(: C I) 바이러스 성 모방 폴리와 중간 임신 단계에서 마우스의 모성 면역 활성화 유도

이 절차의 전반적인 목적은 임신 중기 배아 단계에서 바이러스 모사체인 poly를 복강 내 주사하여 생쥐에게 모체 면역 활성화(maternal immune activation, MIA)를 유도하는 것입니다. 이 방법은 면역 기능 장애가 뇌 발달 및 행동의 교란으로 어떻게 이어질 수 있는지와 같은 신경 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자폐증 및 조현병의 환경적 위험 요인으로서 MIA를 연구하고자 하는 연구자들을 위해 특별히 설계되었다는 점입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 MIA 유도 방법의 작은 차이가 자손의 하위 반응을 크게 변화시킬 수 있기 때문입니다. 시기 조절 교배 쌍을 설정하려면, 먼저 다섯 마리의 암컷 마우스를 표준 마우스 케이지에 각각 옆 케이지에 함께 수용하여 발정 주기를 동기화하고, 이어펀치(ear punch)를 사용하여 각 개체를 표시합니다. 암흑 주기가 시작되기 0~2시간 전에 암컷 마우스를 케이지당 두 마리씩 수용하고, 각 마우스의 체중을 측정하여 기록한 후, 두 마리의 암컷이 있는 케이지당 수컷 마우스 한 마리를 추가합니다.

명암 주기 중 암기가 종료된 후 0~4시간 사이에 암컷 생쥐의 꼬리 기부를 조심스럽게 들어 올려 동물이 앞발로 케이지 그리프를 잡게 한 다음, 질 입구에 흰색 덩어리가 있는지 확인합니다. 플러그가 보이지 않는 경우, 200 µL 피펫 팁을 질 입구에 조심스럽게 삽입합니다. 응고로 인한 저항이 느껴지면 플러그가 형성된 것으로 확인합니다.

질 플러그(vaginal plug)의 존재는 교미가 일어났음을 확인해 줄 뿐이므로, 플러그가 확인된 마우스들을 새로운 케이지에 그룹화합니다. 배아기 10.5일에서 11.5일 사이에, 플러그가 확인된 암컷 마우스 각각을 꼬리 기부로 들어 올려 복부의 팽창 여부를 확인한 후, 마우스의 체중을 측정하여 임신 여부를 검증하고 임신한 동물들을 개별 깨끗한 케이지에 수용합니다. 50 milliliter 원추형 튜브에 poly(I:C) 분말의 무게를 잽니다.

배아기 12.5일에, 코니컬 튜브에 들어있는 poly(I:C)의 부피에 맞는 적정량의 0.9% sodium chloride를 첨가하고 캡을 닫습니다. 용액이 투명해질 때까지 식염수 방울이 분말 전체에 닿도록 튜브를 부드럽게 굴려줍니다. 그 다음 튜브를 원심분리하고, poly(I:C) 용액을 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.

분광광도계를 사용하여 poly(I:C) 용액의 260/280 비율을 측정합니다. 제조사에서 명시한 바와 같이, 이 비율은 1.54에서 1.82 사이여야 합니다. 다음으로, 첫 번째 마우스의 체중을 측정하고 계산된 부피에 해당하는 poly(I:C) 용액을 0.3 mL 인슐린 주사기에 충전합니다.

그런 다음, 꼬리를 잡아 마우스를 들어 올려 케이지 상단에 놓고, 목덜미를 잡아 고정합니다. 이제 바늘의 사면이 위를 향하도록 하여, 마우스와 약 20도 각도를 유지하며 두 개의 상부 젖꼭지 중앙에 삽입하고 poly(I:C) 용액을 투여합니다. 이후 마우스를 다시 케이지 안에 넣습니다.

모든 마우스에 주입을 마친 후, 다른 혼란 변수를 방지하기 위해 통행량이 적고 조용한 방에 케이지를 보관하고 다음 날 아침에 마우스의 체중을 측정합니다. 행동 테스트 최소 3일 전에 8~12주령의 성체 모체 면역 활성화(MIA) 후손의 케이지 베딩을 교체합니다. 테스트 30분 전에 마우스를 테스트실에 적응시킵니다.

전펄스 억제 검사를 위해, 마우스를 압전 센서 위의 플렉시글라스 실린더 내에 고정합니다. 120 dB의 화이트 노이즈를 6회 시행하여 마우스가 전펄스 억제 챔버에 5분 동안 적응하도록 합니다. 그 다음, 표에 설명된 대로 무작위로 혼합된 소리에 마우스를 노출시키고, 그 결과를 기저 놀람 반응과 비교하여 MIA 동물의 전펄스 억제 정도를 결정합니다.

오픈 필드 테스트를 위해, 17 by 17 centimeter 크기의 중심 구역이 정의된 개방형 정사각형 아레나의 모서리에 마우스를 두고, 천장 장착 카메라를 통해 10분 동안 마우스의 이동 경로를 기록합니다. 그런 다음 중심 구역 진입 횟수와 중심 구역에서 보낸 시간을 정량화합니다. 마블 매립 테스트의 경우, 5 centimeter 깊이로 압착된 깨끗한 아스펜 소나무 베딩이 깔린 테스트 케이지에 마우스를 10분 동안 적응시킨 후, 마우스를 다시 홈 케이지로 옮기고 테스트 케이지 내에 직경 1.5 centimeter의 남색 유리 구슬 20개를 4 by 5 그리드 형태로 조심스럽게 배치합니다.

이제 마우스를 테스트 케이지로 10분 동안 돌려보낸 후, 동물을 다시 홈 케이지에 넣고 테스트 기간 동안 묻힌 구슬의 수를 측정합니다. 배아 12.5일에 Poly(I:C)를 주입하면 모체-태반-태아 축에서 급성 염증 반응을 유발할 수 있으며, 뇌 발달 및 행동 표현형에 만성적인 영향을 미칠 수 있습니다. 실제로 Poly(I:C)는 주입 3시간 후 모체의 비장, 태반 및 태아의 뇌에서 Il6 유전자의 발현을 증가시킵니다.

일반적으로, 식염수로 처리한 성체 자손과 비교했을 때, MIA 성체 자손은 오픈 필드 테스트(open field test)에서 중심 구역 진입 횟수가 더 적고 중심 구역 체류 시간이 더 짧은 양상을 보입니다. poly(I:C)를 주입한 동물들은 구슬 매립 테스트(marble burying test)에서 더 빈번한 매립 행동을 보이며, 더 낮은 전펄스 억제(pre-pulse inhibition)를 나타냅니다. 소뇌 소엽 7(cerebellum lobule seven)의 푸르키니에 세포(Purkinje cells) 소실은 MIA 자손의 또 다른 특징이며, 식염수를 주입한 대조군과 비교하여 이들 동물의 소뇌 소엽 7에서 calbindin 양성 푸르키니에 세포가 더 적게 관찰됩니다.

이 절차를 수행할 때, MIA 유도 후 임신한 마우스에게 자극을 주지 않는 것이 중요합니다. 이후, 추가적인 환경 상호작용을 연구하기 위해 출생 후 스트레스나 감염과 같은 추가 요인을 유도할 수 있습니다.