Name: 기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 배우세요 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다능성 및 신경 줄기 세포를 배양하는 방법을. 이 기술은 cGMP 및 cGLP 기준을 준수하며 최대 무균성과 재현성을 보장하여 줄기세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 Xvivo 동봉 된 세포 배양 시스템, 특히 매트 프리먼를 사용하는 학습에서의 도움을 Biospherix에서 직원을 인정하고 싶습니다; 마일즈 &amp; 켈리 건설 회사, 실험실 인프라, 특히 러스 휴즈를 설정에서 자신의 작품에 대한 Inc.의 직원; 실험실 리모델링, 특히 아담 Lukhard와 데빈 Hugie 조정에 업무 시설 및 지원 서비스의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 데이터 관리 인프라 및 원격 액세스, 특히 베트남 트란을 설정하는 그들의 도움에 대한 정보 시스템의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 프로젝트, 특히 박사 마리아 Minon와 브렌트 Dethlefs 자신의 오랜 지원을위한 오렌지 카운티 경영진 팀의 아동 병원. 이 작품은 어린이 오렌지 카운티의 병원 회생 Medicin에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 투자되었다PHS에 부여 TR3-05476을 통해 전자. 모든 저자는이 작품에 동일하게 기여했다.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

그들이 다시 챔버를 현미경하고 챔버를 처리하는 인큐베이터에서 이동할 때 CPF에서 성장 세포는 산소 또는 이산화탄소 농도의 변경을 볼 수 없습니다. 각 실의 조건이 세포 배양기에서 제거되기 전에 세포가 유지되는 특정 인큐베이터에 일치하는 것이 중요합니다. 장치 내의 분위기가 연속적 HEPA 여과하고 산소와 이산화탄소의 농도와 관련하여 정의 할 수 있습니다. 세포 또는 PSC를 NSCs의 5 %는 각각 9 %, 표준 농도에서 성장 될 수있다; 또는 대안 농도는 다른 세포 유형 또는 특정 실험을 위해 선택 될 수있다. 따라서, 상기 장치는 의료용 산소, 이산화탄소 및 질소 (도 4)의 일정한 소스로 공급된다. 이 가스의 세 가지 상수 공급을 위해 가스 관련 매니 폴드 시스템에 의해 제공됩니다. 상기 장치는 또한 교정 가스 혼합물로 이루어진 공급되고산소 10 % (± 0.01 %), 이산화탄소. 상기 매니 폴드 시스템은 셀 생산 설비 밖에 수용하고 가스가 천정 설비에 배관되어있다. 교정 가스 설비 내에 수납된다. 장치는 또한 또한 천장을 통해, 집 진공와 함께 제공됩니다. 송신 장치를 전자 제어 시스템을 사용하여 무선 모든 매니 폴드의 출력 압력을 지속적으로 모니터링한다. 모든 압력 범위를 벗어날 경우, 상기 셀 생산 설비 오퍼레이터는 자동적으로 전화를하고 적절한 조치를 취할 수 있도록 통지한다. 장치의 전력 요건은 천장 내림차순 여섯 120 V 전용 회로에 의해 충족 일정한 공급을 보장하기 위해 병원의 백업 발전기에 접속된다. 장치의 작동은 무정전 전원 공급 장치를 통해 구동되는 PC 기반 컴퓨터 소프트웨어를 통해 제어된다. 이러한 전원과 컴퓨터 준비확인이 계속에도 공용 전력 시스템 장애 발생 시스템 기능. 상기 장치를 제어하는 소프트웨어는 산소 및 이산화탄소 농도의 제어뿐만 아니라, 온도, 습도, 및 챔버 압력을 허용하는 사용자에게 친숙한 그래픽 인터페이스 (도 1)을 갖는다. 모든 이들 파라미터의 값은 연속적으로 모든 장치 파라미터의 주행 기록을 제공하기 위해 기록된다. 이 데이터 무결성을 보호하기 위해 매일 밤마다 원격 서버에 백업됩니다. 컴퓨터 및 소프트웨어 평가 및 / 또는 매개 변수를 변경하려면 관리자 사용자가 원격으로 액세스 할 수 있습니다. 또한, 컴퓨터 소프트웨어는 장치 파라미터 대화식 평가를 허용하고 로컬 사용자와 해결 원격으로 액세스 될 수있다. 부가 경보 전송 장치는 상기 장치에 접속되어 전지의 생산 시설 운영자가 장치의 모든 범위를 벗어난 상태를 통지되도록. 원격 액세스 Capabilities은 로그인하고 범위를 벗어난 조건의 세부 평가 할 수 있습니다. 장치는 모듈 형 시스템으로 모두 매크로와 마이크로 의미로 설계되어 있습니다. 이러한 인큐베이터 및 처리 챔버 등의 개별 세포 배양 모듈은, 서로에 대하여 그들의 크기 및 요구 사항에 관해서뿐만 아니라 레이아웃에 정의 될 수있다. 또한, 각 모듈의 제어 기능의 대부분은 자체 모듈 같은 개별 분위기 가스 컨트롤러, 예를 들어, 용이하게 시스템의 상당한 중단없이 교체 될 수있다. 이러한 미세 시각화 및 세포 배양의 조작 하나로 특수 처리 챔버가 쉽게 시스템에 적합하다. 두 위상차 형광 현미경은 살아있는 세포 염색 할 수 있도록, 시스템 (도 6) 내부에서, 그리고 콜로니 t 내부와 같은 대기 조건에 절개 될 수있다그는 인큐베이터. 처리 챔버의 측벽에 밀봉 고리를 통해 케이블 라우팅 전원 공급 장치 및 시스템은 일반적으로 카트 (도 6)에서, 상기 장치의 외부에 유지되어야하는 등의 장치를 허용한다. 셀 생산 설비의 공정 챔버는 종래의 BSC는 상이한 기류 패턴을 갖는다. 기존의 BSC들에서, 공기 흐름은 중앙 배기구에서 아래로 흐르는 다음 캐비닛의 바닥의 전방 및 후방 부분에 두 개의 서로 다른 흡기구에 의해 흡수되는 두 개의 스트림으로 분할합니다. 대조적으로, CPF 천장의 전방 부에서 단일 배출구를 갖는다. 공기는 하향으로 그리고 그 후 흡기 벤트에 상향 인출되는 챔버의 후방을 향해 유동한다. CPF는 본래 매우 청결하지만,이 독특한 기류 패턴 기술자 약간 오염의 위험을 줄이기 위해 자신의 기술을 조정해야한다는 것을 의미한다. 기존의 BSC, 실험실 작업자들과 마찬가지로오픈 세포 배양 접시와 미디어 병의 상류에 손을 배치 hould 마십시오. 그러나, 상류 측 방향은 CPF에 변경되었는지 셀 생산 설비 실험실 자체가 상당히 표준이며, -20 ° C의 냉동고가 장착되어, -80 ° C의 냉동고, 4 ° C 냉장고, 원심 분리기, 수욕. 실험실은 편리한 핸즈프리 작동을위한 발 컨트롤 싱크대가 있습니다. 기능성 임상 셀 생산 설비가되는이 실험 위해서는 그러나 여러 추가적인 변형이 여전히 이루어져야한다. 우선, 상기 장치 자체는 휘발성 유기 화합물, 미립자 및 오염 제거에 사용되는 이산화 염소의 농도를 모니터링 할 수있는 능력이 업그레이드되어야한다. 둘째하는 FACS 시스템을 포함하는 처리 챔버를 수용하고 버퍼 모듈을 통해 상기 장치의 나머지 부분에 연결될 수있다. 이것은 셀 정렬 및 TR 정화용 허용적절한 환경 조건 하에서 ansplantable 세포 집단. 마지막으로, 장치 전체 부드러운 벽 클린 룸 내에 보관되어야한다. 이 장치 (5)에 대한 표준화기구 (ISO) 클래스 8 환경에 대한 국제기구를 제공합니다. CPF의 높은 불임 및 컴퓨터 제어 특성은 세포 기반 치료 양호한 제조 공정 미래 애플리케이션에 이상적인 시스템을 만든다. 오염의 위험이 크게 완화되어 있지만, 더 중요한 것은, 전지 팽창 조건을 자동으로 기록하고, 컴퓨터 시스템에 의해 보관된다. 가스 농도, 온도, 습도 및 시스템에 액세스하는 모든 이벤트의 편차는 엄격하게 설명되어 있습니다. 제품 품질 문제를 조사하는 경우에 매우 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 여전히 한계가있다. 일체의 시약 및 소모품의 사용은 (예를 들면, 미디어 구성 요소, 피펫, 플레이트) 별도로 문서화해야합니다. 더하다itionally의 CPF의 모니터링 시스템에 의해 문서화 변수는 전혀 관련이있는 발생할 수있다 (인간의 오류의 다양한 형태 포함) 잠재​​적 인 문제의 다수가 있습니다. 따라서, 고도로 훈련 된 인력과 작업에 대한 자세한 설명서 설명서에 대한 필요성이 장소에 남아 있습니다.

표준 줄기세포 배양 기술은 세포에 과도한 스트레스를 가하고 세포를 허용할 수 없는 오염 위험에 노출시키는 몇 가지 환경적 제약으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 표준 세포 배양 조건에서 세포가 견딜 수 있는 스트레스 중에는 이산화탄소 및 산소 농도 수준의 급격한 변화가 있습니다3,4. 이는 세포가 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛 및/또는 현미경으로 이동할 때 발생하며, 이는 세포에 최적이 아닐 수 있습니다. 이전 연구에서는 저산소성 조건에서 만능 줄기세포와 신경 줄기세포를 모두 배양하는 것의 장점이 확인되었으며, 4,11 최상의 결과를 얻으려면 이러한 조건이 연속적이어야 합니다. 더욱이, 실험실 환경과 인력이 배양 및 조작의 거의 모든 단계에서 세포에 영향을 미치기 때문에 세포 오염의 위험이 더 높습니다. 기존의 클린룸은 오염 위험을 크게 줄일 수 있는 효과적인 방법 중 하나이지만 비용이 많이 들고 설치 면적이 크며 이산화탄소 및 산소 농도와 관련된 스트레스 요인을 해결하지 못합니다. 
오염 위험과 가스 농도를 모두 해결할 수 있고 cGMP 기준9를 충족할 수 있는 세포 생산 시설은 기초 과학 연구 및 임상 응용 분야를 위한 고품질 세포를 제공합니다1,6,7. 이러한 세포 생산 시설은 최소한 다음과 같은 구성 요소로 구성됩니다 : 세포 배양의 공급 및 조작을위한 가열 된 작업 공간 역할을하는 공정 챔버; 시약, 튜브 및 도구의 초기 살균을 위한 층류 후드; 후드와 공정 챔버 사이에 있는 두 개의 완충 에어록 챔버; 공정 챔버에서 접근할 수 있는 2개의 세포 배양 인큐베이터; 공정 챔버에 인접한 현미경 챔버; 마지막으로 이러한 모듈 내의 조건을 설정하고 모니터링하는 컴퓨터 소프트웨어입니다. 이 기본 인프라를 사용하여 만능 줄기 세포 및 다능 신경 줄기 세포의 표준 섭식 및 패시징과 같은 다양한 작업을 수행할 수 있을 뿐만 아니라 센다이 바이러스 기반 재프로그래밍, 체외 이동 연구, 전기 생리학적 특성 분석을 위한 신경 줄기 세포 분화와 같은 보다 전문화된 방법을 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo System</td><td>Biospherix</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Xvivo Software</td><td>Biospherix</td><td>버전 i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 매니폴드</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2 매니폴드</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 DP21</td> 카메라 및 형광이 있는 매니폴드 <td>웨스턴 이노베이터</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered</td><td>Sodium Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자 2</td><td>R& D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 기반 세포 해리 버퍼</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 항체</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 혈청 보충제</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>카탈로그 번호</td><td>설명</td></tr><tr><td>소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml 혈청학적 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 혈청학적 피</td>펫 <td>Olympus</td><td>Plastics 12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 혈청학적 피펫</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 혈청학적 피펫</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 혈청학적 피펫</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 플라스크</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; l 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1,000 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

이 백서에서는 기초 및 전임상 연구를 위해 맞춤형으로 제조된 상업적으로 이용 가능한 밀폐형 세포 배양 시스템을 사용하는 방법을 설명합니다. 생물안전성 작업대(BSC) 및 인큐베이터는 오랫동안 기초 및 전임상 연구를 위한 세포주 배양 및 확장의 표준이었습니다. 그러나 많은 줄기세포 실험실의 초점이 기초 연구에서 임상 중개로 이동함에 따라 세포 배양 시스템에 대한 추가적인 요구 사항이 필요합니다. 모든 공정은 잘 문서화되어야 하며 멸균 및 재현성에 대한 탁월한 요구 사항이 있어야 합니다. 기존 인큐베이터에서는 공급, 계대 배양 또는 기타 조작을 위해 세포를 제거할 때마다 가스 농도와 온도가 크게 변동합니다. 이러한 중단은 cGMP 및 GLP 지침의 표준이 아닌 환경에 기여합니다. 이러한 중단은 특히 세포가 치료 목적으로 활용되는 경우 최소화되어야 합니다. 표준 BSC 및 인큐베이터 시스템에서 폐쇄형 시스템으로 전환하려는 동기는 이러한 중단을 무시할 수 있기 때문입니다. 폐쇄형 시스템은 세포 배양을 공급하고 조작할 수 있는 작업 공간을 제공하며 온도와 가스 농도가 일정하게 유지되는 통제된 환경에서 세포 배양을 유지합니다. 이러한 방식으로 만능 및 다능성 줄기 세포는 파생 순간부터 최종적으로 치료에 사용될 때까지 최적의 건강 상태를 유지할 수 있습니다.

이 원고 일부 상세 셀 생산 설비 및 폐쇄 시스템 내부의 세포를 배양의 고유 한 특징을 설명한다. 셀 생산 설비의 대부분은 작은 크기를 가지며 쉽게 6 × 7.5 m 2 실 (도 2) 내에 수용 될 수있는 특별 주문품, 묶인 세포 배양 장치를 포함한다. 짧은 시간에 실험실 요원 또는 환경에 노출 장치 내의 세포이다. 이 장치는 여러 모듈로 구성하는 처리 챔버, 층류 후드는 후드와 프로세스 챔버, 두 세포 배양 인큐베이터, 처리 챔버에 인접한 현미경 챔버 사이에서 2 버퍼링 에어 록 챔버 (도 3). 이 시스템은 환경 변수 (도 1)를 제어 및 모니터링 할 수 있도록 소프트웨어에 의해 제어된다. 이 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터가 무정전 전원 공급 장치입니다. 가스 번째에 공급산소, 질소 및 이산화탄소 (도 4)에 대한 매니 폴드의 집합으로 전자 시스템. 액티브 세트 및 예약 설정 - 장치의 가스 탱크 두 세트의 각이 매니 폴드 시스템에 의해 제공됩니다. 활성 세트가 아래로 그릴 때, 매니 폴드는 자동으로 예약 설정 및 직원 위해 교체 탱크로 전환됩니다. 전원 백업 발전기 시스템이다. 능성 및 신경 줄기 세포는 신규 장비에 고유 한 추가 합병증, 이전에 개발 된 프로토콜 (9)를 사용하여이 기능에서 저산소 조건에서 재배 할 수있다. 다 능성 줄기 세포를 분리하고 확장된다 완전히 형질 콜로니를 식별 능성 특이 항체를 사용하여, 센다이 바이러스를 이용하여 유도 될 수있다. (도 5A와 B)이 iPSCs로부터, 신경 줄기 세포와 뉴런 듀얼 SMAD 억제를 유도하여, 그 표현형은 USI를 검증 할 수있다<html> NG NSC 특이 항체 (도 5c 및 D). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> 셀 생산 시설에 대한 그림 1. 그래픽 인터페이스. (A)에 CPF의 그래픽 표현은 기본 화면입니다 (그림 1 층) 그림 3. 버퍼 모듈 1 위에 마우스의 클릭으로 표시되는 CAD 도면과 일치 O 2 값 (도 3, 3) 상기 처리 챔버와 일치하도록 설정되어 그 제어 화면 (B)를 연다. 마찬가지로, 프로세스를 클릭 회의소 또는 인큐베이터 1 값이 적절하게 변경하거나 모니터링 할 수 있습니다 각각의 제어 화면 (각각 C와 D를) 나타납니다.<html> rget = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> 는 셀 생산 설비 2. 그림. (A) 정면 우에서 본 시스템. 오른쪽에있는 현미경 액세서리 및 컴퓨터와 천장의 전력 및 가스 연결 및 카트를합니다. (B) 우측에서 본 상기 버퍼 모듈에 액세스 도어와 층류 후드. 후방에 볼 (C) 두 인큐베이터 (블랙 도어)와 프로세스 챔버. (D) 시스템의 오른쪽 통해보기 현미경을 보여주는 거리에서 볼 버퍼 챔버에 문을 모니터링 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> t &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> 셀 생산 설비도 3. CAD 드로잉. 장치 들어가는 모든 항목은 제 층류 후드에서 건조시켜 알코올과 공기 닦여 (1). 항목은 다음 UCPC 모듈에 전달되기 전에 프런트 버퍼 모듈 (2 층)에서 적절한 분위기로 전환하거나하는 공정 챔버 (3). 세포는 두 인큐베이터 (4, 5)에서 배양한다. 라이브 세포 얼룩, 식민지 따기, 일반 세포의 형태 및 마이그레이션 분석의 평가는 UPC 모듈에서 발생, 또는 현미경 회의소 (6). 마지막으로, 폐기물 후면 버퍼 모듈 (2R)를 통해 시스템을 종료합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> 가스 및 전력 그림 4. 소스. (A)는 실험실의 모든 인큐베이터 공급과 같이 CO 2 매니 폴드는 4 × 4 설정입니다. (B)이 O이 매니 폴드는 2 × 2 셋업 및 용품에만 셀 생산 설비가있다. 시스템의 질소는 또한 자동으로 (왼쪽 아래) cryofreezers을 채 웁니다 (오른쪽) 액체 질소 매니 폴드에 부착 (바로 종료 기호 아래에, C) 기화기에서 발생한다. 매니 폴드 (160)는 L 액체 질소 탱크 두 쌍에 의해 제공되는 2 × 2 설치된다. CO 2, O 2, N 2 차단 장치 (D)를 통해 천장에 공급된다. 주택의 진공는이 위치에 공급된다. 시스템에 전원을 공급하는 전원 케이블의 한 쌍의 바로 공급 가스 차단 장치 뒤에 본.F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> 센다이 바이러스에 저산소증에서 파생 된 그림 5. 다 능성 줄기 세포. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (명칭 스토 버 등. 구에 있음), 위상 대비 10 배. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs는 AF-594 표지 트라-1-60, 1 라이브 스테인드 : 미디어 100 희석. 모든 iPSCs 센다이 바이러스, 5 % O 2의 셀 생산 설비에 형질 도입 하였다. 챔버 슬라이드에 5 % O 2에서 성장 SC68.1 - UH0-2I0 - M0S13 - N2G6 IPSC 파생 NSCs의의 (C) 단계의 대비,. 세포를 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고 항 - 인간 네 스틴 차 항체로 염색 알렉스 488 차 항체 하였다. 모든 규모의 바 (100)에있다1;. m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

다음은 기존의 생물 안전성 캐비닛 및 인큐베이터를 대체하여 최대한의 무균성과 재현성을 허용하는 밀폐된 세포 배양 시스템에서 만능 줄기 세포(PSC) 및 신경 줄기 세포(NSC)를 성장시키는 프로토콜입니다. 이 장비는 cGMP(Clinical Good Manufacturing Practice) 및 cGLP(Clinical Good Lab Practice) 지침을 충족합니다.

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

이 장비를 사용하는 전반적인 목표는 최대의 무균 상태를 유지하면서 정의된 대기 조건에서 줄기세포를 배양하는 것입니다. 오늘 저희가 시연할 내용은 세포 배양 파라미터를 정밀하게 제어할 수 있는 밀폐형 세포 배양 시설의 사용법입니다. 저희 실험실에서는 이 시설을 다능성 줄기세포 및 만능성 줄기세포 배양에 사용하고 있습니다.이 방법의 주요 장점은 세포를 처리하는 동안 어느 위치에 있든 세포가 일정한 환경에 노출된다는 점입니다. 세포를 조작할 때나 인큐베이터 내에 있을 때, 또는 현미경 상에 있을 때 모두 산소, CO2 노출 정도와 온도가 사이클 전체적으로 일정하게 유지됩니다. 실험 절차 시연은 저희 실험실의 스태프 과학자인 Alexander Stover가 진행하겠습니다.이 절차를 시작하려면, 가스 농도를 조절할 모듈을 클릭하십시오. 현재 설정값이 표시되는 새 창의 Setpoint 아래에 있는 기존 산소 설정값(setpoint value)을 클릭하고, 해당 모듈에 필요한 산소 농도를 입력하십시오. 그다음, 녹색 체크 표시를 클릭하여 설정값을 확인하십시오.이 과정을 이산화탄소에 대해서도 반복하고, 산소 조절만 가능한 버퍼 챔버를 제외한 모든 모듈에 5% carbon dioxide 설정값을 입력하십시오. 그 다음, Process Values로 표시된 현재 가스 농도를 모니터링하여 새로운 설정값에 도달하는지 확인하십시오. 이후, 모든 모듈의 가스 설정값을 적절한 수치로 조정하십시오.서로 노출될 챔버들의 이산화탄소 및 산소 농도를 일치시키십시오. 예를 들어, 5%oxygen에서 세포를 배양하는 인큐베이터를 열기 전에 프로세스 챔버를 5%oxygen으로 조정하십시오. 또한 프로세스 챔버에 물품을 넣을 때 사용하는 버퍼 챔버도 5%oxygen으로 조정하십시오.이어서, 가스 조절용 화면을 사용하여 공정 챔버의 온도를 37 °C로 설정합니다. 그 다음, 공정 챔버 바닥 온도를 37 °C로 설정합니다. 각 인큐베이터 하단의 배양 모듈 뱅크를 클릭하고 뱅크의 온도를 37 °C로 조절합니다.층류 후드(Laminar Hood) 내에서 시스템으로 투입되는 모든 재료에 70% ethanol을 분무하고 건조시킵니다. 플라스크나 세포 배양 플레이트는 70% ethanol을 적신 멸균 거즈 스펀지로 부드럽게 닦아냅니다. 다음으로, 버퍼 챔버의 외부 도어와 내부 도어가 모두 확실히 닫혀 있는지 확인한 후, 외부 도어를 열고 물품을 내부에 넣은 뒤 다시 닫습니다.소프트웨어를 사용하여 버퍼 모듈을 선택하고 Dilution Factor 탭을 클릭하십시오. Log Factor 상자에 1을 입력한 후 start를 클릭하십시오. 그래픽 인터페이스에서 Dilution Factor 표시가 더 이상 깜빡이지 않으면, 버퍼 챔버의 내부 도어를 열고 재료를 프로세스 챔버로 옮기십시오.프로세스 챔버에서 품목을 제거하려면, 먼저 버퍼 챔버의 희석 배수(Dilution Factor) 처리 과정이 완료되었는지 확인하십시오. 그런 다음 내부 도어를 열고 제거할 품목을 안에 넣은 후 도어를 닫으십시오. 그 후 외부 도어를 열어 품목을 꺼내십시오.각 인큐베이터 바닥의 워터 팬에 페트리 접시 3개를 배치합니다. 이 접시들에 멸균수를 채우고 수위를 유지하십시오. 이는 인큐베이터 내에 설정된 상대 습도를 유지하는 데 매우 중요합니다. 그래픽 인터페이스에서 인큐베이터를 클릭하십시오.그 다음, 설정값(setpoint) 아래의 상대 습도에 표시된 기존 값을 클릭하고 85%를 입력하십시오. 그런 다음 녹색 체크 표시를 클릭하여 이 값을 적용합니다. 이어서 도입할 세포의 종류에 필요한 가스 설정값에 맞춰 버퍼 챔버, 프로세스 챔버 및 인큐베이터를 조정하십시오. 멸균 거즈와 벤잘코늄 클로라이드 기반 제품과 같은 비인화성 소독제를 사용하여 프로세스 챔버의 표면을 세척하십시오.그런 다음, 장갑과 문 손잡이 같이 자주 접촉하는 표면을 세척하십시오. 이어서 70% ethanol로 층류 후드(Laminar Flow Hood) 표면과 완충 챔버(buffer chamber)를 세척하고 건조시키십시오. 그 후, 세포가 담긴 플라스크나 플레이트를 후드 안에 넣고 ethanol을 적신 멸균 거즈 스펀지로 외부 표면을 짧게 닦아내십시오.그 다음, 플라스크 또는 플레이트를 버퍼 챔버에 넣고 희석 배수(Dilution Factor)를 실행합니다. 완료되면 즉시 플라스크 또는 플레이트를 적절한 인큐베이터로 옮깁니다. 인큐베이터는 프로세스 챔버 뒤쪽에 위치하므로, 세포 배치를 위해 선반을 프로세스 챔버 쪽으로 당겨내고, 인큐베이터 문을 불필요하게 장시간 열어두지 않도록 주의하십시오.이 단계에서는 세포 배양 배지를 준비합니다. 배지 용기의 캡을 약간 열어둔 상태로 20분 동안 두어, 배지가 시스템 내의 이산화탄소 및 산소 농도와 평형을 이루도록 합니다. 그 후, 웰에서 기존 배지를 제거합니다.다능성 줄기세포의 경우, 배지 교체 과정 중 건조를 방지하기 위해 소량의 기존 배지만 남기고 거의 모두 제거합니다. 신경 줄기세포의 경우, 기존 배지의 절반을 제거합니다. 그 다음, 세포 배양 플레이트에 신선한 배지를 추가하고 플레이트를 지정된 배양기에 다시 넣습니다.여기에 iPSC의 이미지가 제시되어 있습니다. 이는 배지 내에서 1:100로 희석된 AF594 표지 Trial 160으로 생체 염색한 iPSC입니다. 모든 iPSC는 세포 생산 시설에서 5% 산소 농도 하에 Sendai 바이러스를 통해 형질도입되었습니다.여기 챔버 슬라이드에서 5% oxygen 농도로 배양한 iPSC 유래 신경줄기세포의 위상차 이미지입니다. 세포는 4% paraformaldehyde로 고정시킨 후, Anti-Human Nestin 1차 항체와 Alexa Fluor 488 2차 항체로 염색하였습니다. 숙달되면 이 일련의 기술적 과정은 적절히 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 실험 과정을 수행할 때, 시작 전 가스 농도를 정확하게 설정하는 것이 중요합니다. 이후 리프로그래밍이나 분화와 같은 다른 방법을 통해 저산소증이 다능성(pluripotency) 또는 다분화능(multipotency)에 미치는 영향과 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 구할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 소아 신경퇴행성 질환 치료를 위한 임상 세포 생산을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사하고 인간의 신경 발달을 탐험하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간의 줄기 세포 연구의 증가 재현성의 희망에 culturing 및 passaging hNSPCs의 방법을 보여줍니다.

인간 신경 줄기 세포를 Passaging

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

이 비디오는 신경 줄기 세포의 성장 및 유지를 위해 세포 배양 워크스테이션에서 통제된 환경을 유지하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 절차에는 챔버 조건 설정, 세척 프로토콜 및 매체 준비가 포함되므로 최대 멸균 및 재현성을 유지하고 기존 방법을 대체합니다.

세포 생산 시설에서 신경 줄기 세포 배양 처리

여기에서는 해리된 단일 세포의 비집락형 단층(NCM) 성장을 기반으로 하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배양 프로토콜을 제시합니다. Rho 관련 키나아제 억제제 또는 라미닌 동형(laminin isoform 521, LN-521)을 활용하는 이 새로운 방법은 다량의 동질적인 hPSC 생산, 유전자 조작 및 약물 발견에 적합합니다.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

이 프로토콜은 추가적인 외인성 보충 또는 hPSC 특이적 합성 하층(hPSC) 없이 젤라틴으로 코팅된 접시에 담긴 인간 태반에서 유래한 조건화된 배지만을 사용하여 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 증식시키는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

이 기사에서는 벤치탑 3D 현탁액 바이오리액터에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

여기서는 자동화된 세포 배양 시스템을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 자동 배양 시스템은 iPS 세포의 유지에서 다양한 유형의 세포로의 분화에 이르기까지 유도만능줄기세포(iPS) 세포 취급에 익숙하지 않은 연구자를 포함하여 노동력을 줄이고 사용자에게 이점을 제공합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포의 유지 및 분화를 위한 자동 배양 시스템

배우세요 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다능성 및 신경 줄기 세포를 배양하는 방법을. 이 기술은 cGMP 및 cGLP 기준을 준수하며 최대 무균성과 재현성을 보장하여 줄기세포 생물학 연구에 활용됩니다.

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

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