Name: 뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 뇌 조각의 공포 회로를 예 생체 옵토제네틱스로 해부하는 방법을. 채널로돕신 발현과 패치클램프 기록을 통해 시냅스 특성을 분석하여 신경 미세회로의 기능을 연구할 수 있습니다.

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대표 결과를 얻을 수 있도록 도와준 Cora Hübner와 Andrea Gall에게 감사드립니다. 이 연구는 튀빙겐 대학교(University of Tuebingen)의 Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience(CIN)의 지원을 받았으며, 이는 Excellence Initiative(EXC 307)의 프레임워크 내에서 Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)가 자금을 지원하는 Excellence Initiative와 Charitable Hertie Foundation의 기금으로 지원되었습니다.

윤리 문 : 모든 실험 절차는 연구에 동물의 사용에 대한 EU 지침에 따라이었고, 지역 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (Regierungspräsidium 튀빙겐, 바덴 뷔 르템 베르크, 독일의 상태) 튀빙겐 대학에 대한 책임. 1. 정위 주입 절차 <ol><li> 멸균기를 사용하여 멸균 도구 (가위, 메스, 클램프, 드릴, 바늘, 봉합 재료)를 준비합니다. 이러한 무균 수술 드레이프에 멸균면 교환, 소독, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS, pH를 7.4), 및 H 2 O 2와 같은 살균 도구 및 기타 필요한 솔루션 및 수술 용품을 정리하십시오. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 수평 미세 전극 풀러에 3 mm 폭 상자 필라멘트를 사용하여 주사에 대한 유리 Micropipette과 (그림 1A, 삽입)을 당깁니다. 주 : 깊은 주사제, 전극 테이퍼가 충분히 있어야복부 대부분의 좌표에 도달 할 길이 (약 5mm;. 좌표를 들면, 1.10 참조). </li><li> 프리믹스 바이러스 솔루션의 1 μL 멸균 PBS에서 0.1 % 빠른 그린 솔루션의 0.2 μL (유리 피펫의 솔루션의 더 나은 가시성). 좋은 팁 (그림 1A, 삽입)와 마이크로 리터 피펫을 사용하여 바이러스 솔루션과 빠른 녹색의 혼합물로 유리 피펫을 입력합니다. 참고 : 재조합 아데노 관련 바이러스 성 벡터 (rAAV)와 협력은 바이오 안전성 레벨 1 (BSL 1) 작업으로 간주하고 BSL (1) 실험실에서 수행 될 필요가있다. 이 연구 (그림 1C)에 사용 rAAVs이 있었다 : 1) mPFC : rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (혈청 형 2/9) (16) 2) MGM / PIN : rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (혈청 형 2/9) (23); 3) mpITC / BLA : rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (혈청 형 2/1) (23) </li><li> 작은 동물의 마취 기계 (: 유도 산소 3 % 아이소 플루 란)를 사용하여 마우스를 마취. 참고 :이 연구에 사용 된 마우스를 4이었다 -7 주 다음과 같은 균주 및 유전자형 (도 2A 및 3A-D에서 실험) C57BL6 / J 야생형; GAD67-GFP (24) (도 2b 및 3E-H의 실험); Tac2-Cre 호텔 (25) (도 2C 및 3I-J에서 실험). </li><li> 귀와 눈 사이의 머리를 면도. 면봉을 사용하여 면도 헤드 살균제 (기반 프로 비돈 요오드)를 적용합니다. </li><li> 마취 동안 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 피하 진통로 (멜 록시 캄 계, 0.1 ml의 5 ㎎ / ㎖ 용액)를 주입 마우스. </li><li> (: 유지 보수를 위해 산소의 2 % 아이소 플루 란) 정위 프레임 (그림 1A)에 마우스를 올려 놓고 가스 마취 마스크를 통해 마취를 유지한다. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. 참고 : 전체 수술시 무균 조건뿐만 아니라 수를 유지; 일회용 안면 마스크를 착용, 수술 이동, 장갑 WN. </li><li> 가위를 사용하여 머리의 상단에 피부 절개를합니다. 부드럽게 H 2 O 2와 두개골 표면, 청소 두개골을 노출 클램프로 고정, 무딘 집게를 사용하여 옆으로 피부를 당기십시오. </li><li> 두 반구 (그림 1B)에 대한 좋은 팁 영구 마커 및 드릴 구멍을 사용하여 두개골에 마크 주사 부위. mPFC :이 연구에서 주사 (브레 그마 (mm)에서)입니다 좌표 전방 1.9, 0.3 ± 측면, 복부 2.1; MGM / PIN : 1.8 ± 측면, 3.0 뒤, 복부 3.8; mpITC / BLA : 3.35, 및 4.75 복부 ± 측면, 1.45 후방. </li><li> 가압 주입 장치에 접속 정위 프레임에 채워진 유리 피펫 마운트 정수리 위치로 피펫을 가져온다. </li><li> 미세 스트레이트 팁 집게를 사용하여 유리 피펫의 팁을 끊다. 바이러스 솔루션의 에어로졸 발생을 방지하기 위해 부드럽게이 작업을 수행합니다. 피펫 팁 몇 압력 펄스를 적용하고 비루 한 방울의 압출을 관찰하여 열려 있는지 확인합니다의 솔루션입니다. </li><li> 원하는 주입 좌표로 이동하여 압력 분사 장치에서 다음 설정을 사용하여 피펫 콘텐츠 (~ 0.5 μL)의 절반을 주입 : 압력 : 20 psi의 평균 펄스 길이 : 30 밀리 초, 펄스의 평균 : 50. </li><li> 를 후퇴 천천히 (1mm / 분) 전 ~ 1 분 동안 장소에서 피펫을 둡니다. 참고 : 확인 피펫 다른 반구에 같은 피펫 절차를 반복하기 전에 차단되지되어 있는지 확인합니다. 차단 된 팁의 경우 청소하거나 다시 브레 그마에 팁과 제로 피펫 위치를 끊다. </li><li> PBS (산도 7.4) 청소 두개골, 부드럽게, 클램프를 제거 함께 피부를 당겨, 개별 버튼 봉합과 절개 봉합 (3-4 노트). 상처 주위에 살균제 (기반 프로 비돈 요오드)를 적용합니다. </li><li> 마취를 중지하고 완전히 깨어 때까지 무인 마우스를 두지 마십시오. 단일 보관되어 유지 또는 완전히 회복 만 다른 동물의 회사에 반환합니다. 수술 후는 건강 상태를 지속적으로 모니터링하고, adminis터 진통 필요한 경우. 지역 동물 관리 및 사용위원회가 제시 규칙에 따라 절차를 따르십시오. </li></ol> 급성 조각 2. 준비 <ol><li> ACSF, 절단 솔루션, 도구 (가위, 메스, 집게, 주걱, 파스퇴르 피펫), 한천 블록을 준비합니다. 참고 : 인공 뇌 - 척수 (ACSF)의 1 L 실험마다 필요하며, 이전에 16,23을 발표 한 두 번 증류 H 2 O에 화학 물질을 용해시켜 제조한다. 절단 용액을 2 M 황산 원액 0.87 ㎖로 ACSF 200 ㎖를 보충하여 제조된다. </li><li> 네이트 ACSF와 95 % O 2 5 % CO 2와 실험을 통해 절단 솔루션입니다. </li><li> 깊이 이소 플루 란을 이용하여 작은 동물 마취기 (산소 3 %)를 사용하여 마우스를 마취. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. </li><li> 큰 가위를 사용하여 마우스를 목을 벨 즉시 진정얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 머리. </li><li> 꼬리에서 주동이와 하나의 중간 선 절개를 엽니 다 두개골 부드럽게 집게를 사용하여 측면에 두개골 조각을 밀어 넣습니다. 빠르게 부드럽게 작은 둥근 주걱을 사용하여 두개골 밖으로 들어 올려 머리를 제거합니다. 메스와 소뇌를 잘라. 얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 머리를 놓습니다. </li><li> mPFC 주입 사이트 (mPFC 포함) 메스를 사용하여 뇌의 앞쪽 부분을 잘라 슬라이스 때까지 얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 넣어. </li><li> 여과지로 과잉의 절단 용액을 제거하고 vibratome 스테이지 상 뇌의 후방 부를 접착제. </li><li> 기울어 진 편도 슬라이스를 들어, 35 ° 각도 (그림 1D, 중간)에 한천 블록 (4 %) 인하에 뇌 접착제. 관상 편도 조각, MGM / PIN 주입 사이트 및 mPFC 주입 사이트의 경우 (그림 1D가, 왼쪽 및 오른쪽) 무대에서 직접 뇌를 붙입니다. 슬라이스 동안 안정성을 위해 뇌 뒤에 추가 한천 블록을 배치합니다. </li><li> PLAC냉각 장치를 사용하여 39 ° C로 유지 빙냉 산소 절단 용액 챔버 절삭 E 단계. 사파이어 블레이드를 사용하여 편도체 (320 μm의)의 급성 슬라이스를 준비합니다. 실온에서 산소 ACSF와 함께 제공되는 인터페이스 챔버에서 슬라이스를 놓습니다. </li><li> 45 분 - 급성 편도 조각의 준비를 한 후, 35 조각을 복구하기 위해 36 ° C에서 수조의 인터페이스 챔버를 배치합니다. 이어서, RT에 인터페이스 챔버를 반환한다. 이 조각에서 녹화를 들어, 단계 3.2를 진행합니다. </li><li> 급성 편도 슬라이스 (- 2.9 2.8 단계)에 대해 전술 한 바와 같이 단계 2.10의 시작 동안, 주사 부위의 조각을 잘라. 수조에서 조각의 복구는 여기에 필요하지 않습니다. 선택 사항 : 빠르게 주사 부위의 위치를​​ 추정 형광등 적절한 필터 세트를 구비 입체경에 조각을 관찰. </li><li> 이 필터 서류 및 submer 사이를 끼워 혹 사후 분석을 위해 주사 부위를 포함하는 슬라이스를 수정PBS 용액에서 O / N의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 그들을 카. 주사 부위의 분석을 위해 단계 4.1를 진행합니다. </li></ol> 시냅스 섬유 3. 시각화 및 자극 <ol><li> 섬유와 세포의 optogenetic 활성화를위한 패치 현미경을 준비 : <ol><li> 빛 전달 경로 상에 장착 된 발광 다이오드 (LED)를 중심으로. </li><li> 후 초점면에서 470 nm의 적절한 파장을 선택하는 전력 측정기와 각 목적의 출력에서​​의 LED의 광 강도를 측정한다. </li><li> mW의 / mm 2의 빛의 세기를 계산하고 470 nm 파장에 대한 측정 값에 대한 각각의 목적에 대해 (광 출력 (MW / mm 2) 대 LED 강도 (%)) 검량선을 작성합니다. </li></ol></li><li> 형광 램프를 구비 한 수직 현미경에 장착 슬라이스 챔버 내의 인터페이스 챔버 장소에서 급성 편도선 슬라이스 검색. SLIC가 같은 조각의 위치를​​주의하십시오인터페이스 챔버 위로 향하게 E면은 상기 기록 챔버 내에서 위로 향하게된다. ~ 31 ° C의 온도에서 2 ㎖ / 분 - 1의 비율로 신선한 산소 ASCF와 슬라이스 관류. </li><li> 발현 특정 형광 단백질에 적합한 필터 세트와 함께 상기 형광 램프를 사용하여 슬라이스 내의 연접 섬유를 관찰한다. 개요 (그림 1E), 대상 지역 내의 섬유 밀도의 평가를위한 60 배 목표를 얻기 위해 5 배 목표를 사용합니다. GFP 및 YFP를 들어, 사용 필터는 지정된 mCherry는 &quot;빨간색&quot;(여진 40분의 560, 빔 스플리터 (585), 배출 70분의 630)를 설정 필터를 사용하기위한 &quot;녹색&quot;(여진 20분의 472, 빔 스플리터 (495), 배출 (490) LP)로 설정 : 참고 재료 / 장비 테이블입니다. </li><li> 열거 나 실험 (그림 2D)에 대해 원하는대로 현미경 빛의 경로에서 조리개를 제한 할 수 있습니다. </li><li> 패치 녹음을 얻으려면, 내부 솔루션 패치 피펫을 작성하고 난 마운트n 개의 전극 홀더. 패치 피펫에 긍정적 인 압력을 적용 천천히 미세 조작기를 사용하여 슬라이스로 시각적 통제하에 먼저 목욕 솔루션으로 다음을 낮 춥니 다. <ol><li> 측면과 상단에서 패치 피펫 관심의 신경 세포에 접근. 피펫 (세포 표면에 딤플 표시) 세포의 표면 상에있을 때 양의 압력을 해제하고 부압을 적용하여 &quot;기가 시일&quot;를 얻었다. </li><li> 전 세포 기록을 얻기 위해, 막 패치 파열 상기 흡입을 적용한다. 이어서, 셀의 전기 응답을 기록하는 동안 CHR (470 나노 미터)를 활성화시키기위한 적절한 파장을 사용하여 접속 된 LED 표지 섬유를 자극한다. </li><li> 시냅스 자극 낮은 LED 휘도 시작하여 원하는 시냅스 전류 진폭에 도달 할 때까지 증가한다. 상기 타이밍 펄스 길이를도에서 (예를 제어하기 위해 상기 데이터 수집 소프트웨어에 디지털 출력을 구성하여, LED 트리거3). 주의 : 다른 소프트웨어 및 / 또는 TTL 발생 장치는 LED 트리거 할 수있다. </li></ol></li><li> 및 / 또는 특정 약물의 존재 하에서 그 다음에 기록 된 셀에 대한 원하는 현미경 광 통로의 개방 또는 제한 개구 (단계 3.4)을 반복 자극. </li><li> 기록 후,이 필터 종이 사이를 사이에두고 4 % PFA O / N에서 그들을 잠수하여 혹 사후 분석을위한 슬라이스를 수정합니다. </li><li> 전기 생리 데이터를 분석 할 수 있습니다. 참고 : 사용하여 해당 소프트웨어는 각각의 자극 오프라인 기록 된 스윕 데이터를 시각화 할 수 있습니다. 약물의 효과를 분석 할 때, 모든 개별 스윕에 대한 시냅스 전류 진폭에 약물 효과의 시간 경과를 얻기 위해 피크 검출 루틴을 사용합니다. 약물의 효과는 정상 상태에 도달 할 때 결정합니다. 실험 조건 당 평균 ≥10 개별 스윕에 소프트웨어를 사용, 인물에 대한 대표적인 평균 응답을 준비하는 CF (그림 3B-D, FH, J 오른쪽 패널). 주 : 여러 대안적인 소프트웨어 패키지가 데이터 분석에 사용될 수있다. </li></ol> 사출 사이트 4. 사후 분석 <ol><li> 및 (재 이미징 단계 3.7에서, 원하는 경우) PBS에 세 번 사이트를 기록한다 (단계 2.12에서) 주사 부위의 조각을 씻으십시오. 이 반복을 10 분 동안 회전 진탕 기에서 신선한 PBS로 3 회 용액을 대체함으로써 수행된다. </li><li> PBS의 2 % 한천 솔루션을 준비하고 ~ 65 ° C로 냉각 할 수 있습니다. 작은 30mm 직경의 페트리 접시의 바닥에 평평하게 배치 조각, 한천 슬라이스를 포함하고 고체까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> vibratome의 무대에 내장 된 조각 또는 조각으로 한천 블록 접착제 및 PBS와 실을 절단 무대를 놓습니다. </li><li> 절제술 70 μm의 두께로 슬라이스를 포함. 옵션 : resectioning 후, 조각은 cytoarchitecture (그림 3A, C)를 공개 Neurotrace으로, 즉, 스테인드 할 수 및 / 또는 bYFP 또는 mCherry에 대한 y를 면역 형광 염색은 CHR 융합 단백질의 신호를 증폭한다. </li><li> 설치 미디어 슬라이드와 커버 슬립에 산 조각. 이미지 주사 부위와 원하는 경우, 형광 현미경 또는 공 초점 레이저 주사 현미경 (도 2A-C)를 이용하여 투영 영역에있는 섬유를 함유 또한 이미지 조각. </li></ol>

<ol><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Myers, K. M., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fear extinction.</a> Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).</li>
<li>Quirk, G. J., Mueller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+extinction+learning+and+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).</li>
<li>Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+reveals+opposing+influences+of+prelimbic+and+infralimbic+cortex+on+the+expression+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear.</a> Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).</li>
<li>Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociable+roles+of+prelimbic+and+infralimbic+cortices%2C+ventral+hippocampus%2C+and+basolateral+amygdala+in+the+expression+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).</li>
<li>Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+encoding+of+fear+extinction+in+mPFC-amygdala+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).</li>
<li>Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-Selective+Adjustment+of+Prefrontal-Amygdala+Transmission+during+Fear+Encoding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding.</a> J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).</li>
<li>Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dissection+of+optogenetically+activated+mPFC+and+hippocampal+inputs+to+neurons+in+the+basolateral+amygdala%3A+implications+for+fear+and+emotional+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory.</a> Front Behav Neurosci. 8, 64(2014).</li>
<li>Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+and+Auditory+Input+to+Intercalated+Neurons+of+the+Amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala.</a> Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).</li>
<li>Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+inhibitory+circuits+and+the+control+of+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.</a> Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+paracapsular+islands+as+a+module+for+integration+of+signals+regulating+anxiety+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala.</a> Brain Res. 1476, 211-234 (2012).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+expression+and+colocalization+with+calretinin%2C+parvalbumin%2C+and+somatostatin+in+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.</a> J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).</li>
<li>Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li>
<li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li>
<li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8%2C+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li>
<li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li>
<li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li>
<li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li>
<li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+channelrhodopsin-2+%28ChR2%29+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 모든 경우 쉽게, 가장에 구현 될 수있는 신경 회로와 지역 연결의 생체 optogenetic 조사하는 방법을 설명은 표면 형광 빛 포트에서 LED가 ~ 470 nm의 그들을 무장하여 수직 조각 패치 클램프 기록 설정. 조각의 축삭 돌기의 optogenetic 자극의 가장 큰 장점은 해당 섬유 책자는 알려져 있지 명확하게 정의되지 않은, 또는에서 보존되지 않은 있기 때문에, 특정 활성화 및 기존의 전기 자극에 접근하지 않았다 연결의 특성 조사를 위해 수 있다는 것입니다 하나의 뇌 조각. 공포 회로에 대한 중요한 열쇠 예로서,이가 편도선에 mPFC 입력의 특성을 해부에 적용 할 수있는 방법이 도시되어있다. 비록 전기 섬유 요로 자극 광범위 이전 연구에 사용 된 경우, 이러한 책자가 종종 원래 상이한 영역으로부터의 섬유를 운반. 예를 들어, 학습을 두려워 관련 회로에서, 시상 핵 또는 대뇌 피질의 영역을 서로 다른 감각의 돌기는 각각 내부 및 외부 캡...

시각화 및 뇌 영역 및 신경 세포의 특정 유형과 특정 연결의 동시 활성화를위한 정확한 도구는 기능 연결 기본 건강한 뇌 기능과 질병 상태를 이해하는 데 더 중요 해지고있다. 이상적으로,이 신경 세포 통신 확인되는 정확한 시냅스 속성의 생리 학적 조사를 수반한다. 이는 단일 급성 뇌 조각에 보존 할 수없는 뇌 영역 간의 연결에 특히 사실이다. 과거에는 주로 별도 실험에서 달성되었다. 한편, 신경 추적자 주입 생체 후속 광 또는 사전 및 시냅스 파트너 전자 현미경 분석과 함께 사용되어왔다. 원래 영역에서 섬유 책자가 보존되고, 슬라이스 조제에서 액세스하는 경우 한편, 전기 자극은 대상 영역의 세포와 시냅스 통신 메커니즘을 평가하기 위해 사용되어왔다. 자신의 시각화 및 사후 해부학 적 분석 1을 허용하면서 optogenetics의 출현으로, 같은 형광 단백질에 융합 Channelrhodopsins (CHRS)와 같은 빛 문이 양이온 채널의 대상으로 표현, 지금은 신경과 축삭 궤적의 활성화를 가능하게 4. 섬유 책자가 특정 궤도를 분리하지 않거나 때문에, 1) 기존의 전기 자극에 액세스 할 수 없다는 뇌 영역에서의 입력을 평가 : 부모 인 somata 5에서 절단 할 때 CHR 발현 축색 돌기도 자극 할 수 있기 때문에 뇌 조각에서 가능하다 불명이고; 2) 명백하게 가정하지만 불완전하게 이해하고 특정 입력에 대한 기원의 영역을 식별; 3) 로컬 및 장거리 예측에 정의 된 세포 유형 사이의 기능적 연결을 조사합니다. 이 때문에 다수의 장점의 뇌 슬라이스 회로 optogenetic이 매핑은 전체되었다LY은 지난 몇 년 동안 사용하고, 형광 태그 CHRS의 발현에 대한 바이러스 벡터의 다양한 상용 공급 업체에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 전기 자극은 또한 통로 또는 주변의 다른 세포와 똑같이 신속하고 일시적으로 정확한 자극의 섬유를 보충 할 수 있기 때문에 기존의 전기 자극을 통해 optogenetic 활성화의 일부 주요 장점으로 인해 자극 전극, 섬유 자극의 특이성의 배치로 조직에 손상이 없습니다. 또한, 바이러스 벡터의 정위 주사 용이 Cre 호텔 의존성 발현 및 / 또는 특이 적 프로모터 (7)을 이용하여 달성 될 수있는 특정 뇌 영역 (6) 조건 또는 세포 타입 특이 적 발현을 타겟팅 할 수있다. 여기,이 기술은 두려움 시스템에서 장거리의 매핑 및 로컬 회로에 적용된다. 편도체는 공포와 감정적 인 기억 8,9의 수집 및 두려움의 표현 및 저장을위한 핵심 영역이다. 외에도 이리저리편도을 해요, 내측 전두엽 피질 (mPFC)와 해마 (HC)는 왕복 편도에 연결되어있는 구조는, 공포와 멸종 메모리 10, 11의 수집, 통합 및 검색의 측면에 연루되어있다. mPFC의 하위 활동은 12, 13를 말한다 높고 낮은 두 두려움을 제어 이중 역할을 할 것으로 보인다. 이것은 부분적으로 편도체의 활동과 출력을 제어 할 편도체에 mPFC에서 직접 연결에 의해 매개 될 수있다. 따라서, 최근 몇 년 동안, 여러 연구에서 편도 14-17 mPFC 구심 특정 대상 세포와 시냅스 상호 작용을 조사하기 위해 생체 슬라이스 실험을 시작했다. 공포 학습하는 동안, 에어컨과 무조건 자극에 대한 감각 정보는 특정 시상과 대뇌 피질의 영역에서 전망을 통해 편도에 도달한다. basol의 측면 부분 (LA)에있는 뉴런이 입력의 소성ateral 편도체 (BLA)는 공포 조건화 9,18의 기초가 중요한 메커니즘이다. 증가 증거는 편도에 평행 플라스틱 프로세스가 공포 메모리 (19)를 제어 할 수 저해 요소를 포함 할 것을 제안합니다. 클러스터 억제 뉴런의 그룹은 GABA 성 중간 paracapsular 인터 셀 (mpITCs)하지만 자신의 정확한 연결 및 기능은 불완전 20-22을 알 수있다. 여기에, optogenetic 회로 매핑은 mpITCs가 시상과 대뇌 피질의 중계국 (23)에서 직접 감각 입력을받을 것으로 보여, 구 심성 및 원심성 이러한 세포의 연결 및 편도의 대상 신경 세포에 미치는 영향을 평가하는 데 사용됩니다. mpITCs 또는 BLA 뉴런에 CHR의 특이 적 발현을 효과적으로 BLA 활동을 제어하는​​ 새로운 피드 포워드와 피드백 억제 회로에 배치, mpITCs이 억제 것을 공개, 로컬 상호 작용의 매핑을 할 수 있습니다뿐만 아니라, 상호 BLA 교장 뉴런에 의해 활성화된다23.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Surgery</td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>마우스용 다른 정위 프레임으로 교체 가능</td></tr><tr><td>Steretoxic 프레임 마우스 어댑터</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>마우스용 다른 정위 프레임으로 교체 가능</td></tr><tr><td></td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>더 이상 사용할 수 없으며 항목 번호로 대체되었습니다. 51609M</td></tr><tr><td>압력 주입 장치, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, 미국</td><td>T25-2-900</td><td>기타 압력 주입 장치(예: Picospritzer)를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Kwik Fill 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments, 독일</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>마취기, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, 독일</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC 온도 조절기 및 가열 패드</td><td>FHC, 미국</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>수평 마이크로피펫 풀러 모델 P-1000</td><td>Sutter Instruments, 미국</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>수술 도구 살균기, 살균기 75</td><td>Melag, 독일</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP(serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, 미국</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (혈청형 2/9)&nbsp;</td><td>펜 벡터 코어, 미국</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (혈청형 2/1)&nbsp;</td><td>Penn Vector Core, 미국</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린</td><td>Roth, 독일</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 마취제, 이소푸란 CP(1ml/ml)</td><td>CP 제약, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>방부제, 베타딘(프로비돈-요오드)</td><td>Purdure Products, 미국</td><td>BSOL32</td><td>는 다른 소독제로 대체 가능</td></tr><tr><td>진통제, 메타캠 솔루션(5mg/ml 멜록시캠)</td><td>베링거인겔하임, 독일</td><td></td><td>은 다른 진통제로 대체 할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Bepanthen 눈 연고</td><td>Bayer, 독일</td><td>0191</td>은 <td>다른 눈 연고</td></tr><tr><td>드릴 NM3000 (SNKG1341 및 SNIH1681)</td> <td>Nouvag, 스위스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox 봉합사 바늘</td><td>미세 과학 도구, 독일</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>꼰 실크 봉합사</td><td>미세 과학 도구, 독일</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Recordings, light stimulation, and analysis</td></tr><tr><td>artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td><td>) 구성에 대해서는 참고 문헌 #16 및 #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>참조 내부 패치 용액</td><td>구성에 대해서는 참고 문헌 #16 및 #23</td><td></td><td></td>참조</tr><tr><td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td><td>Roth, Germany</td><td>P027.1</td><td>정제된 상태에서 2M 원액 준비 물</td></tr><tr><td>슬라이서, Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, 독일</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>조직 슬라이서용 냉각 장치, CU65</td><td>Fisher Scientific, 독일</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>사파이어 블레이드</td><td>델라웨어 다이아몬드 나이프</td><td></td><td>맞춤 주문, 회사에 문의</td></tr><tr><td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td><td>Olympus, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite 형광등(XI120Q-1492)</td><td>Lumen Dynamics Group, 캐나다</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>패치 현미경, BX51WI</td><td>Olympus, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 패치 증폭기&nbsp;</td><td>분자 장치, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>분자 장치, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PClamp 소프트웨어, 버전 10</td><td>분자 장치, 미국</td><td></td><td>데이터 수집 및 자극을 제어하는 데 사용</td></tr><tr><td>목욕 온도 조절기, TC05</td><td>Luigs & 독일 노이만</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>3축 마이크로매니퓰레이터 Mini 25</td><td>Luigs & Neumann, Germany</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator 컨트롤러 SM7</td><td>Luigs & Neumann, Germany</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>패치 피펫용 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments, 독일</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>인터페이스 챔버용 셀룰로오스 질산염 여과지&nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech, 독일</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>LED 장치, CoolLED pE</td><td>CoolLED, 영국</td><td>244-1400</td><td>CoolLED 또는 USL 70/470 및 적절한 어댑터는 LED 자극을 위한 두 가지 대안 선택인</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, 영국</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED 또는 USL 70/470 및 적절한 어댑터는 LED 자극</td></tr><tr><td>LED 장치, USL 70/470</td><td>Rapp을 위한 두 가지 대안입니다. 광전자</td><td>L70-000</td><td>CoolLED 또는 USL 70/470 및 적절한 어댑터는 LED 자극을 위한 두 가지 대안 선택입니다.</td></tr><tr><td>듀얼 포트 어댑터</td><td>Rapp 광전자 회사는</td><td>CoolLED 또는 USL 70/470에 문의하고 적절한 어댑터는 LED 자극을 위한 두 가지 대안 선택입니다.</td><td></td></tr><tr><td>필터 세트 빨간색(여기)</td><td>AHF, 독일</td><td>F49-560</td><td>필터는 F46-008</td></tr> <tr><td>세트로 구입할 수 있습니다.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (빔스플리터)</td><td>AHF, 독일</td><td>F48-585</td><td>필터는 F46-008 세트로 구매할 수 있습니다</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (배출)</td><td>AHF, 독일</td><td>F47-630</td><td>필터는 F46-008</td></tr><tr><td>필터 세트 녹색 (여기)</td>로 구매할 수 있습니다. <td>AHF, 독일</td><td>F39-472</td><td>대안: 필터 세트 F36-149 또는 F46-002 (대역통과 방출 포함)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (빔스플리터)</td><td>AHF, 독일</td><td>F43-495W</td><td>대안: 필터 세트 F36-149 또는 F46-002(대역통과 방출 포함)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (배출)</td><td>AHF, 독일</td><td>F76-490</td><td>대안: 필터 세트 F36-149 또는 F46-002(대역통과 방출 포함)</td></tr><tr><td>LaserCheck, 휴대용 파워 미터</td><td>Coherent, 미국</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro Software, 버전 6</td><td>Wavemetrics, 미국</td><td></td><td>전기생리학 데이터 분석, 기타 대체 소프트웨어 패키지도 사용할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>IgorPro용 신경학적 매크로 제품군</td><td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td><td>전기생리학 데이터 분석, 기타 대체 소프트웨어 패키지도 사용할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">주사 및 투영의 사후 분석</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td><td>Roth, Germany</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar for embedding and resectioning</td><td>Roth, Germany</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>30 x 10 mm 페트리 접시</td><td>SPL Life 과학</td><td></td><td>대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>슬라이드, 슈퍼 프로스트</td><td>R. Langenbrinck, 독일</td><td>61303802</td><td>대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>R. Langenbrinck, 독일</td><td>3000302</td><td>대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Vecta Shield 장착 매체</td><td>Vector Laboratories, 미국</td><td>H-1000</td><td>대체 장착 매체를 사용할 수 있습니다</td></tr> 평<tr><td>탄화를위한 셀룰로오스 질산염 필터를 사용할 수 있습니다 고정용 슬라이스</td><td>Satorius Stedim Biotech, 독일</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 LSM 710</td><td>Zeiss, 독일</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 optogenetic 해부

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic 방법이 널리 빛에 의해 빛 활성화 단백질과 신경 활동의 후속 조작의 대상으로 표현을 결합하여 신경 인구 및 회로의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. Channelrhodopsins (CHRS)는 빛 문이 양이온 채널이며 형광 단백질에 융합 할 때 자신의 표현은 시각화 및 특정 세포 유형의 동시 활성화와 뇌의 정의 된 영역에서의 축삭 돌기 수 있습니다. 바이러스 벡터의 정위 주사 통해 CHR 융합 단백질을 구성 적 또는 조건 적으로 정의 된 뇌 영역의 특정 세포에서 발현 될 수 있고, 자신의 축삭 돌기이어서 뇌 조각의 생체 optogenetic 활성화를 통해 해부학 적 및 기능적으로 연구 될 수있다. 종래의 전기 자극 방법으로 해결 될 수없는 시냅스 연결의 특성을 이해하는 것을 목표로 할 때, 또는 새로운 원숭이를 식별하는데 특히 중요임대 및 이전에 제대로 이해하고 원심성 연결. 여기 몇 가지 예는이 기술이 편도체에 공포 관련 회로를 해명에 이러한 질문을 조사하기 위해 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 편도체는 공포와 감정적 인 기억의 수집 및 두려움의 표현 및 저장을위한 핵심 영역이다. 증거의 많은 라인은 내측 전두엽 피질 (mPFC)이 두려움 수집 및 멸종의 다양한 측면에 참여하지만, 편도선과의 정확한 연결은 단지 이해되기 시작하는 것이 좋습니다. 생체 활성화 optogenetic 편도는 기저 (BLA)에 mPFC 구심과 목표 셀 간의 통신 시냅스의 양상을 연구하기 위해 사용하는 방법 먼저, 도시된다. 또한,이 생체 optogenetic 접근법 편도선에 GABA 성 뉴런의 그룹을 사용하여 신규 접속 패턴을 평가하기 위해 적용 할 수있는 방법을 도시하고, 예로서 paracapsular 인터 셀 클러스터 (mpITC).

이 섹션에서는 감각과 조절 성 BLA에 대한 장기 계획과 mpITC 신경 세포뿐만 아니라 mpITC와 BLA 사이의 로컬 연결의 속성의 생리 학적 특성을 조사하기 위해 체외 optogenetic 접근 방법과 다른 실험적인 전략에서 대표적인 결과의 워크 플로우를 보여줍니다. 마우스의 뇌에 원하는 좌표 선택된 바이러스 벡터의 정위 주사 후 (도 1A-C 바이러스 발현 시간 2~6주은 실험에 따라), 편도의 주사 부위와 투영 영역의 급성 뇌 조각은 제조 패치 클램프 실험 및 주사 부위 (그림 1D)의 혹 사후 분석을 위해 주입 된 뇌 영역에서 적절한 각도로. 녹음 및 optogenetic 자극, 형광 표지 된 세포 또는 축삭 프로를 시작하기 전에대상 영역 (편도선)에서 용 돌기가 부착 된 ...

Optogenetic 방법이 널리 신경 활동을 조작하고 뇌 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 사용된다. 여기서, 기술은 광학 활성 Channelrhodopsin의 생체 내 발현에 두려움 관련 회로의 특정 장거리 및 지역 신경 연결의 시냅스 속성의 생체 분석을 위해 수 있다는 설명이다.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

본 실험의 전반적인 목적은 ex-vivo 광유전학을 이용하여 신경 투사 및 미세 회로의 기능적, 시냅스적 특성을 조사하는 것입니다. 여기에는 채널 로돕신의 발현과 특정 투사에서의 활성화, 그리고 패치 클램프 기록법의 병행이 포함됩니다. 이 방법은 뇌 영역 내부 및 영역 간의 국소적 및 장거리 연결성의 시냅스 특성에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이는 공포 행동을 뒷받침하는 신경 회로를 조사함으로써 여기서 예시되어 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 전기 자극 기술로는 접근하기 어려운 회로와 시냅스를 연구할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 모든 필수 단계를 최적의 방식으로 수행해야 하는 어려움을 극복해야 합니다.여기에는 바이러스 주입을 위한 정위 표적 설정, 채널 로돕신의 최적 발현 시간 확인, 고품질 뇌 절편 제작, 그리고 안정적인 빛 활성화 및 기록 과정이 포함됩니다. 본 절차를 시작하기 전, 형광 단백질과 융합된 채널 로돕신을 발현하도록 설계된 재조합 아데노 부속 바이러스 벡터를 정위 수술을 통해 내측 전전두엽 피질에 주입하였습니다. 사파이어 칼날을 장착하고 절단 두께를 320 micron으로 설정하여 바이브라톰을 준비하십시오.승인된 방법에 따라 희생시킨 후 뇌를 적출하고, 메스를 사용하여 소뇌를 잘라낸 다음 내측 전전두엽 피질이 포함된 뇌의 전방 부위를 분리합니다. 슬라이싱 전까지 뇌의 전방 부위를 얼음처럼 차가운 절단 용액에 담가 둡니다. 냉각 장치를 사용하여 4 °C로 유지된 얼음처럼 차가운 절단 용액을 절단 챔버에 채웁니다.용액에 산소를 공급하십시오. 여과지로 뇌의 물기를 제거하십시오. 35도 각도로 절단된 4% agar 블록을 바이브라톰 스테이지에 접착하고, 뇌 조직의 후방 부위를 이 블록 위에 접착하십시오.슬라이싱 동안의 안정성을 위해 뇌 블록의 앞과 뒤에 두 개의 한천 블록을 추가로 접착합니다. 조직이 부착된 스테이지를 절단 챔버에 넣고 완전히 잠겼는지 확인합니다. 급성 절편 절단을 시작합니다.각 절편을 절반으로 자른 후 산소가 공급된 실온의 ACSF가 채워진 인터페이스 챔버로 옮깁니다. 급성 편도체 절편을 절단한 후, 인터페이스 챔버를 36°C의 항온수조에 넣고 절편이 35~45분 동안 회복되도록 둡니다. 사후 분석을 위해 주입 부위가 포함된 일부 절편을 두 장의 여과지 사이에 끼워 PBS에 녹인 4% 파라포름알데히드 용액에 하

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐의 뇌에서 기울어진 편도체 슬라이스를 생성하는 방법을 보여줍니다. 뇌는 편도체와 시냅스 연결을 형성하는 내측 전전두엽 피질에서 편도체와 축삭을 포함하는 조각을 얻기 위해 진동 표본 단계에서 비스듬히 배치됩니다. 뇌 절편은 추가 실험을 위해 조직을 보존하기 위해 생리학적 온도로 유지됩니다.

쥐의 뇌에서 기울어진 편도체 조각의 생성

이 비디오는 쥐의 뇌에서 얇은 관상 뇌 절편을 준비하여 내측 전전두엽 피질에서 시냅스 연결이 풍부한 편도체 영역을 노출시키는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 조각은 신경세포의 생존력을 유지하기 위해 산소가 공급된 인공 뇌척수액에서 회수됩니다.

Generating a Coronal Brain Slice: Exposed the Amygdala Regions from a Mouse Brain (코로나 뇌 슬라이스 생성하기: 쥐의 뇌에서 편도체 영역 노출)

이 비디오는 뉴런 특이적 형광 단백질을 포함하는 형질전환 뇌 절편에서 전기 활동을 동시에 이미징하고 기록하는 방법을 설명합니다. 이 절차에는 폭기된 인공 뇌척수액이 있는 관류 챔버에서 뇌 절편을 유지하고, 광원을 사용하여 형광 표지된 세포를 여기시키고, 다중 채널 프로브 및 패치 클램프로 전기 신호를 기록하는 것이 포함됩니다.

뇌 절편에 있는 신경 세포의 동시 광학 및 전기 생리학적 모니터링

이 비디오는 생쥐의 급성 편도체 뇌 절편을 사용하여 내측 전전두엽 피질(mPFC)과 편도체 뉴런 사이의 시냅스 연결성을 분석하는 절차를 보여줍니다. 이 마우스의 mPFC 뉴런은 형광 단백질에 융합된 채널로돕신을 발현합니다. 채널로돕신은 광 활성화 시 mPFC 뉴런에서 이온 유입 및 활동 전위 생성을 촉진합니다. 결과적으로, mPFC 뉴런은 시냅스후 편도체 뉴런에 결합하는 신경전달물질을 방출하여 mPFC-편도체 연결성을 시각화하기 위해 기록된 시냅스후 전류를 트리거합니다.

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice(편도체 뇌 절편에서 신경 경로의 시각화 및 매핑)

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

이 프로토콜은 생체 뇌 슬라이스에서 광유전학 자극을 사용하여 먼 뇌 영역에서 장거리 입력의 세포 유형 특정 기능적 연결을 식별하는 일련의 방법을 설명합니다.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

생체 외 뇌 조각은 구 심성 입력에 대한 유발 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학은 시상피질 및 피질 피질 구심성을 비원발성 신피질에 독립적으로 활성화하는 데 사용되며 시냅스 및 네트워크 반응은 이소플루란으로 조절됩니다.

뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

관찰적 공포 패러다임은 설치류의 대리 동결을 정서적 공감의 모델로 평가합니다. 이 절차는 관찰자 설치류를 특정 시연자에 노출시켜 혐오스러운 발 충격을 받아 공감적 동결 반응을 이끌어내는 것을 수반합니다. 관찰 공포 분석을 사용함으로써 연구자들은 정서적 공감의 기저에 있는 신경 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

생쥐의 정서적 공감 모델로서의 관찰 두려움

배우세요 뇌 조각의 공포 회로를 예 생체 옵토제네틱스로 해부하는 방법을. 채널로돕신 발현과 패치클램프 기록을 통해 시냅스 특성을 분석하여 신경 미세회로의 기능을 연구할 수 있습니다.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

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