Name: 인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 학습하세요 인간 뇌하수체 선종 세포를 알긴산 비드에서 3차원 배양하는 방법을. 이 기술은 종양 침윤성 마커 발현 연구에 활용되며 생물학적 특성 분석에 적합합니다.

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O. Rios씨의 기술 지원에 감사드립니다.

본 연구는 의료 기관 및 국립 폴리 테크닉 대학의 연구 및 고급 연구 센터의 로컬 윤리위원회에 의해 인간의 물질의 사용이 승인되었다. 1. 종양 샘플 획득 <ol><li> 트랜스 접형골 수술 14 환자에서 뇌하수체 선종 조직 생검을 얻습니다. </li><li> 뇌하수체 샘종 샘플을 수집하고 신선한 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 풍부한 199 배지 (M199), 0.6 ㎎ / ㎖, 중탄산 나트륨, 2.4 ㎎ / ㎖ HEPES, 1 % 50 ㎖를 함유하는 멸균 된 유리 병에 배치 pH가 7.4에서 항생제 (페니실린 / 스트렙토 마이신). 얼음에 유리 병에 샘플을 유지한다. 주 : 종양 조직은 수술 후 몇 시간을 처리 할 수​​있다. </li><li> 얼음에 유리 병 실험실에 종양 샘플을 전송. </li></ol> 효소 조직 해리 솔루션 2. 준비,트립신 억제제 용액 및 알긴산 솔루션 참고 : 세포 배양 과정에 앞서 다음과 같은 솔루션을 준비합니다. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 모든 솔루션 필터. <ol><li> M199-혈청 5 ml의 콜라겐 (유형 I) 5 ㎎을 용해시켜 1 % 콜라게나 제 용액을 제조 하였다. </li><li> PBS-0.3 % EDTA 10 ml의 트립신 0.01 g을 용해하여 0.01 % 트립신 용액을 준비한다. </li><li> M199-혈청 20ml에 대두 트립신 억제제 2 ㎎을 용해시켜, 0.1 % 트립신 억제제 용액을 제조한다. </li><li> 트립신 저해제 용액 4 ㎖에의 DNase I 134 U / ml의 20 ㎕의 용해 DNase의 용액을 준비한다. </li><li> 155 mM의 NaCl을 40 mL의 EGTA 22.8 mg을 용해시켜 EGTA 용액 (1.2 M)를 준비한다. 7.4 pH를 조정합니다. 50 ㎖의 최종 부피를 계속합니다. </li><li> 155 mM의 NaCl을 50 mL에 238 mg을 용해시켜 HEPES HEPES 용액 (20 mm)를 준비한다. </li><li> 1.2에 용해시켜 1.2 % 알지네이트 용액을 준비HEPES 용액 100ml에 g 알긴산 나트륨. 알긴산 솔루션을 압력솥. </li><li> pH는 7.4로 조정 한 50 ㎖ HEPES 용액에 CaCl2를 750 mg을 용해시켜 칼슘 용액 (102 mm)를 준비 </li></ol> 3. 주요 세포 배양 및 알긴산 캡슐 <ol><li> 층류 캐비닛 내부, 약 20 ml의 PBS 자유 칼슘 및 마그네슘 2+의 pH 7.4 (PBS *)를 함유하는 35mm 페트리 접시에서 종양 조직을 배치했다. </li><li> 부드럽게 조직을 씻어 외과 트위터와 조직을 가지고 신선한 PBS * 포함 된 다른 배양 접시에 넣습니다. 적혈구 나 이물질이 제거 될 때까지이 단계를 반복합니다. </li><li> 수술 집게를 사용하여, 뇌하수체 선종 조직을 보유하고 작은 수술 용 가위로 작은 조각으로 잘랐다. 둥근 모서리 파스퇴르 피펫, RT에서 10 분 동안 68 XG에, 15 mL의 원심 분리 튜브에가 조직 단편 PBS * 옮긴다. 참고 : 파스퇴르의 가장자리를 둥글게하기피펫은, 약간 분젠 버너에 피펫의 끝을 불꽃. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS *를 제거하고 (약 조직의 65mm 3 5 ml)을, 반전에 의해 2 ~ 3 배를 혼합 콜라겐 솔루션의 3-5 ml를 추가합니다. 일정한 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 콜라게나 제의 조직을 인큐베이션. </li><li> 실온에서 10 분 동안 68 XG에 튜브를 원심 분리기와 파스퇴르 피펫으로 콜라게나 제를 제거합니다. </li><li> 다음, RT에서 10 분 동안 68 XG에서 튜브를 원심 분리하여, DNase를 5 mL를 첨가하고, 반전하여 2 ~ 3 배를 섞는다. 주 : 조직이 완전히 해리되지 않는 경우 37 ° C에서 3 분간 트립신 제 효소 소화를 수행한다. 트립신 저해제 용액이 양의 첨가에 의해 분해를 정지. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 뜨는을 대기음 및 폐기합니다. EGTA 용액 1 볼륨의 펠렛을 다시 중단하고 알긴산 용액의 2 권과 혼합. </li><li> 조심스럽게 세포 현탁액과 알긴산 염을 혼합파스퇴르 피펫과 피펫 팅에 의해. , 21 G 바늘 멸균 주사기를 가지고 플런저를 제거; 알긴산 및 세포 용액으로 주사기를로드 피펫을 사용합니다. </li><li> 부드럽게 주사기에 플런저를 삽입하고 신중 알긴산 세포 용액을 드롭하여 드롭 칼슘이 풍부한 용액 약 30 ㎖를 함유하는 유리 비커에 분배. </li><li> 약 5cm까지 염화칼슘 2 용액을 주사기의 바늘을 놓습니다. CaCl2를 접촉에 알긴산 세포 현탁액 겔 구형 비드를 형성한다. 5 분 동안 용액에 칼슘 알기 네이트 비드 유지. 참고 : 구슬이 삭제되는 유리 비커를 저어. 서로 달라 붙는 것을 방지하기 위해, 원형 운동에서 손으로 천천히 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 파스퇴르 피펫과 칼슘 용액을 제거하고, FBS의 20 %로 농축 M199의 3 ~ 5 ㎖로 두 번 구슬을 씻는다. </li><li> 일반 T25 조직 배양에 알긴산 비드 전송멸균 플라스크 주걱을 사용하여 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 M199 4-5 ml를 20 % FBS가 풍부한 배양 추가한다. 모든 셋째 날 문화 매체를 변경합니다. </li></ol> 4. 알긴산에서 세포를 해방 주 : 앞서가 알긴산 비드로부터 세포를 해방하는 폴리 D 리신 코트 13mm 직경을 커버 슬립. 주의 : 황산은 부식성이 강한 산성이며, APTS는 눈과 피부에 자극을 줄 수 있습니다. 이러한 시약을 처리하기 위해 라텍스 장갑을 사용합니다. <ol><li> 흄 후드에서 포인트 집게와 RT에서 1 시간 동안 20 % 수성 황산을 함유하는 유리 페트리 접시에 몰입 된 커버. </li><li> 황산을 경사 분리하고, 5 분마다 증류수로 커버 슬립 다섯 번 세척 하였다. 포인트 트위터 장소 RT 15에서 5 분 동안 0.1 M 수산화 나트륨을 포함하는 배양 접시에서 깨끗한 커버 슬립을 사용. </li><li> 수산화 나트륨을 가만히 따르다 및 증류하여 한 번에 씻어인도 물, 물을 기음과 커버 슬립을 건조. </li><li> 4 분 APTS (아미노 프로필 - 트리에 톡시 실란)로 코팅 된 커버를 마이크로 피펫을 사용 증류수로 페트리 접시 홍수 (6 커버 슬립 500 μl를 사용). 빨리 물을 기음과 물이 아래에 침투 할 수 있도록 포인트 핀셋으로 된 커버를 이동, 증류수로 세척하는 것을 계속한다. </li><li> 물을 기음과 커버 슬립을 건조, 깨끗한 페트리 접시에 포인트 트위터 장소를 커버 슬립을 사용하여 3 시간, 45 초 각시 전자 레인지 내부를 소독. 폴리 D 라이신 100 μg의 (0.1 ㎎ / ㎖)을 멸균 1,000 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 5 분 동안 폴리 D 라이신 약 50 μL로 커버 슬립을 부화. 완전히 폴리 D 라이신 대기음. 주 : 배지에 가용성 폴리 -D- 라이신 세포 증식을 억제 할 수 있기 때문에 중요하다. </li><li> 5 분마다 커버 슬립을 멸균 수로 5 회 헹군다. 일을 기음erile 물과 허용 된 커버는 층류 캐비닛 내부 건조합니다. </li><li> 액틴 세포 골격을 분석, 알긴산에서 뇌하수체 세포를 유리. 1 ML의 피펫 팁을 사용하여 배양 플라스크에서 알지네이트 비드의 일부를 가지고 15 ML 튜브에 배치합니다. </li><li> 55 mM의 시트르산 나트륨 5 ㎖ 추가 RT에서 10 분 동안 68 XG에 원심 분리기 (323.6 나 3 C 6 H 5 O 7 ㎎, 2 H 2 O 20 ML의 HEPES 용액을 용해). 뜨는을 대기음 및 폐기합니다. </li><li> 20 % FSB 풍부 따뜻한 M199 1 ㎖의 펠렛을 다시 일시 중지; 부드럽게 파스퇴르 피펫 세포 현탁액을 혼합한다. 주의 : Phalloidin의 및 DAPI는 독성이. 이러한 시약을 처리하기 위해 장갑을 사용합니다. </li><li> 세포를 계산 1.5 ML 튜브에 0.4 % 트리 판 블루 용액 125 μl를 전송합니다. M199 75 μL와 마지막 단계 (희석 배수 = 5)에서 수득 된 세포 현탁액 50 μL를 추가한다. 철저하게 섞는다. </li><li> PLAC하는 마이크로 피펫 팁을 사용하여혈구 챔버의 트립 판 블루 세포 현탁액 즉 약 10 μL. </li><li> 위상차 조명 도립 현미경을 이용하여 혈구 계수기의 셀 개수. 1mm 센터 광장과 네 1mm 코너 사각형의 모든 세포를 계산합니다. 희석 인자에 의해 단위 면적당 평균 개수를 곱하여 밀리리터 당 세포 밀도를 얻기 -. 10 (4), 예를 들어 단위 면적당 평균 개수는 45 셀 × 5 × 104 = 2.25 × 106 세포 / ml 인 경우. 참고 : 혈구 챔버의 열 사각형의 셀을 계산합니다. 아래쪽과 오른쪽에 중간 선을 터치 세포를 계산하지 마십시오. </li><li> 시드 폴리 D 라이신으로 피복 13mm 직경 커버 글라스에 35,000 세포. </li></ol> 5. 액틴 세포 뼈대 배열 <ol><li> 문화 48 시간 후, 파스퇴르 피펫으로 배양액을 제거하고 신속 PBS의 커버 슬립 당 ​​500 μl를 추가, 즉시 PBS를 제거합니다. </li><li> t 수정하고 Permeabilize 하시려면37 °에서 10 분 동안 고정 완충액 (0.1 M PIPES, pH가 6.75, 4 %의 PEG-6000, 1mM의 EGTA, 1mM의 황산, 0.5 % 트리톤 X-100, 2 % 포름 알데히드)의 커버 슬립 당 500 μL와 그 셀 기음 </li><li> 고정 버퍼를 제거하고 실온에서 30 분 동안 PBS에서 3.5 % 파라 포름 알데히드의 coverslip에 500 μl를 추가합니다. 파라 포름 알데히드 용액을 제거합니다. </li><li> 5 분마다 PBS의 커버 슬립 당 ​​500 μl를 추가하여 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 일정한 교반에, RT에서 커버 슬립을 씻어. </li><li> 10 분 동안 50 mM의 염화 암모늄으로 세포를 인큐베이션 염화 암모늄 용액을 흡인하고, 단계 5.4를 반복한다. </li><li> 30 분 동안 PBS에 1 % BSA (IgG의 프리 프로테아제 무)로 세포를 인큐베이션 BSA 용액을 제거하고, 단계 5.4를 반복한다. </li><li> 실온에서 7 분, 단계를 반복 5.4 로다 민 - 복합 팔로이 딘의 50 μM과 세포를 품어. </li><li> RT에서 5 분, 단계를 반복 5.4 PBS에 희석 DAPI의 255 μM와 세포를 품어. 마지막으로 t 마운트그는 장착 매체로 된 커버와 매니큐어로 밀봉. </li><li> 541 nm의 여기 파장 63X 대물 렌즈와 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용 액틴 세포 골격 배열의 이미지를 획득. </li></ol>

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이 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 제는 세포 배양 물 모두에서 영양소와 가스 확산 동일한 조건을 유지하는 데 필요한 비드 크기의 균일 성이다. 우리의 경험에 의하면, 알긴산 비드를 만들기 위해 21 G 바늘의 사용은 균일 한 비드 크기의 효율적인 문화의 취득이 가능합니다. 두번째 중요한 요소는 바늘의 거리이고; 이 거리는 칼슘 용액을 5 센티미터 칼슘 용액의 표면에 알긴산 / 세포 용액의 흐름의 충돌에 의한 변형 진주 사균을 방지하는 것보다 더 없어야한다. 세 번째 중요한 단계는 비드가 서로 달라 붙는 것을 방지하기 위해 감소 된 유리 교반한다. 고르지 세포 캡슐화의 결과를 나와. 이 프로토콜의 일부 수정이 경험은, 예를 들면, 연구 문제의 와트 따라 혼합 될 수 알긴산 나트륨 용액을 수행 할 수있다기저막 IV 형 콜라겐 등의 단백질, 및 전술 한 프로토콜에 따라 i 번째, 입체 알긴산 지지체를 얻었다. 또 다른 가능성은 15mm 직경의 우물의 알긴산 쿠션을 부...

들은 배양 된 세포에 대한 입체 구조적지지 및 세포 간 통신 (1)의 유지 보수를 제공하기 때문에 삼차원 지지체 광범위 세포 배양에 사용되어왔다. 천연 유래 고분자 물질은 I 형 콜라겐, 키토산, 알긴산 등 3 차원 지지체를 만들기 위해 사용되었다. 알긴산은 갈색 해조류의 Macrocystispyrifera (다시마)에서 파생 된 천연 중합체이다. 이러한 중합체는 β-D-만누 산 (M) 및 α-L-guluronic 산 (G), 예컨대 칼슘 및 바륨과 같은 특정 가의 양이온의 존재 하에서 2 형태 안정한 겔 반복 단위로 구성된다. 염화칼슘 (CaCl2를) 솔루션은 일반적 알긴산 비드를 형성하는 가교 결합 시약으로 사용된다. 알긴산 솔루션은 즉시 입체 구형 겔을 형성 염화칼슘 (2)로 떨어졌다. 알지네이트 용액을 세포와 혼합 될 때, 세포는 알긴 B로 캡슐화EADS 3. 알긴산은 그것을 활성화 특성 연골 4, 5 및 골격 근육 모세포 신경줄 기세포 6 포함한 세포의 다양한 밀봉 용 매트릭스로서 사용되어야한다. 불활성 물질이며, 영양분, 산소 및 세포의 생존과 기능을 유지 대사 산물의 확산을 허용한다; 또한, 다른 겔 기반 배양 시스템과 달리, 알긴산 비드 내 배양 세포는 소듐 시트 레이트, 칼슘 킬 레이터를 사용하여 지지체로부터 유리 될 수 있고, 세포를 추가로 조사 7 수확 할 수있다. 뇌하수체 선종은 일반적으로 낮은 확산 속도와 양성 종양이다. 쥐 뇌하수체 선종 세포주 이차원 시스템 (8)에서 성공적으로 배양되었다. 그러나, 인간의 뇌하수체 분비 세포 종양이 배양 효율적인 발전 아니다; 분산 뇌하수체 종양 세포 성장 저조한배양, 세포 부착 및 확산 제한을 나타내고, 상기 세포는 전형적으로 배양 접시 9,10 부동 응집체를 형성한다. 몇몇 시도가 효소 및 기계적 분산 방식 (11)만으로 기계식 분산 방식 (12) 및 암 (10)의 이식편 배양 포함한 뇌하수체 종양 세포 현탁액을 수득되었습니다. 이러한 방식으로, 다른 저자는 시간의 다른 기간 동안 가능한 자기편 문화를 얻었다. 종양 분비 세포의 용량은 종양 유형 및 확산 속도에 의존하는 이들 9 이차원 시스템에서 생존한다. 그러나, 장기간 배양 섬유 아세포 표현형을 가진 세포를 11,13은 우세. 이 논문은 상기의 상세한 분석이 가능 알긴산 지지체 그들을 해방 알긴산 비드 캡슐화 뇌하수체 선종 세포 초대 배양을 얻는 방법을 설명자신의 세포 생물학, 예를 들어, 자신의 세포 골격 준비의 측면.

<table><tbody><tr><td><강한>시약&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>199 문화 매체&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>31100-027</td><td>문화를 위해, 37 &deg에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조&nbsp;</td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 나트륨 (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N&acute;-2ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 I 형</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>트립신&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)</td><td>연구 유기물</td><td>3002E</td><td></td></tr><tr><td>소르빈 트립신 억제제&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>2139</td><td></td></tr><tr><td>알긴산, Macrocystis pyrifera (다시마)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A-2158</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 (CaCl2)</td><td>J.T. Baker</td><td>1332</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 (Na3C6H5O7)</td><td>J.T. Baker</td><td>3646</td><td></td></tr><tr><td>Piperazine-N,N&prime;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td><td>Research Organics</td><td>9624P</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 6000 (PEG 6000)</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene 글리콜 테트라아세트산(EGTA)</td><td>Research Organics</td><td>9574E</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 설페이트(MgSO4)</td><td>J.T. Baker</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄(NH4Cl)</td><td>J.T. Baker</td><td>660</td><td></td></tr><tr><td>BSA 소 혈청 알부민 IgG-Free</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash; 테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이</td><td>트 시그마</td><td>P1951</td><td>독성. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드 (DAPI)</td><td>인비트로겐&nbsp;</td><td>D1306</td><td>독성. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>황산 (H2SO4)</td><td>J.T. Baker</td><td>9681</td><td>부식성이 높습니다. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>수산화나트륨(NAOH)</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td>눈과 피부에 자극을 일으킬 수 있습니다. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>(3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTS)</td><td>Sigma</td><td>A-3648</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신 하이드로브로마이드</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션</td><td>Sigma</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>이름&nbsp; &nbsp; </td><td>회사&nbsp; </td><td>카탈로그 번호&nbsp; </td><td>코멘트</td></tr><tr><td>장비&nbsp; </강한></td><td></td><td></td><td>독성: 암을 유발할 수 있음. 이 시약을 다루려면 장갑을 사용하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>로테이터&nbsp;</td><td>Boekel Scientific</td><td>모델 230300</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>DuPont Corporation&nbsp;</td><td>모델 sorvall TC6</td><td></td></tr><tr><td>쉐이커&nbsp;</td><td>랩라인 기기</td><td>모델 314-820&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

삼차원 배양 방법을 설명하는 기본 뇌하수체 샘종 세포 알긴산 비드에서 성장된다. 알긴산 갈색 해조류 유래의 중합체이다. 간략하게, 종양 조직은 작은 조각으로 절단하고 콜라겐와 트립신 효소 소화에 제출된다. 이어서, 세포 현탁액이 얻어진다. 종양 세포 현탁액을 1.2 %의 알긴산 나트륨과 혼합 CaCl2를 적하하고, 알긴산 / 세포 현탁액을 구형 비드를 형성하기 위해 염화칼슘 2 접촉 겔화된다. 알긴산 비드에 포함 된 세포를 20 % FBS가 풍부한 배지에서 제공 영양분 공급된다. 알긴산 비드의 삼차원 배양 4 개월까지 장시간 선종 세포의 생존력을 유지한다. 또한, 세포는 시트르산 나트륨과 함께 비드를 세척하여 알긴산으로부터 해방 또한 면역 세포 화학적 분석을위한 커버 글라스에 접종 할 수있다. CEL의 사용난 문화 모델은 최소한의 해체와 액틴 세포 골격의 고정 및 시각화 수 있습니다. 요약하면, 알긴산 비드 뇌하수체 샘종 세포의 유지를위한 안정적인 배양 시스템을 제공한다.

이 프로토콜은 문화와 다양한 기간에 대한 알지네이트 비드의 선종 뇌하수체 세포의 유지 보수에 성공적으로 적용되었다 삼개월 후 1 쇼를 알지네이트 비드에 포함 된 셀을줍니다.; 이 세포는. 거꾸로 광학 현미경 (그림 1)에서 이중 굴절 둥근 모양을 나타내는 2 알긴산에 포함 된 쥐의 뇌하수체 선종 세포에서 N-cadherin의 국산화를 보여줍니다. N-cadherin의 세포 세포 연락처 (그림 2A와 2C)에서 지역화 및 핵 (그림 2B와 2C) 확장 염색질을 보였다. 알긴산 비드 종양 세포는...

알긴산 비드의 3차원 배양은 단순성과 재현성으로 인해 뇌하수체 선종 세포를 유지하기 위해 선택되었습니다. 이 절차에는 초기 효소 분해 및 종양 조직의 기계적 해리가 포함되었으며, 후속 세포 현탁액은 알긴산 비드로 캡슐화되었습니다.

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

본 방법의 전반적인 목표는 인간 뇌하수체 선종 세포를 유지하기 위한 3차원 알긴산 비드 배양법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 침습성의 다양한 마커 발현과 같이 종양 세포 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 3차원 시스템과 달리 알긴산 스캐폴드를 통해 뇌하수체 선종 세포를 알긴산 비드로부터 분리하여 추가 연구에 활용할 수 있다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 연구원인 Carmen Solano-Agama가 진행하겠습니다. 우선, 층류 작업대(laminar flow cabinet) 내부에서, 약 20 milliliters의 칼슘 및 마그네슘 제거 PBS가 담긴 35 millimeter 디시에 미리 확보한 선종 종양 조직을 넣습니다. 수술용 핀셋을 사용하여 조직을 신선한 PBS가 담긴 다른 페트리 접시로 옮겨 조직을 세척합니다.적혈구와 잔해물이 제거될 때까지 신선한 완충액으로 전이 과정을 반복합니다. 다음으로, 수술용 핀셋으로 뇌하수체 선종 조직을 잡고 소형 수술용 가위로 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음, 끝이 둥근 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 파편과 완충액을 15 milliliter 튜브로 옮깁니다.실온에서 68 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS를 제거하고, 콜라게나제 용액 3~5 mL를 첨가합니다. 튜브를 뒤집어 2~3회 혼합한 후, 조직을 콜라게나제 내에서 37 °C로 유지하며 일정하게 회전시켜 30분 동안 배양합니다.튜브를 다시 10분 동안 원심분리한 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 콜라게나제 용액을 제거합니다. TNase 5 milliliters를 첨가하고 2~3회 반전 혼합한 다음, 샘플을 다시 원심분리합니다. 조직이 완전히 해리되지 않은 경우, 텍스트 프로토콜에 따라 2차 효소 소화를 수행합니다.다음으로, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 EGTA 용액 1부피를 사용하여 펠렛을 재부유시키고, 알지네이트 용액 2부피와 부드럽게 혼합합니다. 21게이지 바늘이 장착된 멸균 주사기에서 플런저를 제거하고, 피펫을 사용하여 알지네이트 및 세포 혼합액을 주사기에 채웁니다.플런저를 주사기에 부드럽게 삽입하고, 주사 바늘을 염화칼슘 용액에서 약 5cm 떨어진 비커 내부에 위치시킵니다. 이제 알긴산 세포 현탁액을 비커에 한 방울씩 조심스럽게 분사합니다. 현탁액은 용액과 접촉하는 즉시 젤화되어 구형의 비드를 형성합니다.비즈가 서로 달라붙지 않도록 유리 비커를 원형으로 천천히 저어줍니다. 그런 다음 알지네이트 비즈를 염화칼슘 용액에 5분 동안 둡니다. 배양 후, 칼슘 용액을 조심스럽게 제거하고 20% FBS가 첨가된 M199 3~5 mL를 사용하여 비즈를 두 번 세척합니다.멸균된 스파튤라를 사용하여 알지네이트 비드를 일반 T25 조직 배양 플라스크로 옮기고, FBS가 포함된 M199 4~5 mL를 첨가합니다. 습윤 인큐베이터에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 배양합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 따라 poly-D-lysine이 코팅된 커버슬립을 준비합니다.액틴 세포골격을 분석하려면, 피펫을 사용하여 배양 플라스크에서 1mL의 alginate beads를 15mL 튜브로 옮깁니다. 55mM sodium citrate 5mL를 첨가하고, 상온에서 68×g로 10분 동안 원심분리합니다. 그 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.20% FBS가 첨가된 따뜻한 M199 1 mL를 사용하여 펠릿을 현탁하고 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 그 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 세포 수를 측정한 후, 13 mm 직경의 poly-D-lysine 코팅 유리 커버슬립에 35,000개의 세포를 분주합니다. 세포를 48시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 PBS를 사용하여 세포를 1회 세척합니다.그런 다음, 세포를 고정 및 투과화하기 위해 커버슬립당 500 µL의 고정 버퍼를 첨가하고 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 고정 버퍼를 제거하고 커버슬립당 500 µL의 3.5% paraformaldehyde in PBS를 첨가합니다. 이후 상온에서 30분 동안 배양한 다음 용액을 제거합니다.마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 세척하고 rhodamine이 접합된 phalloidin 및 dapi 용액에서 배양한 후, 63x 대물렌즈와 541 excitation 파장을 사용하는 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 액틴 세포골격의 이미지를 획득하십시오. 이 그림은 3개월 후 alginate 비드에 내포된 뇌하수체 선종 세포를 보여줍니다. 여기에서 보는 바와 같이, 세포는 도립 광학 현미경 하에서 복굴절을 띠는 둥근 형태를 나타냅니다.이 그림에서는 알긴산에 매립된 쥐 뇌하수체 선종 세포 내 N-cadherin의 국소화를 확인할 수 있습니다. N-cadherin은 세포 간 접촉 부위에 국소화되어 있으며, 핵에서는 염색질이 확장된 모습이 나타납니다. 본 실험에서는 10개의 비기능성 인간 뇌하수체 선종을 대상으로 Ki67 면역 반응성을 이용하여 증식 지수를 구하였으며, 19.2 ± 1.5%의 평균 표지 지수를 얻었습니다.여기에서 비침습성 세포의 액틴 세포골격은 작은 액틴 스트레스 섬유를 포함한 신장된 형태를 보였습니다. 배양 시스템과 관계없이 뇌하수체 선종에 따라 액틴 필라멘트의 배열과 밀도가 다양하게 나타났습니다. 예를 들어, 비기능성 침습성 선종의 경우, 이러한 세포들 사이에서 지배적인 형태는 둥근 모양이었으며 액틴 필라멘트의 불연속적인 피질 링 구조가 관찰되었습니다.숙달되면 1차 뇌하수체 선종 배양은 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 알긴산 캡슐화는 적절하게 수행될 경우 15분 만에 완료 가능합니다. 이 절차를 수행할 때는 알긴산 세포 용액의 흐름이 칼슘 용액의 표면과 충돌하여 펄이 단단해지거나 세포가 사멸하는 것을 방지하기 위해, 바늘과 칼슘 용액 사이의 거리를 5 cm 이내로 유지하는 것이 중요합니다.이 절차 이후, 뇌하수체 선종 세포가 이 3차원 스캐폴드 내에서 세포골격을 어떻게 조직하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 알지네이트 비드의 고정 후 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 탈수 처리와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 3차원 알지네이트 비드 배양에서 뇌하수체 선종 세포를 유지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

three-dimensional-alginate-bead-culture-human-pituitary-adenoma

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

우리는 neuroendocrine 암 세포 라인을 사용하여 3D 다세포 spheroids를 성장하는 간단한 아가로 오스 오버레이 플랫폼을 소개합니다. 이 방법은 neuroendocrine 종양 세포에 치료 약물의 효과를 시험하는 매우 편리한 방법을 제공합니다. 그것은 또한 우리가 암 치료를 위해 인간 neuroendocrine 종양의 spheroids을 설정하는 데 필요한 도움을 수 있습니다.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

이 비디오는 신경교세포의 3차원 배양을 확립하는 기술을 보여줍니다. 쥐 뇌 유래 신경교세포는 세포외 기질 성분을 포함하는 광가교결합 가능한 고분자 기질 내에 캡슐화되어 있습니다. 성장 배지에서 배양하면 신경교세포가 지지 매트릭스 내에서 증식하여 3차원 배양을 생성합니다.

쥐의 뇌 유래 신경교세포(Rat Brain-derived glial cell)의 3차원 배양 확립

이 동영상은 뇌종양에서 유래한 신경교종구(gliomasphere)가 어떻게 단세포로 분리되어 히알루론산 기반 하이드로겔에 캡슐화되는지 보여줍니다. 이 과정은 세포-세포 상호 작용을 촉진하여 구조화된 3차원 교모세포종 모델을 형성합니다.

교모세포종 세포의 3차원 배양을 위한 히알루론산 기반 하이드로겔

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다.

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

암세포를 콜라겐 겔에 삽입한 다음 무세포 피브린 겔에 끼워 넣어 위성 종양의 침습성과 형성을 모니터링할 수 있는 3D 배양 시스템을 생성합니다.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

여기, 우리 두뇌 매트릭스를 모방 하도록 설계 하는 기가 가변 생체 내의 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한 프로토콜을 제시. 이 접근 한 생체 외에서세포종 세포 vivo에서 일반적으로 문화에서 길을 잃 었의 많은 특성을 유지 하는 실험 플랫폼을 제공 합니다.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

뇌하수체는 신체의 내분비 시스템의 핵심 조절자입니다. 이 기사는 생물학과 기능이 제대로 이해되지 않은 땀샘의 줄기 세포 집단을 연구하기 위해 새로운 3D 시험관 내 모델로서 마우스 뇌하수체에서 오가노이드의 발달을 설명합니다.

뇌하수체 줄기 세포 생물학을 탐구하기 위해 시험관 내 모델로 마우스 뇌하수체에서 오가노이드 개발

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

학습하세요 인간 뇌하수체 선종 세포를 알긴산 비드에서 3차원 배양하는 방법을. 이 기술은 종양 침윤성 마커 발현 연구에 활용되며 생물학적 특성 분석에 적합합니다.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

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