아가 더 자연스럽게 배치되도록 하고 수술 중 발생한 체액 손실을 보충합니다. 흡수성 외과용 봉합사로 근육벽을 봉합한 다음, 단순 결절 봉합법을 사용하여 피부를 봉합합니다.

최대 48시간 동안 또는 기관 가이드라인에 따라 수술 후 진통제를 투여하십시오. 쥐를 깨끗한 홈 케이지로 옮기고 마취에서 깰 때까지 모니터링하십시오. 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 뇌를 4%paraformaldehyde로 고정한 후, PBS로 10분 동안 세척하십시오.

세척하는 동안, 용해된 agarose의 온도가 50 °C를 초과하지 않도록 주의하며 PBS 내 4% agarose 50 mL를 준비합니다. agarose를 플라스틱 임베딩 몰드에 붓고 뇌 조직을 agarose 안에 넣습니다. 임베딩된 뇌 조직을 4 °C에 두고 agarose가 최소 1시간 동안 중합되도록 합니다.

아가로스가 중합되면 뇌 주변의 과잉 아가로스를 잘라내고, 뇌의 전후축이 칼날과 수직이 되도록 뇌를 바이브라톰 베이스 플레이트에 접착합니다. 접착제가 마를 때까지 몇 분간 기다린 후, 뇌가 접착된 플레이트를 바이브라톰 챔버에 넣습니다. 바이브라톰에 PBS를 채우고 100 micron 두께의 절편을 슬라이싱하기 시작합니다.

절편 제작 후, 절편을 현미경 슬라이드로 옮기고 과잉 액체를 제거합니다. 그런 다음 봉입제를 몇 방울 떨어뜨리고 절편 위에 커버슬립을 덮습니다. 하룻밤 동안 건조시킵니다.

레이저 주사 공초점 현미경의 10배 배율을 사용하여 절편을 촬영하십시오. 이미지를 분석하려면, 먼저 정량적 이미지 분석을 위한 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 8비트로 변환하십시오. 그 다음, 대표적인 GFP 양성 형광 세포 하나를 선택하고, estimate를 클릭한 후 프리핸드 선택 도구를 사용하여 세포의 경계를 그려 세포의 모양을 수동으로 정의하십시오.

소프트웨어가 세포의 직경과 강도 임계값을 자동으로 유지합니다. 'find cells'를 클릭하여 소프트웨어가 피질 전반에서 형질전환된 세포를 국소화하도록 합니다. 그 다음, 필요한 경우 위양성(false positives)을 수동으로 제거하십시오.

영역 도구(region tool)를 클릭하고 8개의 영역 스트라이프(region stripes)를 선택하여 피질의 전체 두께를 개별 섹션에서 정규화된 8개의 관심 영역으로 나눕니다. 이때 스트라이프 1과 8은 각각 뇌실대(ventricular zone)와 피질판(cortical plate)의 상단에 해당합니다. 다음으로, 적용(apply)을 클릭하여 소프트웨어가 전체 피질 내 GFP 형질전환 세포의 상대적 위치를 계산하도록 합니다. 마지막으로, 정량화 저장(save quantification)을 클릭하여 분석을 위한 Excel 파일로 데이터를 내보냅니다.

Array CGH 및 전엑좀 시퀀싱을 통해 C6orf70이 발달 유전자 이상과 관련된 후보 유전자로 확인되었습니다. 정량적 PCR 분석 결과, 이 유전자는 PHF10 및 DLL1과 함께 쥐의 대뇌 피질에서 발현되는 것으로 나타났습니다. 다음 이미지들은 녹색 형광 단백질 컨스트럭트 단독, 또는 C6orf70 코딩 서열을 표적으로 하는 shRNA 또는 상대적으로 효과가 없는 미스매치 컨스트럭트와 함께 전기천공법을 시행한 지 5일 후 E20 쥐 뇌의 대표적인 신피질 관상 단면을 보여줍니다.

신경세포 이동 장애의 대조군으로 Filament A 넉다운을 사용하였습니다. C6orf70 또는 Filament A를 표적으로 하는 shRNA를 이용한 자궁 내 전기천공법은 흰색 화살표로 표시된 바와 같이 GFP 양성 세포가 뇌실 구역 내에 정지하도록 유도한 반면, GFP만 발현하거나 미스매치 컨스트럭트와 함께 발현하는 세포는 신경세포 이동에 영향을 주지 않았습니다. 이 절차를 수행할 때는 신경세포의 증식, 이동 또는 성숙 중 어떤 피질 생성 단계를 분석하고자 하는지 유념하는 것이 중요합니다.

설치류 배아 뇌의 자궁 내 전기천공법(in-utero electroporation) 수행법을 익히기 위해서는 장기간의 교육 기간과 숙련도, 그리고 지속적인 연습이 필요하다는 점을 유의하십시오.