Name: (: C I) 바이러스 성 모방 폴리와 중간 임신 단계에서 마우스의 모성 면역 활성화 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 배우세요 중간 임신기 마우스에 바이러스 성 모방 폴리를 복강 내 주사하여 모성 면역 활성화를 유도하는 방법을. 이 기법은 자폐증 및 조현병 연구에서 면역 기능 장애가 뇌 발달에 미치는 영향을 재현 가능하게 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 MIA 모델, 자폐증, 정신 분열증 연구의 발전에 공헌을 위해 후반 박사 폴 H. 패터슨을 존중하고 싶습니다. 우리는이 프로토콜에 대한 그의 위대한 지원 Sarkis K. Mazmanian을 인정; 행정 지원 루벤 M. 바이욘, 이벳 가르시아 - 플로레스, 카렌 C. Lencioni, 그​​리고 레슬리 A. 노이만; 촬영에 도움을 알리 Khoshnan 및 월 C. 코; MIA 유도에 자신의 조언을 일레인 Y. 샤오와 나탈리아 Malkova; 자신의 전문 축산에 대한 제프리 S. 코크, 호아킨 구티에레즈, 콴 F. 리, 제이미로드 리 게스, 로레나 C. 산도발, 나탈리 A. Verduzco. 이 작품은 (폴 H. 패터슨에 NIH 5P50MH086383-04,)를 NIH 콘테 센터 수상에 의해 지원되었다; 자폐증은 (폴 H. 패터슨에 # 7670) 언어; (Sarkis K. Mazmanian에 # 322839) 시몬스 재단; NIH 교육 그랜트 (K.-HC에 NIH / NRSA T32GM07616); (ZY에) 캘리포니아 공과 대학 여름 학부 연구 활동 (SURF); 암젠 학자 캘리포니아 공과 대학에서 (ZY에) 프로그램; 및 박사후 친목 FR톰 국립 과학위원회, 대만 (NSC 101-2917-I-564-039, W.-LW)이다.

모든 프로토콜 기술 기관 동물 관리 및 사용위원회의 캘리포니아 공과 대학 (IACUC)의 승인하에 수행 하였다. 시간 제한 - 결합 쌍 1. 준비 <ol><li> 유전자 발현 분석을위한 최소 6 행동 실험 댐 및 3을 사용합니다. 참고 : 마우스의 약 50 %가 시간 제한-짝짓기에서 연결되는 바와 같이, 추정 암컷 마우스의 두 배 번호를 사용합니다. </li><li> 더 이전의 임신 연령의 8~16주에서 암컷 마우스를 사용합니다. 참고 : 여성 생쥐 수컷 마우스에 앞서 성적 노출을 가지고 있지만 임신되지 않았습니다 허용됩니다. </li><li> 하우스는 여성 마우스는 함께 서로 옆에 자신의 발정주기를 동기화하기 위해 새장을 배치합니다. 5 성인 마우스의 주택 수 있도록 5.5 인치 이상의 높이와 75 평방 인치 내부 바닥과 표준 마우스 케이지를 사용합니다. 귀 펀치를 사용하여 각 여성 마우스 레이블. </li></ol> 2. 시간 제한 매트 설정ING 쌍 <ol><li> 어두운 사이클이 시작되기 전에 시간 제한-짝짓기 0-2 시간을 설정합니다. 각 장에 두 여성 마우스를 놓습니다. 쥐를 가지고 개별적으로 무게. 암컷 마우스의 체중을 기록한다. </li><li> 두 암컷 마우스 각 케이지에 한 남성 마우스를 놓습니다. 부계 교란 효과를 최소화하기 위해 트리오 짝짓기를 사용합니다. </li></ol> 3. 질 플러그 검사 (E0.5) <ol><li> 어두운 사이클 종료 후 암컷 쥐 0-4 시간을 확인합니다. 조심스럽게 꼬리의 기지에서 여성의 마우스를 올리고 마우스가 와이어 그리드, 케이지 상단, 또는 케이지 가장자리를 잡아 할 수 있습니다. </li><li> 질 플러그의 흔적을 검색 질 플러그는 질 입구에서 볼 수 희끄무레 한 덩어리입니다. 플러그가 분명하지 않은 경우, 부드럽게 질구에 200 μL 피펫 팁을 삽입합니다. 응고에서 저항 질 플러그 형성을 확인합니다. 하루에 한 번 질 플러그를 확인합니다. 참고 : 질 플러그 g 때문에하지 않습니다 교미가 발생했음을 만 표시하고,uarantee 임신. 질 플러그는 생쥐의 특정 균주에 식별하기 어려울 수 있습니다. 플러그 식별의 정확성을 높이기 위해 경험이 풍부한 마우스 교사로부터 도움을 얻을 수 있습니다. </li><li> 새 케이지에 연결된 마우스를 이동하고 그룹을 수용. 배아 0.5 일 (E0.5)와 같은 질 플러그 모양의 날을 정의합니다. </li></ol> E10.5-11.5 4. 임신 확인 <ol><li> 조심스럽게 꼬리의 기반을 들어 올려 마우스가 와이어 그리드, 케이지 상단, 또는 케이지 가장자리를 잡아 할 수 있습니다. 임신, 예를 들어, 복부의 팽창 (그림 1)의 징후를 확인하기 위해 복부 영역을 관찰한다. 주 : 임신의 부호는 항상 E10.5보다 E11.5에서 더 분명하다. </li><li> 임신을 확인하기 위해 마우스의 무게를. 임신 한 마우스는 일반적으로 E10.5에서 약 20 % 무겁고 비 임신 한 마우스 (그림 2)에 비해 E12.5에서 30 % 무거운 무게. 단일 집 청소 새장에서 임신 한 쥐. </li></ol> 5. 20 밀리그램 /kg 폴리 (I : C) 준비 <ol><li> 유전자 발현 분석을 위해 그룹 당 적어도 6 행동 실험 군당 댐 (3)를 사용한다. 솔루션 : 폴리 (C I)의 해당 금액을 준비합니다. </li><li> 40 mg / ml의 최종 농도를 확인하기 위해 50 ㎖ 원뿔형 튜브 (C I) 분말 폴리 무게. 최소화 및 주입 부피에 의한 응력을 표준화, 폴리 5 μL를 주입하기 위해 (I : C)의 마우스 체중 (5 μL / g, 5 ㎖ / kg)의 각 그램에 대한 솔루션을 제공한다. kg 당 : (C I) MIA를 유도하기 위해, 우리는 폴리 20 mg을 주입. 주 : 폴리 농도 (I : C) 필요 용액 (20 ㎎ / ㎏) / (5 ㎖ / kg) = 4 ㎎ / ㎖이다. 폴리 때문에 (I는 : C) 분말을 10 % 폴리 포함 된 용액 (I : C)에, 우리는 (4 ㎎ / ㎖) /0.1= 40 밀리그램 / 폴리 ㎖ (C I)의 최종 농도를 확인해야한다. 주의 : 폴리 (I : C) 분말은 매우 가볍다. 원뿔 튜브에 주걱에서 전송하는 동안 어떤 분말을 잃지 않도록주의하십시오. </li><li> 원추형 욕조로 0.9 % 염화나트륨 (식염수)의 해당 볼륨을 추가전자와 뚜껑을 닫습니다. 이 솔루션은 분명하다 때까지 (C I) 분말 부드럽게 폴리 통해 식염수 방울을 압연하여 분말을 용해. 1 분 (그림 3C) 800 XG에 원뿔 튜브를 원심 분리기. (: C I) 0.22 μm의 필터로 해결 폴리를 필터링합니다. 1.5 2 ml의 microcentrifuge 관에 (C I) 솔루션 폴리을 전송합니다. 옵션 : 솔루션 : 폴리 (C I)의 280 분의 260의 비율을 측정하는 분광 광도계를 사용합니다. 비율이 제조자에 의해 설명 된 바와 같이 1.54-1.82 (그림 3) 사이에 있는지 확인하십시오. 참고 : (: C I) 분말 및 멸균 및 제약 학년해야 제어 분사의 역할 폴리을 용해하는 데 사용되는 식염수. </li></ol> 6. 식염수 또는 폴리 (I : C) E12.5에 주입 <ol><li> 규모에 마우스를 달아 케이지에 다시 넣어. (C : I) 마우스 : 체중 (g) (5)에 의해 승산 = 원하는 주입량 (μL) 염 및 폴리 모두 분사 체적을 계산하기 위해 다음 식을 사용한다. 0.3 ML의 INSUL를 사용하여(: C I) 솔루션, 예를 들면, 30g 마우스 150 μL 주사기에 생리 식염수를 계산 볼륨 또는 20 ㎎ / ㎏ 폴리을 그립니다. </li><li> 조심스럽게 꼬리의 기본으로 마우스를 선택하고 케이지의 상단에 배치합니다. 스트레스에 의해 유도 교란 효과를 방지하기 위해 부드럽게 마우스를 처리합니다. 두 개의 상부 젖꼭지 (그림 4)의 중심에 마우스에 약 20 ° 상대, 최대 베벨, 바늘을 삽입하고 식염수 또는 폴리 (I : C) 주입 솔루션을. 주 : 바늘은 주사 후 각 마우스 교체해야합니다. </li><li> 다시 홈 케이지에 마우스를 놓습니다. 다른 교란 효과를 피하기 위해 조용하고 낮은 트래픽 방에 케이지를 놓습니다. </li></ol> 7. 폴리 다음날 (I : C) 사출 (E13.5) <ol><li> 다음 아침에 주입 된 쥐를 확인합니다. 체중을 측정하는 척도를 사용합니다. 참고 : 폴리 : 식염수가 INJ 다음날에 쥐를 주입보다 (I C)는 임신 한 마우스는 일반적으로 적은 체중 증가 주입ection. </li><li> 자식이 태어난 때까지 마우스를 방해하지 마십시오. </li></ol> MIA의 자손의 8 게이지 <ol><li> MIA 유도의 혼란 함을 주죠 영향을 최소화하기 위해, MIA 자손의 사용을 측정하기 위해 아래의 지침을 따르십시오. <ol><li> 쓰레기 크기가 5보다 작은 조기 또는 지연 출생에서, 또는 경우 새끼를 제외합니다. </li><li> 쓰레기 크기가 10보다 큰 경우 CO 2에 의한 과도한 새끼를 안락사. </li></ol></li></ol> 9. 옵션 : MIA 후 급성 염증 반응을 검사 <ol><li> 기관의 동물 관리위원회 승인 프로토콜에 설명 된 방법을 사용하여 주입 : 식염수 또는 폴리 (C I) 후 임신 한 쥐 3 시간을 희생. 주 : 경추 탈구가 종종 댐 배아에 CO 2 / 안락사 약물의 효과를 최소화로 바람직하다. </li><li> 태반과 태아의 브래지어를 성인 임신 한 마우스에서 비장를 수집 및 분리실체 현미경 아래에있다. <ol><li> 비장 컬렉션의 경우, 해부 접시에 마우스를 놓고 임신 한 쥐의 복부에 70 % 에탄올을 스프레이. 피부를 통해 흉곽 아래 복부 영역의 중앙에 수직 컷을 만들기 위해 멸균 가위를 사용합니다. </li><li> 비장은 왼쪽 우수한 복부 사분면에 앉아있다. 비장을 분리 집게를 사용합니다. 기관 주위 지방 조직을 제거하는 섬세한 작업 와이퍼에 비장 롤. 비장 조직의 약 50 mg의 수집 및 핵산 분해를 방지하기 위해 버퍼 또는 트리 졸 안정을 500 μL의 RNA와 에펜 도르프 튜브에 개별적으로 배치합니다. 사용할 때까지 -80 ° C의 냉동고에서 샘플을 저장합니다. </li><li> 태반 수집을 위해, 부드럽게 몸에서 자궁 뿔을 잡아 당깁니다. 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS)로 가득 배양 접시에 자궁 뿔을 놓고 얼음 접시를 둡니다. 자궁 벽을 열고 눈물과 양막 낭을 노출하는 두 개의 집게를 사용합니다. <ol><li>조심스럽게 태반과 태아를 손상시키지 않고 양수 주머니를 열려면 집게를 사용합니다. 태아의 태반을 분리하고 가능한 한 태반에 가까운 탯줄을 잘라. 태반에서 양막 낭 파편을 제거합니다. 개별적으로 버퍼 또는 트리 졸 안정을 500 ㎕의 RNA와 에펜 도르프 튜브에 태반을 놓습니다. 사용할 때까지 -80 ° C의 냉동고에서 샘플을 저장합니다. </li></ol></li><li> 태아의 뇌 수집을 위해, 해부 할 때까지 단계 9.2.2에서 버퍼를 안정 RNA에 태아를 저장합니다. 실체 현미경 아래에서 섬세 # 5 집게를 사용하여 뇌의 뇌실에서 pial 멤브레인을 애타게. 조심스럽게 태아의 뇌에서 모든 막을 제거합니다. 개별적으로 버퍼 또는 트리 졸 안정을 500 ㎕의 RNA와 에펜 도르프 튜브에 태아의 두뇌를 놓습니다. 사용할 때까지 -80 ° C의 냉동고에서 샘플을 저장합니다. </li></ol></li><li> 조직에서 RNA를 추출하여 cDNA를에 RNA를 변환합니다. 리얼 t하여 cDNA를 IL6의 유전자 발현 분석IME PCR. </li><li> 트리 졸의 제조 프로토콜에 따라 조직에서 RNA를 추출합니다. 조직은 RNA 안정화 버퍼에 저장되어있는 경우. 샘플을 해동하고 버​​퍼를 스핀 다운. 500 ㎕의 트리 졸과 다른 에펜 도르프에 팁으로 조직을 전송하고 RNA 추출을 계속합니다. </li><li> 농도 260/280 및 RNA의 230분의 260의 비율을 측정하는 분광 광도계를 사용한다. 비율이 2.0 이상일 확인합니다. </li><li> 10 ㎕의 최종 부피로 처리 된 DNase를 I. 믹스 1 μg의 RNA와 RNA의 1 ㎕의 10X 반응 완충액 1 ㎕의 RNA 분해 효소가없는 DNase를하고 클레아없는 물에 의한 DNA의 오염을 제거한다. 30 분 동안 37 ° C에서의 마스터 믹스를 부화. 반응을 종료 1 μL DNase의 중지 솔루션을 추가합니다. 10 분 동안 65 ° C의 혼합물을 품어. </li><li> 의 cDNA에 RNA를 전사 역. 20 ㎕의 반응을 사용하여 최대 반응 당 총 RNA의 μg의 1. 전사 (RT) 반응 혼합물 버퍼를 역 5 배 4 μl를 혼합, 1 μL 레브ERSE의 효소가의 DNase I, 4 ㎕를 클레아없는 H 2 O로 처리 한 후 11 μl의 RNA 템플릿은 최종 20 ㎕의 솔루션을 확인합니다. RT에 대한 열 자전거 타는 조건을 프로그래밍합니다. 일반적인 조건은 다음과 같습니다 : 1 단계 : 5 분 25 ° C를; 2 단계 : 30 분 동안 42 ° C; 3 단계 : 5 분 85 ° C; 4 단계 : 4 ° C에서 개최합니다. cDNA를 5 배 희석. 단기 저장을 위해, 4 ° C에서 cDNA를 저장합니다. 장기간 저장을 위해, -20 ° C에서 cDNA를 동결. </li><li> 실시간 PCR하여 cDNA를 IL6의 유전자 발현 분석 및 베타 - 액틴 유전자 발현을 IL6 유전자 발현을 정규화. <ol><li> IL6 및 β - 굴지 검출을위한 마스터 믹스를 확인합니다. 25 ㎕의 반응을 사용하여 각 유전자에 대한 마스터 믹스 12.5 μL SYBR 그린 믹스 10 μM 정방향 프라이머, 0.5 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머 및 6.5 ㎕의 뉴 클레아없는 H 2 O 0.5 μL 포함 </li><li> 5 ㎕를 5 배 희석 cDNA를 a를 배치광 반응을 96- 웰 플레이트의 웰의 바닥에서 t. 피펫은 각 웰에 마스터 믹스 20 μl의 최종 25 ㎕의 PCR 믹스를 확인합니다. 각 샘플에 대한 각 유전자 중으로. 광학 필름 접착제를 사용하여 플레이트를 밀봉. 4 ° C를 사용하여 실시간 PCR의 표준 프로그램에서 3 분 동안 800 XG에 접시를 스핀 다운 : 1 단계 : 50 ° C 2 분; 2 단계 : 10 분 동안 95 ° C; 3 단계 : 15 초 온도 1 분 60 ° C 95 ° C의 40주기. 해리 곡선 추가 단계를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 10. MIA 성인 자손의 행동 이상 (선택 사항) 검사 : <ol><li> 8-12주의 나이에 동작 테스트를 수행합니다. 최소 3 일 시험 전에 케이지 침구를 변경합니다. 적어도 30 분 시험 전에 행동 테스트 룸에 쥐를 적응. </li><li> 프리 펄스 저해 (PPI)의 경우, 하부 압전 센서 플렉시 실린더 내의 마우스 억제. PPI에 마우스를 적응5 분 동안 챔버. 120dB 백색 잡음 (놀라게)의 6 시험에 쥐를 노출. </li><li> 그리고 15dB (15dB 이상 소음의 14 시련 놀라게 14 시험, 프리 펄스 5dB (5dB 배경 잡음보다 높은) + 놀라게 (PPI5)의 14 시련과 프리 펄스의 14 임상 시험의 무작위 혼합물로 쥐를 노출 배경 잡음 + 놀라게 (PPI15)보다. </li><li> 120dB 시험의 첫 번째 (6) 시험에 대한 놀라게 응답의 평균. 다른 각각의 자극에 대한 놀라게 응답의 평균. (- PPI5 또는 PPI15 놀라게) / 놀라게하여 프리 펄스 억제에 값을 은밀한. </li><li> 오픈 필드 테스트의 경우, 열린 광장 무대 (50 × 50 X 50cm 3)의 모서리에 마우스를 놓습니다. 천장에 장착 된 카메라를 통해 10 분 동안 마우스의 궤적을 기록합니다. 중앙 영역 (17 X 17cm 2)로 무대의 중심을 정의합니다. 수동 또는 이미지 기반의 자동 분석 소프트웨어 중심 영역에 소요되는 이동 거리, 중앙 영역 항목 및 시간을 정량화. </리&gt; <li> 대리석 매립 시험의 경우, 10 분 동안 압축 5cm 깊이, 청소, 아스펜 소나무 침구 테스트 케이지에 마우스를 적응. 그 homecage에 마우스를 돌려줍니다. 부드럽게 4 × 5 배열의 방식으로 20 남색 1.5 cm 직경의 유리 구슬을 배치합니다. 10 분 동안 구슬 테스트 케이지에 다시 마우스를 놓습니다. 10 분의 시험 시간에 매장 된 구슬을 계산합니다. </li></ol> (11) MIA 성인 자손의 소뇌 신경 병리학 (선택 사항) 검사 : <ol><li> 마취에 의한 생리 식염수와 MIA 성인 자손을 안락사. 심혈 내지 50㎖의 PBS로 마우스 및이어서 50ml의 4 % 파라 포름 알데히드를 관류. </li><li> 조심스럽게 뇌를 제거하고 4에서 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드의 뇌를 접미사에 기음. PBS로 3 회 뇌를 씻어 사용할 때까지 4 ° C 냉장고에 0.02 % 나트륨 아 지드와 PBS의 뇌를 저장합니다. 주 :라는 접미어 뇌는 0.02 %의 잔디와 PBS에 저장 될 수있다한 달에 최대의 냉장고에 이움 아 지드. </li><li> 제 50 μm의 얇은 조각으로 뇌 sagittally vibratome를 사용하여. 부드러운 브러시 펜을 사용하여 뇌의 부분을 수집합니다. 실온에서 30 분 동안 0.6 %의 과산화수소 수의 섹션을 배양하여 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 종료한다. </li><li> 밤새 실온에서 차단 완충액 (PBS 중 0.1 % 트리톤 X-100, 0.02 % 아 지드 화 나트륨과 10 %의 염소 혈청)에 희석 방지 calbindin 항체의 섹션을 인큐베이션. 실온에서 2 시간 동안 블로킹 완충액에 희석 한 비오틴 이차 항체에 대응하는 섹션을 배양한다. </li><li> 아비딘 DH의 섹션을 인큐베이션 - 비 오티 닐화 퍼 옥시 다제 착체 H 버퍼를 실온에서 1 시간 동안 바이오틴을 검출. 항원을 가시화하는 퍼 옥시 다제 기질을 이용하여 부분을 개발한다. 단계 사이에 PBS로 3 회 섹션을 씻으십시오. 현미경 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 이미지 현미경 섹션. </li></올&gt;

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</ol>

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서로 다른 시간 창에서 MIA 유도는 설치류에서 다른 두뇌 발달 이벤트를 교란, 결과적으로 자손에 다른 행동 이상과 neuropathologies에 연결됩니다. E12.5에 주입 : 여기, 우리는 폴리 (C I)와 마우스에서 MIA를 유도 할 수있는 프로토콜을 설명했다. MIA 유도의이 방법은 행동, 신경 학적, 면역 학적, 그리고 자손 8,10,11,16에서 자폐증과 정신 분열증과 관련된 위장관 이상에 연결됩니다. MIA는 환경 적 위험 인자이기 때문에이 점에 유의하는 것이 중요하고, 자손의 표현형이 신경 발달 장애의 유전 적 모델 쥐에서보다 높은 변동을 가질 것으로 기대된다. 따라서, 정확하고 일관 MIA 통해 자폐증, 정신 분열증과 관련된 표현형을 생성하기 위해, 상기 결과 혼란 추가적인 변수를 최소화하는 것이 특히 중요하다. 프로토콜에 설명 된 타임 라인 가까이 따라야한다LY. 올바른 분사 시간 창 MIA 원하는 단계에서 자손의 두뇌 발달을 교란 있...

산모의 면역 활성화의 개념 (MIA)는 자폐증과 정신 분열증 1 모성 감염의 연관성에 대한 역학 연구에서 유래. 인해 태반 또는 바이러스 감염 모체 2,3- 후 태아 뇌에서 검출 가능한 복제 바이러스 병원체의 부재에, 자손에 감염의 효과가 오히려 병원체 자체보다 모체 면역 시스템의 활성화에 의한 것으로 가정한다 . polycytidylic 산 : MIA와 정신 장애, 화학적으로 합성, 바이러스 성 모방 이중 가닥 RNA의 polyinosinic의 주입 사이의 인과 관계를 규명하기 : 임신 설치류에 (폴리 (I C)) 널리 MIA의 동물 모델로 사용되어왔다 4,5. 폴리는 (I : C) 수신자 같은 수용체 3 (TLR3) 및 폴리의 전신 투여 인식 (난 : C)은 바이러스와 같은 급성 염증 반응 유도한다. 메커니즘 중 하나되는 폴리으로 (I : C) 홍보자손에 oduces 행동 이상과 neuropathologies는 산모 - 태반 - 태아 축 6 프로와 항 염증성 사이토 카인의 불균형을 초래하는 것입니다. 몇몇 그룹은 정신 장애 (7)의 원인을 이해하는 MIA 모델을 채용 한 의한 연구 그룹 중에서 다양한 관심사 면역 활성화의 다양한 시점은 뇌 발달과 행동 7 상이한 섭동을 달성하기 위해 사용되었다. 배아 12.5 일에서 임신 한 쥐에 성공적으로 MIA는 행동, 신경을 유도 할 수 있음을 보여 주었다 (E12.5)을, (C I) 캘리포니아 기술 연구소의 폴 H. 패터슨 연구소는 폴리를 주입하는 전략을 채택 자폐증과 정신 분열증 8-11과 관련된 자손의 면역 학적 변화. 우리의 이전 작품 MIA의 자손이 행동 이상 (예를 들어, 사회 impairmen을 표시 보여t, 통신 결핍, 반복 행동, 불안 같은 행동 및 잠재 억제 적자 8,10,12), 면역 조절 곤란 및 사이토 카인 불균형 8,13,14, 태아의 뇌 유전자 발현 (15)의 변경, 소엽 VII에 조롱박 세포의 손실 소뇌 (11), 해마 9 시냅스 특성의 변화, 유전자 X 환경의 상호 작용 (13), 장 투과성의 변화 및 장내 미생물 조성 16. 또한, 치료 및 예방 전략이 모델 시스템 13,16,17에서 개발된다. E12.5에서 MIA을 유도함으로써, 다른 MIA는 뇌 synaptosomal 분자 (17)의 태아 미세 아교 활성화 및 기저 전뇌 (18)의 콜린성 발달 변경, 변형 특정 상호 작용 (19), 뇌 뇌 synaptosomal 미세 구조의 이상, 뇌 미토콘드리아 호흡 연쇄 항진의 abnormalties, 하향 조절을 생산하는 것으로 나타났습니다 ,우울증 같은 행동,인지와 해마 장기 강화 (LTP)의 손상, 성인 해마 신경 (20)의 적자. (C : I)뿐만 아니라, 자폐증, 정신 분열증의 병인을 연구 모델을 적용하는 방법에 대한 패러다임 여기서는 폴리 의해 E12.5에서 MIA을 유도하는 방법의 상세한 방법을 제공한다. 이 장애는 4 MIA 다양한 위험 인자 인 것이 중요하고, 그 결과 시간 및 유도 방법뿐만 아니라, 임신 댐 축산에 매우 민감하다. 따라서, 실험실간에 사소한 불일치는 종종 낮은 재현성 및 / 또는 자손 다른 표현형을 초래한다. 우리의 방법은 특별히 자폐증, 정신 분열증에 대한 환경 적 위험 인자로 MIA 연구에 관심을 위해 설계되고, 상세한 설명은 연구자들이 데이터의 재현성을 향상시킬 것이다 제공.

<table><tbody><tr><td>폴리이노신&ndash; 폴리시티딜산 칼륨염</td><td>SIGMA</td><td>P9582</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 염화나트륨 INJ.</td><td>USP HOSPIRA</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT 인슐린 시리나주 3/10ml 29 G x 1/2"</td><td>COVIDIEN</td><td>8881600145</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원추형 나사 캡 튜브</td><td>USA SCIENTIFIC</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 분광 광도계</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>선택적 스테레오현미경</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>M5A</td><td>선택적</td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치 Inox 팁 크기 .10 X .06 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td>선택적</td></tr><tr><td>RNAlater RNA 안정화 시약</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>선택적</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026&nbsp;</td><td>선택적</td></tr><tr><td>RQ1 Rnase-free DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td>선택적</td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>선택적</td></tr><tr><td>FastStart 유니버설 SYBR 그린 마스터 믹스 with ROX&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td>선택적</td></tr><tr><td>Real-time PCR</td><td>ABI</td><td>7300</td><td>선택적</td></tr><tr><td>프라이머: Il6 forward</td><td>Life Technologies</td><td>TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC</td><td>선택적</td></tr><tr><td>프라이머: Il6 Reverse</td><td>Life Technologies</td><td>TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC</td><td>선택적</td></tr><tr><td>프라이머: beta-actin forward</td><td>Life Technologies</td><td>AGAGGGAAATCGTGCGTGAC</td><td>옵션</td></tr><tr><td>프라이머: beta-actin Reverse</td><td>Life Technologies</td><td>CAATAGTGATGACCTGGCCGT</td><td>선택적</td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 96-웰 반응판</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4311971</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>EthoVision</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>SR-LAB 장치(PPI)</td><td>San Diego Instruments&nbsp;</td><td>SR-LAB</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>대리석</td><td>PENN-PLAX</td><td>블루 보석 스톤 대리석</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>21600-069</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>마크론</td><td>2621-59</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>시그마</td><td>S2002</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma</td><td>18312</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>토끼 항 칼빈딘 항체</td><td>Abcam</td><td>ab11426</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Biotinlyated 염소 항 토끼 IgGantibody</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC 키트</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>Optionl</td></tr></tbody></table>

(: c i) 바이러스 성 모방 폴리와 중간 임신 단계에서 마우스의 모성 면역 활성화 유도

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

모성 면역 활성화(MIA) 모델은 다양한 정신 질환의 환경적 위험 요인에 대한 설치류 모델로 점점 더 높이 평가되고 있습니다. 수많은 연구에서 MIA 모델이 자폐증 및 정신분열증과 관련된 얼굴, 구성 및 예측 타당성을 보여줄 수 있음을 보여주었습니다. MIA를 모델링하기 위해 연구자들은 종종 바이러스 모방 폴리이노신:폴리시티딜산(poly(I:C))을 사용하여 임신한 설치류의 면역 체계를 활성화합니다. 일반적으로 면역 활성화 댐의 자손은 자폐증 및 정신 분열증과 관련된 행동 이상과 생리적 변화를 보입니다. 그러나 다른 용량과 다른 시점에 폴리(I:C) 주사는 다른 단계에서 뇌 발달을 교란시켜 다른 결과를 초래할 수 있습니다. 여기에서는 임신 중기 배아 12.5일(E12.5)에 20mg/kg 폴리(I:C)를 복강내(i.p.) 주사하여 MIA를 유도하는 자세한 방법을 제공합니다. 이 방법은 산모-태반-태아 축에서 급성 염증 반응을 유발하는 것으로 나타났으며, 이는 궁극적으로 자폐증 및 정신분열증과 관련된 뇌 교란과 행동 표현형을 초래합니다.

<html> / kg 폴리 20 mg을 주입 : E12.5에서 (I C)는 산모 - 태반 - 태아 축에서 급성 염증 반응을 불러 일으킬과 두뇌 발달 및 행동 표현형 12, 13에 만성적 인 영향을 침전 수 있습니다. 전 염증성 사이토 카인의 상승 수준은 인터루킨 (IL) -6, MIA 후 급성 염증 반응의 신뢰할 수있는 지표입니다. 주사 12, 13 : IL6 유전자 태반의 표현과 태아의 뇌에 대한 피크 시간은 3 시간 후 폴리 (C I)에 있습니다. 우리는 그 폴리을 보여 주었다 (난 : C)는 산모의 비장-태반 태아의 뇌에서 높은 IL6 유전자 발현 (그림 5) 유도 (우에서 적응 데이터 등, 2015). 13. 연구자 등 예를 들어 MIA 후 급성 염증 반응, 임산부 다이어트, 유전...

모성 면역 활성화(MIA)는 자폐증과 정신분열증의 환경적 위험 요인에 대한 모델입니다. 이 기사의 목표는 이 모델의 재현성을 향상시키기 위해 임신한 마우스에서 MIA를 유도하는 방법에 대한 단계별 절차를 제공하는 것입니다.

(: C I) 바이러스 성 모방 폴리와 중간 임신 단계에서 마우스의 모성 면역 활성화 유도

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

이 절차의 전반적인 목적은 임신 중기 배아 단계에서 바이러스 모사체인 poly를 복강 내 주사하여 생쥐에게 모체 면역 활성화(maternal immune activation, MIA)를 유도하는 것입니다. 이 방법은 면역 기능 장애가 뇌 발달 및 행동의 교란으로 어떻게 이어질 수 있는지와 같은 신경 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자폐증 및 조현병의 환경적 위험 요인으로서 MIA를 연구하고자 하는 연구자들을 위해 특별히 설계되었다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 MIA 유도 방법의 작은 차이가 자손의 하위 반응을 크게 변화시킬 수 있기 때문입니다. 시기 조절 교배 쌍을 설정하려면, 먼저 다섯 마리의 암컷 마우스를 표준 마우스 케이지에 각각 옆 케이지에 함께 수용하여 발정 주기를 동기화하고, 이어펀치(ear punch)를 사용하여 각 개체를 표시합니다. 암흑 주기가 시작되기 0~2시간 전에 암컷 마우스를 케이지당 두 마리씩 수용하고, 각 마우스의 체중을 측정하여 기록한 후, 두 마리의 암컷이 있는 케이지당 수컷 마우스 한 마리를 추가합니다.명암 주기 중 암기가 종료된 후 0~4시간 사이에 암컷 생쥐의 꼬리 기부를 조심스럽게 들어 올려 동물이 앞발로 케이지 그리프를 잡게 한 다음, 질 입구에 흰색 덩어리가 있는지 확인합니다. 플러그가 보이지 않는 경우, 200 µL 피펫 팁을 질 입구에 조심스럽게 삽입합니다. 응고로 인한 저항이 느껴지면 플러그가 형성된 것으로 확인합니다.질 플러그(vaginal plug)의 존재는 교미가 일어났음을 확인해 줄 뿐이므로, 플러그가 확인된 마우스들을 새로운 케이지에 그룹화합니다. 배아기 10.5일에서 11.5일 사이에, 플러그가 확인된 암컷 마우스 각각을 꼬리 기부로 들어 올려 복부의 팽창 여부를 확인한 후, 마우스의 체중을 측정하여 임신 여부를 검증하고 임신한 동물들을 개별 깨끗한 케이지에 수용합니다. 50 milliliter 원추형 튜브에 poly(I:C) 분말의 무게를 잽니다.배아기 12.5일에, 코니컬 튜브에 들어있는 poly(I:C)의 부피에 맞는 적정량의 0.9% sodium chloride를 첨가하고 캡을 닫습니다. 용액이 투명해질 때까지 식염수 방울이 분말 전체에 닿도록 튜브를 부드럽게 굴려줍니다. 그 다음 튜브를 원심분리하고, poly(I:C) 용액을 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.분광광도계를 사용하여 poly(I:C) 용액의 260/280 비율을 측정합니다. 제조사에서 명시한 바와 같이, 이 비율은 1.54에서 1.82 사이여야 합니다. 다음으로, 첫 번째 마우스의 체중을 측정하고 계산된 부피에 해당하는 poly(I:C) 용액을 0.3 mL 인슐린 주사기에 충전합니다.그런 다음, 꼬리를 잡아 마우스를 들어 올려 케이지 상단에 놓고, 목덜미를 잡아 고정합니다. 이제 바늘의 사면이 위를 향하도록 하여, 마우스와 약 20도 각도를 유지하며 두 개의 상부 젖꼭지 중앙에 삽입하고 poly(I:C) 용액을 투여합니다. 이후 마우스를 다시 케이지 안에 넣습니다.모든 마우스에 주입을 마친 후, 다른 혼란 변수를 방지하기 위해 통행량이 적고 조용한 방에 케이지를 보관하고 다음 날 아침에 마우스의 체중을 측정합니다. 행동 테스트 최소 3일 전에 8~12주령의 성체 모체 면역 활성화(MIA) 후손의 케이지 베딩을 교체합니다. 테스트 30분 전에 마우스를 테스트실에 적응시킵니다.전펄스 억제 검사를 위해, 마우스를 압전 센서 위의 플렉시글라스 실린더 내에 고정합니다. 120 dB의 화이트 노이즈를 6회 시행하여 마우스가 전펄스 억제 챔버에 5분 동안 적응하도록 합니다. 그 다음, 표에 설명된 대로 무작위로 혼합된 소리에 마우스를 노출시키고, 그 결과를 기저 놀람 반응과 비교하여 MIA 동물의 전펄스 억제 정도를 결정합니다.오픈 필드 테스트를 위해, 17 by 17 centimeter 크기의 중심 구역이 정의된 개방형 정사각형 아레나의 모서리에 마우스를 두고, 천장 장착 카메라를 통해 10분 동안 마우스의 이동 경로를 기록합니다. 그런 다음 중심 구역 진입 횟수와 중심 구역에서 보낸 시간을 정량화합니다. 마블 매립 테스트의 경우, 5 centimeter 깊이로 압착된 깨끗한 아스펜 소나무 베딩이 깔린 테스트 케이지에 마우스를 10분 동안 적응시킨 후, 마우스를 다시 홈 케이지로 옮기고 테스트 케이지 내에 직경 1.5 centimeter의 남색 유리 구슬 20개를 4 by 5 그리드 형태로 조심스럽게 배치합니다.이제 마우스를 테스트 케이지로 10분 동안 돌려보낸 후, 동물을 다시 홈 케이지에 넣고 테스트 기간 동안 묻힌 구슬의 수를 측정합니다. 배아 12.5일에 Poly(I:C)를 주입하면 모체-태반-태아 축에서 급성 염증 반응을 유발할 수 있으며, 뇌 발달 및 행동 표현형에 만성적인 영향을 미칠 수 있습니다. 실제로 Poly(I:C)는 주입 3시간 후 모체의 비장, 태반 및 태아의 뇌에서 Il6 유전자의 발현을 증가시킵니다.일반적으로, 식염수로 처리한 성체 자손과 비교했을 때, MIA 성체 자손은 오픈 필드 테스트(open field test)에서 중심 구역 진입 횟수가 더 적고 중심 구역 체류 시간이 더 짧은 양상을 보입니다. poly(I:C)를 주입한 동물들은 구슬 매립 테스트(marble burying test)에서 더 빈번한 매립 행동을 보이며, 더 낮은 전펄스 억제(pre-pulse inhibition)를 나타냅니다. 소뇌 소엽 7(cerebellum lobule seven)의 푸르키니에 세포(Purkinje cells) 소실은 MIA 자손의 또 다른 특징이며, 식염수를 주입한 대조군과 비교하여 이들 동물의 소뇌 소엽 7에서 calbindin 양성 푸르키니에 세포가 더 적게 관찰됩니다.이 절차를 수행할 때, MIA 유도 후 임신한 마우스에게 자극을 주지 않는 것이 중요합니다. 이후, 추가적인 환경 상호작용을 연구하기 위해 출생 후 스트레스나 감염과 같은 추가 요인을 유도할 수 있습니다.

induction-maternal-immune-activation-mice-at-mid-gestation-stage-with

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Lutz, D., et al. 발달 중인 마우스 뇌 및 척수의 자궁 내 형질도입 후 초미세구조 신경가소성 매개변수의 평가. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 마우스 배아에서 자궁 내 주사를 통한 바이러스 형질도입을 보여줍니다. 임신한 쥐를 수술을 위해 준비하고 정중선 절개를 하여 자궁 뿔을 노출시킵니다. 원하는 유전자를 포함하는 바이러스와 추적 염료의 혼합물을 표적 위치의 자궁 주머니 내의 배아에 주입합니다. 그런 다음 봉합하기 전에 자궁 뿔을 다시 배치합니다.

마우스의 자궁 내 바이러스 형질도입

신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의...

사용<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

우리는 살아있는 유기체의 합병증 없이 모계 염증에 태아 노출을 시뮬레이션하기 위하여 chorioamnionitis의 모형을 개발했습니다 자손의 창자 발달에 FEMI의 효력을 검토합니다. 이것은 chorioamnionitis 다음 장 상해의 발달을 위한 기계론적인 원인의 연구를 허용합니다.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

산모 감염은 신경 발달 장애의 위험 요소입니다. 모체 면역 활성화(MIA)의 마우스 모델은 감염이 뇌 발달 및 기능에 미치는 영향을 설명할 수 있습니다. 여기에서는 MIA에 노출된 안정적으로 회복력 있고 감수성이 있는 자손을 생산하기 위한 일반적인 지침과 절차가 제공됩니다.

자손의 감수성과 회복력을 연구하기 위해 Poly(I:C)를 사용하여 임신 중기 모체 면역 활성화의 재현 가능한 모델 생성

조산(37주 분만)은 최적이 아닌 예방 및 치료 옵션이 있는 긴급한 글로벌 건강 문제&lt; 있습니다. 우리는 상행 질 세균 감염으로 인한 조산의 마우스 모델을 제시하고 그 결과 신생아 이환율과 사망률을 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

마우스의 상승하는 질 감염, 조산 및 신생아 이환율 모델링

이 논문은 초기 임신 염증이 신경발달에 미치는 영향을 연구하기 위한 모체 면역 활성화(MIA) 마우스 모델을 생성하는 포괄적인 프로토콜을 제공하며, 신뢰성과 재현성을 보장하는 주요 지표를 포함합니다.

초기 임신 모체 면역 활성화 마우스 모델 생성을 통해 태아 염증이 신경발달에 미치는 영향을 평가한다

이 동영상은 어떻게 조직 병리학하여 심각도를 평가하기 위해 SJL 마우스 및 면역 hypophysitis를 유도하는 방법을 보여줍니다.

SJL 마우스의 실험적 면역 Hypophysitis의 유도

여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 격리를 위해 방법을 설명합니다. 별 모양의 세포 정화 들어, 마우스 간은이...

셀을 별 모양으로 일곱 단계

리스테리아 monocytogenes는 생쥐에서 세균을 세포에 면역 반응과 유전 자화율을 연구를위한 모델 생물이다. 이 방법은 박테리아 부하를 측정하고 리스테리아 감염으로 인한 면역 세포의 변화를 결정하는 외과 분석을위한 생쥐의 간 및 비장의 단일 셀 suspensions를 생성하는 하나 있습니다.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

동시에 오른쪽 심장 기능, 폐 염증 및 면역 반응을 조사하기 위해 구체적이고 빠른 프로토콜은 학습 도구로 설명되어 있습니다. 비디오 및 그림은 큰 규모의 연구에 작은에 사용할 수에 적용 할 수 있습니다 조직 팀 접근 방식에서 생리학 및 microdissection 기술을 설명합니다.

폐 마우스의 면역 조직 샘플의 수확과 함께 오른쪽 심실 수축기 압력 측정

배우세요 중간 임신기 마우스에 바이러스 성 모방 폴리를 복강 내 주사하여 모성 면역 활성화를 유도하는 방법을. 이 기법은 자폐증 및 조현병 연구에서 면역 기능 장애가 뇌 발달에 미치는 영향을 재현 가능하게 연구하는 데 활용됩니다.

(: C I) 바이러스 성 모방 폴리와 중간 임신 단계에서 마우스의 모성 면역 활성화 유도

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