Name: 배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 배우세요 뇌 기형 관련 후보 유전자를 식별하고 생체 내에서 인과적 역할을 확인하는 방법을 배열 CGH와 전체 exome 시퀀싱, 그리고 설치류 자궁 내 전기천공 기법을 활용하여 신경생물학 연구에 활용하세요.

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우리 박사 G. McGillivray 감사 홍보 제이 클레이튼-스미스, 홍보 P. Striano, 홍보 즉 Scheffer, 홍보 S.P. Roberston, 홍보 W.B. Dobyns 상승할 환자를 제공 하기 위한 홍보 김포 Berkovic. 우리 기술 조언 및 도움에 대 한 박사 F. 미셸과 디 메이 감사합니다. 이 작품은 EU의 7 프레임 워크 프로그램에서 자금에 의해 지원 되었다 욕망 프로젝트, 계약 번호: 건강-F2-602531-2013 년 (V.C., 립에 아칸소, A.F. 및 참조), INSERM (아칸소를 참조), Fondation 제롬 Lejeune (A.F, E.P.P 및 많은 R13083AA)와 지구의 프로방스 알프 코트 다쥐르 (APO2014-DEMOTIC 참조 및 A.A.D) D.A.K EMBO 젊은 수 사관 이며 뒷받침 FWF 부여 (I914 및 P24367).

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저자는 공개 없다.

MCDs는 지적 장애 및 약물 내성 유년기 간 질1,2의 20-40 %의 중요 한 원인이 있습니다. MCDs에 관심 두 가지 주요 요인으로 인해 지난 10 년 동안 극적으로 증가 했다. 첫 번째는 개선 의사와 과학자는 이전 인식 하지 많은 두뇌 기형의 시각화 하을 수 있는 이미징 (특히 MRI) 두뇌에서. 다른 많은 소설 상승할 원인이 유전자의 id 허용 유전 도구의 발전 이다. 이것은 크게 기초 두뇌 개발 및 기능, 그리고 더 정확한 유전 상담에 대 한 허용 하는 메커니즘의 우리의 지식을 향상.
과거에는, 연구원은 나중 단계에 두뇌 개발에 그들의 역할을 명확 하 게 기능적인 분석 실험의 디자인을 떠나 원인 유전자 식별에 주로 그들의 노력을 집중. 이 메서드는 의무가 찾는 어떤 전통적인 유전자에 대 한 보다 일반적인 산발적 장애, 재발 성 유전 질환의 연구에서 진행으로 인해 ...

대뇌 피 질 인지, 지적 프로세스에서 중요 한 역할 이며 참여 감정 컨트롤, 학습 및 메모리. 그것은 따라서 놀라운 많은 신경 및 정신 질환에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형 발생 하지입니다. MCD의 병 인 모두 인수 이후 복잡 한 이며 유전적 요인 관련. MCD의 유전자 결정된 비율의 누적 보급은 약 2% 이며 대부분의 경우에서 산발적. 예를 들어, 선 천 성 뇌 dysgenesis의 발생률은 인간의 인구에 1% 보다 높은 것으로 추정 하 고 MCD의 일부 형태의 간 질을 가진 모든 환자의 14% 이상에 고 심한 또는 다루기 어려워 간 질1, 의 40%에서 관찰 된다 2.
뇌 결 Heterotopia (PNH) 가장 일반적인 MCDs 중 하나 이며 발전 대뇌 피 질에 심 실 영역 (VZ)에서 신경 세포의 비정상적인 이동에 의해 발생 합니다. 마이그레이션 결과 클러스터에는 일반적으로 자기 공명 영상 (MRI)를 사용 하 여 구상 될 수 있다 측면 뇌 실 벽을 따라 heterotopic 뉴런의 신경의 실패. PNH의 임상, 해부학 및 이미징 기능 유형이 다른 있습니다. 혹 양측을 대칭 작고 일방적인에서 범위 수 있습니다. 일반적인 임상 sequelae 포함 간 질과 지적 장애3. Xq28에 지도, Filamin A (또는 FLNA) 유전자에 돌연변이 산발적 환자3,4의 26%에서 양측 PNH X 연결 된 가족의 100%에 발견 했다. 20q13에 지도 하는 ARFGEF2 유전자에 있는 돌연변이 기인한 PNH의 희귀, 열성 형태 두 consanguineous 가족5에 보고 되었습니다. 최근, biallelic 돌연변이 유전자 DCHS1 및 FAT4 수용 체 ligand cadherin 쌍을 인코딩 PNH6을 포함 하는 multisystemic 장애에 의해 영향을 받는 9 환자에서 확인 되었습니다. PNH 또한 연관 되어 연약한 X 증후군7, 윌리엄스 증후군8, 22q11 microdeletion 증후군9, 5 p 1510중복, 삭제 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 및 6q 터미널 삭제 증후군14,15,,1617,18,19, 추가 원인 유전자 흩어져 있습니다 제안 전체 게놈. 그러나, 약 74%의 산발적 PNH 환자에 대 한 유전으로 해명된17수 남아 있습니다.
그러나 고아 한 유전자 매핑 접근 배열 비교 Genomic 교 잡 (배열 CGH) 입증 하위 미세한 염색체 이상,,이 접근을 사용 하 여 식별 하는 게놈 영역 검출을 위한 강력한 도구와 같은 종종 큰 많은 유전자를 포함 하 고.
대규모 병렬 시퀀싱 기술 (즉, 전체 Exome 시퀀싱 (WES) 그리고 전체 게놈 시퀀싱 (WGS))의 출현은 실질적으로 비용 및 전체 인간의 exome 또는 게놈을 시퀀싱 하는 데 필요한 시간이 감소 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 웨스와 WGS 데이터의 해석 데이터 필터링에서 각 환자 수만 수백 (또는 수천, 분석의 유형에 따라) 변종 등장에 대 한 이후 대부분의 경우에 도전 남아 있습니다.
소설 상승할 원인이 유전자, 배열 CGH를 결합 하 여 새로운 체계적인 전략을 식별의 과정을 속도를, 후보 유전자의 웨스와 utero에서 electroporation (IUE) 심사 설계 되었습니다. IUE 있게 선택적으로 비활성화 (또는 overexpress) 특정 유전자 돌연변이 설치류 두뇌에 corticogenesis18,19에 있는 그들의 관련의 급속 한 평가 사용 합니다. RNAi 중재 최저 또는 하나 이상의 후보 유전자의 overexpression 발생할 유전자 관련 질병 개발, 신경 마이그레이션 또는 성숙에 지역화 된 결함은 예상 된다. 누구의 비활성화 (또는 overexpression) 재현 설치류에 환자에서 관찰 표현 형 유전자의 식별에 따라 상승할 산발적 인 환자에서 심사에 대 한 뛰어난 후보 된다. 우리 최근 환자 6q27 염색체 삭제16오 병 인 PNH에 C6orf70 유전자 (일컬어 ERMARD)의 중요 한 기여를 밝혀이 접근을 사용 하 여.

<table><tbody><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corp</td><td>P/N 051-0500-900</td><td>세포 내 미세주입 디스펜스 시스템</td></tr><tr><td>패스트 그린 FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>패스트 그린 주사의 시각적 모니터링 가능</td></tr><tr><td>BTX ECM 830 전기천공기</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td>ECM 830은 in vitro 및 in vivo 애플리케이션을</td></tr> <tr><td>위해 설계된 구형파 펄스 발생기입니다.Microtome HM 650 V</td><td>Microm</td><td>10076838</td><td>Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz(진동 블레이드 포함</td></tr><tr><td>) FluoView 300</td><td>Olympus</td><td></td><td>Olympus FluoViewTM 300은 생물학 연구 응용 분야용으로 설계된 포인트 스캔, 포인트 감지, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경입니다</td></tr>. <tr><td>eCELLence 소프트웨어</td><td>Glance Vision Technologies</td><td></td><td>eCELLence는 세포 이동의 정량 분석을 위해 설계된 소프트웨어입니다</td></tr><tr><td>1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K 또는 8 x 15K용</td> 애<td>질런</td>트 마이크로어레이 <td></td> 번들 어레이 슬라이드 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K 또는 8 x 60K용 애질런트 애질런트 p/G2565BA <td></td>G2565CA G4900DA</tr><tr><td></td><td></td><td>n G4900DA 또는 G2565CA</td><td></td></tr><tr><td>하이브리드화 챔버, 스테인리스</td><td>애질런트</td> 애<td>질런트 p/n G2534A</td><td>어레이 CGH 하이브리드화</td></tr><tr><td></td><td></td>용 챔버 <td></td><td></td></tr><tr><td>혼성화 챔버 개스킷 슬라이드, 어레이용 5팩</td><td></td><td></td><td>개스킷 1팩 마이크로어레이용 CGH 하이브리드화</td></tr><tr><td>또는</td><td>2</td>팩 마이크로어레이용 <td>Agilent p/n G2534-60003</td><td></td></tr><tr><td>또는</td><td>4</td>팩 마이크로어레이용 <td>Agilent p/n G2534-60002</td><td></td></tr><tr><td>또는</td><td>8</td>팩 마이크로어레이<td>용 Agilent p/n G2534-60011</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Agilent p/n G2534-60014</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G2545A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 마이크로어레이 혼성화 챔버용 하이브리드화 오븐 회전자</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G2530-60029</td><td></td></tr><tr><td>가열식 뚜껑이 있는 열 순환기</td><td>Agilent</td><td>Agilent p/n G8800A 또는 동급의</td> 인<td>큐베이션용 Termal cycler</td></tr><tr><td>1.5mL RNase-free Microfuge Tube</td><td>Ambion</td><td>p/n AM12400 또는 동급의</td><td>마이크로 원심분리기</td></tr><tr><td>마그네틱 교반 막대</td><td>Corning</td><td>p/n 401435 또는 동급</td>의 <td>Qubit</td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>p/n Q32857</td><td>DNA 정량화를 위한 기기</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 어세이 키트, Qubit 형광측정기</td><td>Invitrogen</td><td>p/n Q32850</td><td>Kit for Qubit fluorometer</td></tr><tr><td>UV-VIS 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 8000 또는 2000 또는 동급</td><td>기기 DNA 정량화용 기기</td></tr><tr><td>P10, P20, P200 및 P1000 피펫</td><td>Pipetman 또는 동급</td><td></td><td>DNA 분배기</td></tr><tr><td>진공 농축기</td><td>Thermo Scientific</td><td>p/n DNA120-115 또는 동급</td><td>DNA 농축 기기</td></tr><tr><td>SureTag Complete DNA Labeling Kit</td><td>Agilent</td><td>p/n 5190-4240</td><td>DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)</td></tr><tr><td>정제 컬럼(50개)</td><td>Agilent</td><td>p/n 5190-3391</td><td>DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)</td></tr><tr><td>AutoScreen A, 96웰 플레이트</td><td>GE Healthcare</td><td>p/n 25-9005-98</td><td>DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)</td></tr><tr><td>GenElute PCR 클린업 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p/n NA1020</td><td>DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)</td></tr><tr><td>인간 게놈 DNA</td><td></td><td>p/n G1521</td><td>DNA 라벨링 키트(인간 샘플용)</td></tr><tr><td>CGH 마이크로어레이용:</td><td>Promega</td><td>(여성) 또는 p/n G1471(남성)</td><td>어레이 CGH 제어 DNA</td></tr><tr><td>CGH+SNP 마이크로어레이용:</td><td>Coriell</td><td>p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 또는 NA18579</td><td>어레이 CGH 제어 DNA</td></tr><tr><td>올리고 aCGH/ChIP-on-chip 세척 버퍼 키트 또는</td><td>애질런트</td><td>p/n 5188-5226</td><td>어레이 CGH 혼성화 및 세척</td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip 세척 버퍼 1 및</td><td>Agilent</td><td>p/n 5188-5221</td><td>어레이 CGH 하이브리드화 및 워시</td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip 워시 버퍼 2</td><td>Agilent</td><td>p/n 5188-5222</td><td>어레이 CGH 하이브리드화 및 세척</td></tr><tr><td>안정화 및 건조 솔루션</td><td>Agilent</td><td>p/n 5185-5979</td><td>어레이 CGH 하이브리드화 및 워시</td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip 하이브리드화 키트</td><td>애질런트</td><td>p/n 5188-5220 (25) 또는 p/n 5188-5380 (100)</td><td>어레이 CGH 혼성화 및 세척</td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Agilent</td><td>p/n 5190-3393</td><td>어레이 CGH 혼성화 및 세척</td></tr><tr><td>Agilent C 스캐너</td><td>어레이 CGH 슬라이드용</td><td>애질런트</td><td></td> 스캐너</tr><tr><td>SureSelect XT2 시약 키트</td><td></td><td></td> Kit <td>Kit for target enrichment</td></tr><tr><td>HiSeq 플랫폼(HSQ), 16개 시료</td><td>애질런트</td><td>p/n G9621A</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 플랫폼(HSQ), 96 샘플</td><td>애질런트</td><td>p/n G9621B</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 플랫폼(HSQ), 480 샘플</td><td>애질런트</td><td>p/n G9621C</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 플랫폼(MSQ), 16 샘플</td><td>애질런트</td><td>p/n G9622A</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 플랫폼(MSQ), 96 샘플</td><td>애질런트</td><td>p/n G9622B</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 플랫폼(MSQ), 480 샘플</td><td>애질런트</td><td>p/n G9622C</td><td></td></tr><tr><td>DNA 1000 Kit</td><td>Agilent</td><td>p/n 5067-1504</td><td>25 - 1000 bp의 dsDNA 단편의 분리, 크기 조정 및 정량화를 위한 키트.</td></tr><tr><td>고감도 DNA 키트</td><td>Agilent</td><td>p/n 5067-4626</td><td>키트: 단편화된 DNA 또는 DNA 라이브러리 분석용 키트.</td></tr><tr><td>자동 PCR 정제를 위한</td> <td>AMPure XP Kit</td><td></td><td></td> Kit.</tr><tr><td>5 mL</td><td>Agencourt</td><td>p/n A63880</td><td></td></tr><tr><td>60 mL</td><td>Agencourt</td><td>p/n A63881</td><td></td></tr><tr><td>450 mL</td><td>Agencourt</td><td>p/n A63882</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td></td><td></td><td>비오틴화 핵산의 분리 및 취급</td></tr><tr><td>2 mL</td><td>Life Technologies</td><td>Cat #65601</td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Life Technologies</td><td>Cat #65602</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR 어세이 키트, Qubit 형광측정기</td><td></td><td></td><td>DNA 정량</td></tr><tr><td>분석 100 어세이, 2-1000ng</td><td>Life Technologies</td><td>Cat #Q32850</td><td></td></tr><tr><td>500 어세이, 2-1000ng</td><td>Life Technologies</td><td>Cat #Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 어세이 튜브</td><td>Life Technologies</td><td>p/n Q32856</td><td>DNA 정량</td></tr><tr><td>SureSelec tXT2 캡처 라이브러리</td><td>애질런트는</td><td>실험에 따라</td><td>라이브러리 캡처</td></tr><tr><td>키트, SureCycler 8800 Thermal Cycler</td><td>, Agilent</td><td>p/n G8800A</td><td>DNA 증폭</td></tr><tr><td>96웰 플레이트 모듈, SureCycler 8800 Thermal Cycler,</td><td>Agilent</td><td>p/n G8810A</td><td>DNA 증폭</td></tr><tr><td>, SureCycler 8800 호환 96웰 플레이트</td><td>, Agilent</td><td>p/n 410088</td><td>DNA 증폭</td></tr><tr><td>광학 스트립 캡</td><td>애질런트</td><td>p/n 401425</td><td>DNA 증폭</td></tr><tr><td>튜브 캡 스트립, 돔형</td><td>애질런트</td><td>p/n 410096</td><td>DNA 증폭</td></tr><tr><td>압축 매트</td><td>애질런트</td><td>p/n 410187</td><td>DNA 증폭</td></tr><tr><td>2100 바이오분석기 노트북 번들</td><td>애질런트</td><td>p/n G2943CA</td><td>DNA 증폭</td></tr><tr><td>2100 바이오분석기 전기영동 세트</td><td>애질런트</td><td>p/n G2947CA</td><td>DNA 증폭</td></tr><tr><td>Covaris 시료 전처리 시스템, E-시리즈 또는 S-시리즈</td><td>Covaris</td><td></td><td>DNA 전단</td></tr><tr><td>Covaris 시료 홀더</td><td></td><td>p/n 520078</td><td>DNA 전단</td></tr><tr><td>Nutator 플레이트 믹서</td><td>BD Diagnostics</td><td>p/n 421105 또는 동급의</td><td>플레이트 믹서</td></tr><tr><td>GaIIx</td><td>Illumina</td><td></td><td>차세대 염기서열분석 기계</td></tr></tbody></table>

배열 cgh, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 utero에서 electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

대뇌 피 질을 포함 하는 출생 결함-대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형으로 알려진-어린 시절에 지적 장애 및 간 질 약물 내성의 20-40 %의 중요 한 원인이 있습니다. 고해상도 뇌 영상 vivo에서 상승할 고기의 큰 그룹의 식별을 용이 있다. 뇌 이미징, 게놈 분석 및 동물 모델의 발전에도 불구 하 고 간단한 워크플로 putative 돌연변이의 기능 효과 테스트 하 고 체계적으로 후보 유전자를 우선 순위를 없습니다. 이 문제를 해결 하려면 MCD에 대 한 새로운 원인 유전자의 id를 사용 하는 실험적인 전략 개발 및 검증. 식별 후보 게놈 지역 또는 배열 CGH 또는 전체-exome 시퀀싱 및 그들의 비활성화의 또는 utero 통해 설치류 두뇌 개발에 특정 변이의 overexpression의 효과 통해 유전자를 기반으로 하는이 전략 electroporation입니다. 이 방법은 뇌 결 heterotopia, 결함이 있는 신경 마이그레이션에 의해 발생 하는 MCD의 병 인에 상 상속 기공을 단백질에 대 한 인코딩 C6orf70 유전자의 id에 지도 했다.

소설 상승할 원인 유전자를 식별 하도록 설계 된 실험 전략은 그림 1에서 지.
변함없이 PNH (그림 2A), 신체 callosum dysgenesis, colpocephaly, 소 뇌 hypoplasia 및 간 질와 관련 된 polymicrogyria를 결합 하는 발달 두뇌 이상으로 155 환자의 코 호트에서 배열 CGH를 수행 하 여 증 및 인지 장애, 우리는 12 환자 (그림 2B)21에 의해 공유 하는 6q27에 1.2 m b의 최소한의 중요 한 삭제를 확인. 게놈 지역 포함 4 개의 알려진된 유전자 (THBS2, PHF10, TCTE3 및 DLL1)와 2 유전...

뇌 결 heterotopia (PNH) 성인에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형의 가장 일반적인 형태는 그러나 그것의 유전으로 가장 산발적 인 경우 알 수 없는 남아 있다. 우리는 최근 MCDs에 대 한 비 발한 후보자 유전자를 식별 하 고 직접 그들의 원인이 역할 비보를 확인 하는 전략을 개발 했습니다.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

본 절차의 전반적인 목표는 뇌 기형 질환의 새로운 후보 유전자를 식별하고, 생체 내(in-vivo)에서 이들의 인과적 역할을 직접 확인하는 것입니다. 이러한 전략은 뇌 발달 및 관련 병리와 연관된 분자 경로를 발견함으로써 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 전략의 주요 장점은 뇌 질환과 관련된 새로운 유전자를 발견하고 새로운 진단 도구를 개발하는 데 기여한다는 점입니다.이러한 접근 방식을 통해 우리는 비정상적인 신경세포 이동으로 인해 발생하는 뇌 기형인 뇌실주위 결절성 이소증의 병인에서 C6orf70 유전자의 결정적인 기여를 밝힐 수 있었습니다. 실험 절차 시연은 저희 실험실의 엔지니어인 Fabienne Schaller가 맡겠습니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로, 그리고 기관 및 국가 지침에 따라 E15 임신 쥐를 준비하십시오.동물이 적절히 마취되었는지, 안구에 안연고가 도포되었는지, 그리고 복부가 적절히 제모 및 소독되었는지 확인하십시오. 날카로운 가위를 사용하여 미측 복부 중앙선의 피부와 근육에 2 cm 길이의 수직 절개를 가한 후, 복강에서 자궁각 하나를 조심스럽게 노출시킵니다. 배아에 수분을 공급하기 위해 37 °C로 예열된 생리식염수를 한 방울씩 떨어뜨려 적용하십시오.시술 전 과정 동안 자궁을 촉촉하게 유지하십시오. DNA를 주입하려면, 한 손으로 배아의 머리 부분이 쉽게 접근 가능하도록 부드럽게 잡습니다. 그런 다음, 다른 손을 사용하여 마이크로인젝터에 연결된 유리 모세관을 중앙선에서 1mm 떨어져 있고 깊이 2~3mm 지점에 위치한 좌측 뇌실에 조심스럽게 삽입합니다.주입 과정을 시각적으로 모니터링할 수 있도록 fast green이 포함된 DNA 약 1µL를 마이크로인젝터를 사용하여 주입하십시오. 세포 내로 DNA를 전기천공하기 위해, 먼저 3x7mm 전극 표면에 생리식염수를 떨어뜨립니다. 그 다음, 양극 전극을 주입된 쪽에, 음극 전극을 주입되지 않은 우심실에 배치하십시오.발판 스위치를 사용하여 950 millisecond 간격으로 5회의 전기 펄스를 전달합니다. 전기천공법 시행 후, 자궁각을 복강 내로 되돌려 놓고 멸균 식염수를 첨가하여 배아가 더 자연스럽게 배치되도록 하고 수술 중 발생한 체액 손실을 보충합니다. 흡수성 외과용 봉합사로 근육벽을 봉합한 다음, 단순 결절 봉합법을 사용하여 피부를 봉합합니다.최대 48시간 동안 또는 기관 가이드라인에 따라 수술 후 진통제를 투여하십시오. 쥐를 깨끗한 홈 케이지로 옮기고 마취에서 깰 때까지 모니터링하십시오. 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 뇌를 4%paraformaldehyde로 고정한 후, PBS로 10분 동안 세척하십시오.세척하는 동안, 용해된 agarose의 온도가 50 °C를 초과하지 않도록 주의하며 PBS 내 4% agarose 50 mL를 준비합니다. agarose를 플라스틱 임베딩 몰드에 붓고 뇌 조직을 agarose 안에 넣습니다. 임베딩된 뇌 조직을 4 °C에 두고 agarose가 최소 1시간 동안 중합되도록 합니다.아가로스가 중합되면 뇌 주변의 과잉 아가로스를 잘라내고, 뇌의 전후축이 칼날과 수직이 되도록 뇌를 바이브라톰 베이스 플레이트에 접착합니다. 접착제가 마를 때까지 몇 분간 기다린 후, 뇌가 접착된 플레이트를 바이브라톰 챔버에 넣습니다. 바이브라톰에 PBS를 채우고 100 micron 두께의 절편을 슬라이싱하기 시작합니다.절편 제작 후, 절편을 현미경 슬라이드로 옮기고 과잉 액체를 제거합니다. 그런 다음 봉입제를 몇 방울 떨어뜨리고 절편 위에 커버슬립을 덮습니다. 하룻밤 동안 건조시킵니다.레이저 주사 공초점 현미경의 10배 배율을 사용하여 절편을 촬영하십시오. 이미지를 분석하려면, 먼저 정량적 이미지 분석을 위한 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 8비트로 변환하십시오. 그 다음, 대표적인 GFP 양성 형광 세포 하나를 선택하고, estimate를 클릭한 후 프리핸드 선택 도구를 사용하여 세포의 경계를 그려 세포의 모양을 수동으로 정의하십시오.소프트웨어가 세포의 직경과 강도 임계값을 자동으로 유지합니다. 'find cells'를 클릭하여 소프트웨어가 피질 전반에서 형질전환된 세포를 국소화하도록 합니다. 그 다음, 필요한 경우 위양성(false positives)을 수동으로 제거하십시오.영역 도구(region tool)를 클릭하고 8개의 영역 스트라이프(region stripes)를 선택하여 피질의 전체 두께를 개별 섹션에서 정규화된 8개의 관심 영역으로 나눕니다. 이때 스트라이프 1과 8은 각각 뇌실대(ventricular zone)와 피질판(cortical plate)의 상단에 해당합니다. 다음으로, 적용(apply)을 클릭하여 소프트웨어가 전체 피질 내 GFP 형질전환 세포의 상대적 위치를 계산하도록 합니다. 마지막으로, 정량화 저장(save quantification)을 클릭하여 분석을 위한 Excel 파일로 데이터를 내보냅니다.Array CGH 및 전엑좀 시퀀싱을 통해 C6orf70이 발달 유전자 이상과 관련된 후보 유전자로 확인되었습니다. 정량적 PCR 분석 결과, 이 유전자는 PHF10 및 DLL1과 함께 쥐의 대뇌 피질에서 발현되는 것으로 나타났습니다. 다음 이미지들은 녹색 형광 단백질 컨스트럭트 단독, 또는 C6orf70 코딩 서열을 표적으로 하는 shRNA 또는 상대적으로 효과가 없는 미스매치 컨스트럭트와 함께 전기천공법을 시행한 지 5일 후 E20 쥐 뇌의 대표적인 신피질 관상 단면을 보여줍니다.신경세포 이동 장애의 대조군으로 Filament A 넉다운을 사용하였습니다. C6orf70 또는 Filament A를 표적으로 하는 shRNA를 이용한 자궁 내 전기천공법은 흰색 화살표로 표시된 바와 같이 GFP 양성 세포가 뇌실 구역 내에 정지하도록 유도한 반면, GFP만 발현하거나 미스매치 컨스트럭트와 함께 발현하는 세포는 신경세포 이동에 영향을 주지 않았습니다. 이 절차를 수행할 때는 신경세포의 증식, 이동 또는 성숙 중 어떤 피질 생성 단계를 분석하고자 하는지 유념하는 것이 중요합니다.설치류 배아 뇌의 자궁 내 전기천공법(in-utero electroporation) 수행법을 익히기 위해서는 장기간의 교육 기간과 숙련도, 그리고 지속적인 연습이 필요하다는 점을 유의하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

이 비디오는 자궁 내 전기천공법을 사용하여 쥐 배아의 소뇌 신경 세포에 플라스미드 DNA를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 정상적인 뇌 발달에서 유전자의 생체 내 기능과 종양 진행 중 뉴런 세포의 유전자 발현 변화를 이해하는 데 유용합니다.

자궁 전기천공법 기반 유전자 전달: 쥐 배아의 배아 소뇌 세포에 플라스미드 DNA를 주입하는 기술

유전자는 성인 동물의 행동이나 신경 병리학의 최신 연구에 신경 연결의 빠르고 목표 수정을 가능하게하기 위해, E16의 자궁 일렉트로 (IUE)의를 통해 피질 또는 쥐의 해마의 개발 과정에서 조작 할 수 있습니다. IUE 성공의 제어를위한 생체 영상의 출생은 공동 형질 루시 페라 제를 활성화 생물 발광에 의해 수행된다.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를...

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

여기에서는 해마 발달 중 특정 유전자의 조절 메커니즘을 조사하는 도구를 제공하는 프로토콜을 제시합니다. 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation) 및 유기형 절편 배양을 사용하면 단세포에서 관심 유전자의 발현을 상향 및 하향 조절하고 발달 과정에서 이들의 운명을 따를 수 있습니다.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

녹아웃 동물을 사용 하 여 유전자의 손실의 기능 연구를 기존의 자주 비용과 시간이 많이 소요 되었습니다. CRISPR 중재 체세포 mutagenesis Electroporation 기반 유전자에 vivo기능을 이해 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 소 뇌의 세포 증식에 녹아웃 고기를 분석 하는 방법을 보고 합니다.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

성상 세포는 대뇌 피질을 균일하게 타일로 만들어 세포 수준에서 복잡한 형태에 대한 분석을 어렵게 만듭니다. 여기에 제공된 프로토콜은 자궁 전기포레이션을 기반으로 하는 다색 라벨을 사용하여 피질 성상신구를 선별하고 사용자 친화적인 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 볼륨 및 형태를 분석합니다.

피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서

신경 정신 장애의 병인에 있는 최근에 발견된 질병 관련 유전자의 역할은 모호하게 남아 있습니다. 자궁 전기 기화 기법에서 수정된 양자간은 뉴런의 큰 인구에서 유전자 전송을 허용하고 사회적 행동에 대한 유전자 발현 변화의 원인 효과의 검사를 허용한다.

자궁 전자기화에서 양자 간을 사용하여 설치류 행동에 대한 유전적 영향을 심문하는 파이프라인

배우세요 뇌 기형 관련 후보 유전자를 식별하고 생체 내에서 인과적 역할을 확인하는 방법을 배열 CGH와 전체 exome 시퀀싱, 그리고 설치류 자궁 내 전기천공 기법을 활용하여 신경생물학 연구에 활용하세요.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

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