Name: 유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 배우세요 유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 살아있는 세포에서 담즙 산성 수송과 역학을 실시간으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 대사 연구와 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 ERC 시작 보조금(ERC-2011-StG 280255 및 ERC-2013-StG 337479)과 네덜란드 보건 연구 개발 기구(Vidi 91713319)의 지원을 받았습니다.

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저자는 공개할 것이 없습니다.

여기서 우리는 살아있는 세포에서 담즙산 수송 시공간 역학을 모니터링 할 수있는 새로운 유전자 부호화 담즙산 센서의 사용을 위해 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 바이오 센서함으로써 FRET 기반 담즙산 센서 (BAS)을 형성 FXR-LBD 융합되어 하늘색 및 황 형광 단백질로 구성되어있다. 세포 배양 및 FACS 또는 (공 초점) 현미경 기본적인 경험을 가지고 할 때 담즙 산성 센서는 사용이 비교적 간단하고 편리합니다. 그러나 일부 측면은 몇 가지 문제가 촬영이 필요할 수 있습니다. 담즙산 수송 체와 조합 담즙산 센서를 이용하면, 숯 여과 혈청 배지에서 배양 된 세포에 권장된다. 목탄은 추가 혈청에서 흡착 담즙산 농도를 감소시킨다. 이 둔감 센서의 가장 흔한 원인이기 때문에 특히 NTCP 수입 등의 존재하에,이 배양 동안 센서의 포화를 방지하는 것이 중요실험 중. 따라서, 다른 센서는 더 큰 동적 범위 (8)을 생성, 담즙산의 감도를 변경 돌연변이를 포함 (...

포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 광범위하게 높은 공간적 해상도를 1로 살아있는 세포에서 세포 기능의 더 나은 이해를 얻기 위해 사용된다. FRET에서, 여기에서, 도너 형광 에너지 수용체 형광 단에 전송된다. FRET 효율은 도너와 억 셉터 형광체와 그 방향들 사이의 거리에 따라 크게 좌우되며, 따라서 두 형광체에 영향을 구조적 변화에 민감한 판독이다. 이 현상은 작은 분자 이미징 FRET 기반 바이오 센서를 생성하기 위해 이용된다. 증가 / 도너 형광 대 2 수용체의 발광 강도의 비율이 감소함에 따라 자신의 농도 변화를 모니터 할 수있다. 예를 들어, FRET 기반 칼슘 바이오 센서는 세포 3 생활에 유리 칼슘 농도를 빠르고 안정적으로 검출 할 수 있습니다. FRET 기반 바이오 센서의 다른 장점은 하나의 살아있는 세포에서 촬상되어, t상속인 이외의 침입은, 자신의 능력이 서로 다른 종류의 세포 및 세포 구획 4를 대상으로한다. 세포 내 담즙산 역학의 여러 측면은 여전히​​ 저조한 이​​해된다. 예를 들어, 거의 공액 및 비공 액 담즙산 수송 하부 규제기구에 대해 공지되어있다. 기술이 존재하는 트랜스 포트 주로 기반 루시페라아제 리포터, 방사성 표지 된 담즙산 또는 형광 담즙산 유사체의 사용을 모니터링한다. 후자는 아마도 자신의 특성에 영향을 미치는 담즙산의 수정을 필요로한다. 루시 페라 기반 기자는 가난한 시간 해상도를 가지고있다. 또한,이 기술은 시료의 손실이 발생할 및 단일 세포 이미징을위한 적용되지 않습니다. 따라서,이 비율 적 검출 5, 6의 장점을 포함하고, 특히 이후 FRET 바이오 센서를 이용하여 전송 활동의 실시간 단일 세포 이미징을 허용 방법을 사용하는 것이 유익 할 것이다. 반면 CF의 변형P / YFP 형태는 가장 자주 FRET 쌍, 적색 편이 담즙산 센서 (7)을 포함한 새로운 센서와 FRET 도구 상자의 확장을 주도 자기 협회 유발 돌연변이를 들고 mOrange 및 mCherry를 사용하여 새로운 전략을 사용했다. 우리는 이전에 farnesoid X 수용체 (FXR) 리간드 결합 도메인과 융합 기증자 형광 (하늘색)와 수용체의 형광 (황수정)로 구성된 유전자 인코딩 FRET 담즙산 센서 (BAS)을 생성 (FXR-LBD) 및 펩티드 LXXLL 모티브 (8)를 포함. 담즙산 의존적으로 FXR-LBD이 펩티드 어소. FXR 활성화되면, 황수정과 하늘색 사이의 거리가 구조적 변화로 인해 변경됩니다. 포유 동물 세포주에서, 황 / 세룰 리안 비율 명확히 검출 가능한 증가 FXR 활성화 결과, 정제 된 센서는 반대 방향으로 작동하고 FXR 활성화시 FRET 비율 감소에 이르게한다. 이 센서 (CytoBAS)세포질 담즙산 역학의 모니터링을 할 수 있습니다. 세포 내 표적 모티프의 카복실 말단을 첨가하여, BAS 구조체는 다른 세포 구획에서 담즙산 농도의 측정을 허용하는, 핵 (NucleoBAS) 및 퍼 옥시 솜 (PeroxiBAS)을 타겟으로 할 수있다. 퍼 옥시 솜 타겟팅 모티브의 추가가 담즙산에의 대응 성을 손상하지 않지만, 세포 투과성 FXR - 리간드는이 퍼 옥시 솜 (8) 내부 PeroxiBAS의 변화를 FRET 유도하지 않았다. 이 차이의 특성을 알 수있는 바와 같이, 프로토콜은 다음과 CytoBAS NucleoBAS에 집중된다. 이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서의 사용은 최근 간 담즙산 수송 + / 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드 (NTCP) 나 유기 용질 수송 알파 / 베타 (OSTαβ)를 8 함유 세포에서 증명되었다. NTCP는 주 간 담즙산 수입하고 OSTαβ는 기저 장 담즙입니다전기 담즙산 농도 구배 (9), (10)에 따라 수입과 수출 모두 작동 할 수 있습니다 산 수송. 최근의 데이터는 NTCP 및 / 또는 OSTαβ 의한 담즙산 수송시 리간드 FXR-LBD 상호 작용의 결과로서 FRET 비율 견고하고 빠른 응답이 관찰 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 여기, 우리는 이러한 공 초점 현미경 분석 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)와 같은 FRET을 측정하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 설명하는 중요한 단계를 강조, 잠재적 인 문제를 해결하고 다른 방법에 대해 설명합니다. 이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서를 이용하여, FXR-LBD와 담즙산 상호 작용은 정량 및 살아있는 세포에 직접 모니터링하고 실시간으로 담즙산 수송 및 역학을 가시화 신속하고 간단한 방법을 제공 할 수있다. CytoBAS NucleoBAS를 인코딩 및 포유류 발현 플라스미드는 시판되고있다. 따라서,이 바이오 센서는, 상기에 기여담즙산 수송 또는 FXR을 활성화하고 담즙산 생물학 및 시그널링에 대한 깊은 통찰력을 제공하는 화합물의 이해.

<table><tbody><tr><td>사이토바스&nbsp;</td><td>애드진</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagles media (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>L-글루타민 없는 고혈당</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (pen/strep)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (10x)</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25 세포 배양 플라스크</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td><td>라미닌 코팅</td></tr><tr><td>T-175 세포 배양 플라스크</td><td>VWR international</td><td>392-0238</td><td>라미닌 코팅</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>VWR international</td><td>734-0229</td><td>폴리-L-라이신 및 라미닌 코팅</td></tr><tr><td>10cm 접시</td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>라미닌 코팅</td></tr><tr><td>디에틸아미노에틸 (DEAE) - 덱스트란</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (geneticin) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>클로닝 실린더 (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Leibovitz 배양 배지</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>페놀 레드</td></tr><tr><td>폴리스티렌 원형 바닥 튜브 (5 ml) Facs 튜브</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>캡 없음, 비멸균</td></tr><tr><td>Falcon 2,063 튜브(5ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>스냅 캡, 멸균</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 8웰 커버글라스</td><td>Thermo scientific</td><td>155409</td><td>멸균</td></tr><tr><td>숯 여과 FBS</td><td>Life technologies</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>시그마-알드리치</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>시그마-알드리치</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>기타 화학물질</td><td>시그마-알드리치</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 인코딩 fret 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Resonance Energy Transfer(FRET)는 단일 세포에서 단백질 접힘, 상호 작용 및 국소화를 모니터링하기 위한 강력한 도구가 되었습니다. FRET의 원리에 의존하는 바이오센서는 높은 시간 및 공간 해상도로 살아있는 세포에서 세포 내 신호 전달 이벤트를 실시간으로 시각화할 수 있게 했습니다. 여기에서는 파르네소이드 X 수용체 리간드 결합 도메인(FXR-LBD)에 융합된 두 개의 형광단으로 구성된 유전적으로 암호화된 담즙산 센서(BAS)의 적용을 설명하며, 이를 통해 많은 수의 담즙산 종 및 기타(합성) FXR 리간드에 의해 활성화될 수 있는 담즙산 센서를 형성합니다. 이 센서는 핵(NucleoBAS) 및 사이토졸(CytoBAS)을 포함한 다양한 세포 구획을 대상으로 하여 국소적으로 담즙산 농도를 측정할 수 있습니다. 이를 통해 세포 담즙산 유입, 유출 및 내인성 담즙산의 세포 내 분포를 형광 태그 또는 방사성 핵으로 표지할 필요 없이 빠르고 간단하게 정량화할 수 있습니다. 또한 BAS FRET 센서는 FXR 리간드 결합을 모니터링하는 데 유용할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 이 FRET 바이오센서가 스펙트럼적으로 구별되는 다른 형광단의 이미징과 결합될 수 있음을 보여줍니다. 이를 통해 세포 내 담즙산 역학 및 i) 관심 단백질의 국소화 및/또는 풍부도, ii) 단일 세포의 세포 내 신호 전달을 결합할 수 있습니다.

제시된 FRET-BAS 센서는 두 형광 황수정과 하늘색)과 LXXLL 모티브에 부착 FXR (LBD-FXR)의 도메인을 결합 리간드를 기반으로합니다. 이 센서는 높은 공간 및 시간 해상도 (도 1)와 살아있는 세포에서 담즙산 수송으로 조사 할 수있다. 하늘색 및 황에서 돌연변이는 분자 복합체 (도 1 B)의 형성을 촉진하기 위해 적용 하였다. 담즙산과 다른 FXR FXR 리간드에 결합함으로써, 형태 변화에 의해 황 및 하늘색 사이의 거리를 변경. 포유 동물 세포를 살아있는, 이는 증가 된 FRET 효율성 (황 증가, 감소 하늘색) (도 1 C, D (1))을 초래한다. ...

유전적으로 암호화된 BAS FRET 센서를 사용하여 살아있는 세포의 담즙산 역학을 연구하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 담즙산 센서는 다양한 세포 유형에서 담즙산 수송 및 FXR 활성화를 연구(조절)하는 고유한 도구를 나타냅니다.

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

이 절차의 전반적인 목표는 유전적으로 인코딩된 FRET 담즙산 센서를 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도로 담즙산 수송 및 역학을 쉽게 시각화하는 것입니다. 이 센서는 담즙 및 역학과 포도당, 지질 및 에너지 대사의 관계와 같은 주요 대사 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이제 담즙산을 표지할 필요 없이 살아있는 단일 세포로 담즙산 수송을 직접 모니터링할 수 있다는 것입니다.이 방법은 세포 및 담즙산 수송 및 역학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 효과 또는 활성화 및 단일 살아있는 세포를 visuialize하거나 단백질 국소화 및 담즙산 수송의 이미징을 결합하는 데 사용할 수 있습니다. 유전적으로 암호화된 담즙산 센서(이하 센서)는 공여체 세룰리안 형광단(donor cerulean fluorophore)과 외양자 시트린 형광단(excepter citrine fluorophore)으로 구성됩니다.두 개의 형광단은 FXR 핵 담즙산 수용체의 리간드 결합 도메인에 의해 연결되어 있으며, FXR 보조 인자인 펩타이드에 융합되어 있습니다. 두 개의 형광단에서 두 개의 엔지니어링된 아미노산 변화는 세룰리안과 황수정 사이의 분자 간 상호 작용을 촉진합니다. 센서를 운반하는 두 가지 다른 구조가 사용됩니다.한 구조에서, 센서는 c-말단 핵 국소화 신호를 포함하며, 따라서 핵에 축적됩니다. 다른 구성물에서, 센서는 어떠한 표적 염기서열도 결여되어 있으며, 따라서 세포질에 국한되어 있다. 다음 비디오 프로토콜은 살아있는 세포에서 센서를 이미지화하는 방법에 중점을 둡니다.텍스트 프로토콜은 센서를 발현하는 셀을 엔지니어링하는 방법과 사실에 의해 추가로 분석하는 방법을 다룹니다. 세포 이미징을 준비하기 위해 센서를 원하는 밀도로 발현하는 세포를 완전한 배양 배지의 멸균된 8웰 커버 슬립 바닥 챔버 슬라이드에 플레이트화합니다. 세포가 60 t0 70% 포화도로 성장하면 실험을 진행합니다.챔버 슬라이드에 부착된 세포를 200마이크로리터의 1x PBS 또는 Leibovitz L-15 배양 배지로 한 번 세척합니다. 그런 다음 용액을 흡인하고 CO2 제어가 필요하지 않도록 300마이크로리터의 Leibovitz L-15 배양 배지로 교체합니다. Leibovitz L-15 대신 Phenol Red가 포함된 DMEM을 사용하는 경우 센서가 PH에 민감하기 때문에 데이터 수집 중에 PH를 추적하도록 계획하십시오. 다음으로, GW4064 및 TCDCA를 포함한 3x - 5x 농축액에서 실험에 사용할 화합물의 희석액을 준비합니다.이미징 중에 50 - 100 마이크로리터의 분취액을 추가할 준비를 하여 용액이 슬라이드 챔버에서 빠르게 혼합되도록 합니다. 이제 컨포칼 현미경의 이미징 소프트웨어를 시작하고 레이저를 켭니다. 현미경에는 63x 오일 대물렌즈, 섭씨 37도의 배양 챔버 및 보라색 405 나노미터 레이저가 장착되어 있어야 합니다.다음으로 현미경의 설정을 조정합니다. 획득 모드를 XYT로 설정하여 단일 초점면의 타임 랩스 이미징을 수행합니다. 이미지 획득 속도를 20초 간격으로 설정하여 휴식 중에 화합물을 추가할 수 있습니다.또한 임무 감지를 위한 스펙트럼 범위를 설정해야 합니다. transillumination을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 소프트웨어 컨트롤에서 관심 영역을 정의하는 원을 그립니다.형광 강도가 비슷하고 정상적인 크기 및 모양을 가진 셀을 선택합니다. 세포의 둘레에 가깝게 그리지 마십시오. 그런 다음 측정을 시작하십시오.그들의 가치를 기록하고 짙은 청록색과 황수정 형광이 안정화 될 때까지 계속 측정하십시오. 일단 개화 안정성이 달성되면, 측정하는 동안 선택된 시점에 50-100 마이크로리터의 담즙산 또는 기타 화합물을 첨가합니다. 피펫팅할 때 챔버의 가장자리를 피하고 액체를 천천히 첨가하십시오.이 단계를 올바르게 실행하는 것은 실험에 매우 중요합니다. 다시 말하지만, 진행하기 전에 개화를 안정시킵니다. 5-10 마이크로 몰의 농도를 위해 100 마이크로 리터의 GW4064를 조심스럽게 첨가하여 실험을 마칩니다.형광이 다시 안정될 때까지 계속 녹음합니다. 그런 다음 실험을 저장하고 데이터를 avi 파일로 내보냅니다. plugins, stacks, stack interleaver를 선택하여 이미지 J에 저장된 avi 파일을 엽니다.그런 다음 편집, 선택 및 관리자에 추가를 클릭하여 RLI 관리자 창을 엽니다. 그런 다음 옵션을 토글하고 모두 표시합니다. 타원형 선택 도구를 사용하여 특정 셀을 포함하는 몇 가지 ROI를 그립니다.세포 둘레에 가까이 다가가지 마십시오. 세포는 초점 이동이나 이동을 겪을 가능성이 높기 때문입니다. 또한 셀 바깥쪽 영역에 원 하나를 그려 배경 신호를 확인합니다. 센서를 표현하지 않는 셀 내부의 영역도 사용할 수 있습니다.이제 하나의 ROI를 선택하고 플러그인을 클릭한 다음 비율 프로파일러를 클릭합니다. 세 개의 화면이 나타납니다. RAW, 비율 및 비율 프로필.RAW 창은 황수정의 농도 증가를 파란색 선으로 표시하고 세룰리안의 감소를 FRET가 있는 경우 빨간색 선으로 표시합니다. 비율 창에는 시트린과 세룰리안 비율에 대한 정보가 표시되며, 이는 FRET가 증가함에 따라 증가합니다. ratio profile 창에는 두 채널의 형광 강도 측정 값이 표시됩니다.현미경 특정 설정 파일을 사용하는 경우 채널 순서가 반대로 나타날 수 있습니다. 이제 통계 분석을 위해 비율 프로필 창의 데이터를 스프레드시트로 복사합니다. 그런 다음 선택한 다른 모든 ROI와 백그라운드 ROI에 대해 동일한 작업을 진행합니다.센서를 발현하고 내인성 담즙산 수송체가 없는 U2OS 세포에 대해 살아있는 세포 정량적 강도 기반 FRET 실험을 수행했습니다. 세포는 TCDCA로 처리되었습니다. 이로 인해 FRET에는 어떠한 변화도 발생하지 않았습니다.세포를 GW4064로 처리했을 때 평균 황수정 대 세룰리안 비율이 현저하게 증가했습니다. 센서가 다른 단백질과 결합될 수 있음을 입증하기 위해 NTCP 및 OST 알파-베타와 센서를 함께 발현하는 U2OS 세포가 엔지니어링되었습니다. 그들은 TCDCA 및 GW4064에 추가했을 때 시트린/세룰리안 비율의 명확한 증가를 보여주었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 담즙산 센서를 사용하여 담즙산 역학을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 관심 단백질의 세포 내 국소화와 같은 더 많은 이미징 정보를 포함하도록 쉽게 확장할 수 있습니다.이 단백질의 파장이 센서와 다른 한. 광표백을 방지하려면 세포를 발현하는 센서를 가능한 한 어두운 곳에 두는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 형광 이미징에 의해 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 이 메서드는 선택 mitochondria로 표현 circularly permutated YFP 기반 듀얼 여기 ratiometric 칼슘 센서 (ratiometric pericam - MT)을 활용합니다.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

이 문서에서는 FRET을 이용하여 살아있는 세포에서 글루타민의 역학을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석을위한 고려 사항은 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서에 대해 설명한다.

유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

공구 한정 담즙산 흡수 장애를 진단 및 생체 내 담즙산 수송을 측정한다. 살아있는 동물에서 혁신적인 접근 결합 양성자 (1H) - 플러스 불소 (F 19), 자기 공명 영상을 이용하는 것이 기재되어있다; 이 새로운 방법은 임상에서 담즙산 흡수 불량을 선별하는 병진 가능성이있다.

멀티 플루오르 담즙 산 및 사용<em&gt; 생체</em&gt; 자기 공명 영상은 측정하는 담즙 산 전송

이 프로토콜 aphids와 같은 hemipteran 곤충을 먹이로 생성 하는 식물에 칼슘 신호 분석을 위한 간단한 방법을 설명 합니다. 애기 thaliana GFP 칼슘 바이오 센서 GCaMP3으로 변형 시간적, 공간적 해상도 높은 칼슘 역학의 실시간 vivo에서 영상에 대 한 수 있습니다.

실시간 Vivo에서 녹음 애기 칼슘 신호의 곤충 먹이 형광 바이오 센서를 사용 하 여 중

다기능 Ser/Th 키나아제 AURKA의 활성화는 Thr288에 대한 자가포스포틸화로 특징지입니다. 여기에서는 프로브 엔지니어링을 위한 몇 가지 전략과 미토시스 전반에 걸쳐 키나아제 활성화를 따르는 빠른 FRET 프로토콜을 설명합니다.

라이브 셀의 형성 FRET 바이오 센서를 사용하여 오로라 키나아제 활성화의 실시간 모니터링

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

이 비디오 프로토콜에서는 변형된 이광자 현미경에서 궤도 추적 방법을 사용하여 살아있는 세포 내에서 형광 표지된 리소좀을 고속으로 3차원으로 추적합니다.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

이 기사에서는 발산 및 평면파 이미징을 사용하여 높은 프레임 속도의 초음파 이미징으로 개 간에서 HIFU 절제의 실시간 모니터링에 대해 설명합니다. 집속 초음파를 위한 조화로운 모션 이미징은 절제 영역에서 음향 방사선 힘에 의한 변위의 감소를 이미지화하는 데 사용됩니다.

높은 강도의 실시간 모니터링의 초음파 (HIFU) 절제를 집중<em&gt; 체외</em&gt; 집중 초음파에 대한 조화 운동 이미징을 사용하여 개 간을 (HMIFU)

배우세요 유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 살아있는 세포에서 담즙 산성 수송과 역학을 실시간으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 대사 연구와 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

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