Name: 효소 적, 화학 (메틸화) 및 물리 (질량 분석, 핵 자기 공명) 기법을 사용하여 공장 벽 Heteroxylans의 연속 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 배우세요 헤테로자일란의 환원 말단과 내부 글리코실 서열을 효소적 가수분해와 질량 분석, 핵 자기 공명을 통해 특성화하는 방법을. 이 통합 접근법은 식물 세포벽 다당류의 미세 구조 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 프로젝트는 Food Futures Flagship을 통해 고섬유질 곡물 클러스터에 제공된 Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program의 자금으로 지원되었습니다. AB는 또한 ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls(CE110001007)에 대한 ARC(Australia Research Council) 보조금의 지원을 인정합니다.

2- 아미노 벤즈 아미드와 W-졸 AX를의 감소 끝 1. 라벨은 (RE) 설탕 잔류 물 (2AB) <ol><li> 이들 형광 유도체 다당류 골격 사슬의 환원 말단을 변환하는 65 ° C에서 2 시간 동안 1 M의 NaBH 3 CN (시아 노 수소화 붕소 나트륨) (PH 5.5)의 존재하에 2AB (0.2 M)과 W-졸 AX를 부화. 주의 :이 물과 접촉 할 때의 NaBH 3 CN 독성 시아 나이드 기체를 방출 할 때 다음 단계 퓸 후드에서 수행되어야한다. <ol><li> 을 NaBH 3 CN (62.8 mg)을 칭량하고, 1 M의 NaBH 3 CN 용액을 조제 물에 microcentrifuge 관 (1.5 mL) 중의 (1 ㎖)에 녹인다. (65)에서 가열 한 M을 NaBH 3 CN 용액 (1 ml)에 2AB 시약 (27.2 ㎎)을 녹이고 &#160; ° C 10 % 아세트산으로 pH 5.5, 반응 혼합물 (0.2 M 2AB 1 M의 NaBH 3 CN)의 pH를 조정. </li><li> W-그래서에 반응 혼합물의 200 μL (0.2 M 2AB 1 M의 NaBH 3 CN)를 추가캡 유리관에서 패 AX를 (1 mg) 및은 볼텍스 믹서를 사용하여 혼합한다. 65에서 2 시간 동안 품어 &#160; 흄 후드에서 C를 °. RT에 정지 쿨 4 권을 추가합니다. 무수 에탄올. </li><li> 감기 저장소에 다당류를 침전 (4 ° C) O / N을 정지 놓습니다. </li><li> 원심 분리기 (1,500 XG, 10 분, RT)은 상층 액을 제거합니다. 각 세척 사이에 원심 분리, 무수 에탄올 (4 배), 아세톤 (1 배) 및 메탄올 (1 배)로 광범위하게 펠렛을 씻으십시오. 40 ° CO / N에서 진공 건조. 참고 : 광범위한 세척도 잔류 2AB을 제거합니다. </li></ol></li></ol> 2 AB 레이블 된에서 Xylo 올리고당의 2 세대 W-졸 AX를 <ol><li> 2AB는 마이크로 원심 튜브에서 아세트산 나트륨 완충액 500 μL (100 mm의 pH를 5) (1.5 ml)에 W-AX를 졸 (1 mg)을 표지 녹인다. endoxylanase의 4 단위 (GH (11), [M1]) 추가 37 부화 &#160; 16 시간 동안 C를 °. </li><li> 반응 믹스트을 가열하여 효소 활성을 파괴끓는 물을 욕조에 10 분 동안 URE. RT에 정지 쿨과 모자를 유리 튜브에 전송할 수 있습니다. 4 권을 추가합니다. 절대 에탄올과 냉장의 서스펜션을 배치 (4 ° C) O / N은 ​​소화되지 않은 다당류를 침전한다. </li><li> 원심 분리기 (1,500 XG, 10 분, RT)은 소화되지 않은 다당류 (펠렛)를 분리하고 endoxylanase은 (뜨는) xylo 올리고당을 생성합니다. 깨끗한 유리 튜브에 뜨는을 가만히 따르다과 따뜻한 물을 욕조 (40 ° C)에 배치합니다. </li><li> 종료점 부피 (~ 500 μL)을 질소 기류하에 에탄올을 증발시켰다. 4 시간 동안 -80 ° C에서 뜨는을 동결하고 xylo 올리고당을 복구하는 동결 건조기에서 냉동 뜨는을 건조. </li></ol> KOH-졸 AX를하고 2AB의 라벨에서 Xylo 올리고당의 3 세대 <ol><li> (섹션 2.1-2.4) 전술 한 바와 같이 xylo 올리고당을 생성하는 endoxylanase와 KOH-졸 AX를 (GH (11), [M1]을) 취급합니다. </li><li> endox 치료ylanase은 (섹션 1.1.1-1.1.2) 전술 한 바와 같이 2AB 반응 혼합물 (0.2 M 2AB, 1 M을 NaBH 3 CN)과 KOH-졸 AX를에서 xylo 올리고당을 생성합니다. </li><li> 깨끗한 유리 튜브에 뜨는을 가만히 따르다과 따뜻한 물을 욕조 (40 ° C)에 배치합니다. 종료점 부피 (~ 500 μL)을 질소 기류하에 에탄올을 증발시켰다. 4 시간 동안 -80 ° C에서 뜨는을 동결하고 xylo 올리고당을 복구하는 동결 건조기에서 냉동 뜨는을 건조. </li></ol> 4. MALDI-TOF-MS <ol><li> MALDI-매트릭스 솔루션의 제조 <ol><li> 튜브 (MALDI 매트릭스 용액)을 0.1 % 포름산을 함유하는 50 % 아세토 니트릴 (500 ㎖)에 2,5- dihydroxbenzoic 벤조산 (DHB)의 작은 국자를 추가한다. 신속 용해 경우, DHB의 또 다른 작은 국자를 추가, 소용돌이를 사용하여 섞는다. 참고 : MALDI-매트릭스 솔루션의 최적 농도는 10 μg의 인 / μL -1. </li></ol></li><li> MALDI-대상 플레​​이트의 제조 <ol><li> aqueo을 증착우리가 (기본) 샘플 (5 ~ 10 μg의)을 올리고당 MALDI-타겟 판 위에 (W-졸 및 / 또는 KOH-졸). 별도의 팁을 사용하여 0.3 ㎕를 MALDI-매트릭스 솔루션을 추가로 pipetting 아래로 섞는다. 혼합물을 실온에서 건조하도록 허용합니다. 참고 : 제대로 건조 샘플이 자리의 중심을 향해 가리키는 긴 바늘 모양의 결정으로 구성되어야합니다. 입금 스티커 및 / 또는 더럽혀진 경우 샘플이 너무 농축 또는 그의 염으로 구성 될 수도 있고, 이러한 침전물은 양호한 스펙트럼을 생성 할 가능성이 샘플을 추가로 정제한다. </li><li> MS는 소스로 표적 판을 소개하고 양 (+ 필자) 이온 모드로 동작한다. 이온 소스 (1)에서 19.0 kV로, 이온 소스 (2)에서 16.3로 kV의 가속 전압을 조정은 70 % 이상으로 레이저 출력을 조정한다. MALDI-대상 접시에 샘플 지점을 선택하고 레이저 촬영을 시작하기 위해 시작을 클릭합니다. 참고 : 대상의 모든 영역 신호를 생성하지 않습니다. 특정 장소 만에 하나 때문에 몇 레이저 샷에 대한 신호를 줄 것이다샘플 / 매트릭스 혼합물 또는 결정의 특성 고갈. <ol><li> 만족스러운 신호 - 대 - 잡음을 구하는 취득 평균 동안 약 200 무작위 스펙트럼을 타겟의 상이한 영역에 레이저를 이동. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. ESI-QTOF-MS <ol><li> RP를 사용하여 전기 분무 이온화 (ESI) 온라인 크로마토 그래피 분리와 비행 (QTOF) MS 악기의 사중 극자 시간과 함께 나노 HPLC를 사용하여 endoxylanase 생성 된 올리고당 (기본)을 분석 C-18 컬럼 (75 μm의는 X 150mm, 3.5 μm의 비드 크기). <ol><li> 유리 병에 endoxylanase 생성 된 수성 올리고당 혼합물을 전송하고 HPLC 오토 샘플러에 배치합니다. 60 분에 걸쳐 각각 아세토 니트릴의 이동상을 0.1 % (v / v)의 물, 포름산 0.1 % (v / v)의 포름산 5-80%의 용출 구배를 프로그램. </li><li> 0.2 μL / 분의 유속을 조정한다. 스캔 범위에서 긍정적 인 이온 모드를 조정커튼 가스 (10) GS1 4 원 온도 100 ℃ 이온 분무 전압 2300 V, 잠재적 50 디 클러스터링 : 300-1,600 m / z 다음과 같이 초 ESI 소스 조건을 사용하여 0.5g / 주사의 주사 속도 V.를 실행 LC 크로마토 그래피 프로그램과 용출 올리고당. 그 결과 총 이온 크로마토 그램 (TIC)는 소프트웨어에 의해 자동으로 저장됩니다. </li><li> 저장된 TIC를 열고 추출 크로마토 그램을 선택합니다. 명령 줄에서 예상 질량 (예를 들어, 271, 403, 535, 667, 799 및 931m / Z)를 입력합니다. 입력을 클릭하여 스캔 크로마토 그램. 제조자의 지시에 따라 (14) 소프트웨어를 사용하여 ESI-QTOF MS 크로마토 그램 데이터의 선택 이온 스캔 처리한다. </li></ol></li></ol> 6. ESI-MS N <ol><li> 주사기를 사용하여의 nanospray 팁에 50 % 아세토 니트릴 샘플 당 O 메틸화 올리고당 1~2 μL를 넣고 (Pettolino 외. (1)에 의해 기술 된 바와 같이 메틸화). 손질유리 커터를 사용하여 나노 분무 팁은 MS에 부착 된 개별 나노 분무 홀더에 맞게. </li><li> 긍정적으로 예상 질량 범위 (200-1,500 m / z)와 커튼 가스 (10), ionspray 전압 1,900 V의 극성에 따라 질량을 설정합니다. </li><li> 관련 창을 열고 총 이온 스캔 (ESI-MS 1)를 얻었다 데이터 파일 이름을 입력 획득 버튼을 누릅니다. 그 다음 STOP 버튼을 누릅니다. </li><li> 관심의 피크를 단편화하는 제품 이온에서 스캔 유형을 변경합니다. 관심의 질량을 입력합니다 (예 : 885m / z) 조각화 및 질량 범위 (200~900m / Z)를 조절합니다. 획득 버튼을 누르면 부모 이온의 전체 조각 (885m / Z)를 달성하고 조각 이온 스캔 (ESI-MS 2) 취득 (위 / 아래로 화합물 탭) 충돌 에너지를 조정합니다. </li><li> 관심 (예를 들어, 711m / z)의 조각 이온의 질량을 입력하고 질량 범위를 조정 (200~720m / z). 획득 버튼의을 눌러전구체 이온의 전체 조각 (711m / z)를 달성 단편 이온 스캔 (ESI-MS (3))를 취득하는 충돌 에너지를 조정 거라고. </li></ol> 7. H 1 NMR 분광학 <ol><li> D 2 O의 플라스틱 시험관 (1.0 ㎖, 99.9 %) (15 ml)에 올리고당 endoxylanase 생성 혼합물 (KOH 졸, 기본 체) (~ 500 μg의)을 녹인다. 4 시간 동안 -80 ° C에서 현탁액을 동결하고 xylo 올리고당을 복구하는 동결 건조기에서 동결 된 현탁액을 건조. </li><li> 완전 D 2 O로 H 2 O를 교환하기 위해 7.1 회 반복 </li><li> D 2 O에 (0.6 ml를, 99.9 %)을 건조 올리고당을 분해하고 내부 표준으로 아세톤 0.5 μL (D 2 O 5 %)를 추가합니다. NMR의 샘플 튜브에 중수 소화 올리고당을 전송합니다. </li><li> 상단에 의한 NMR 튜브를 포함하는 샘플을 잡고 플라스틱 스피너에서 샘플 튜브를 삽입합니다. 샘플 깊이 게이지의 회 전자를 놓습니다. 고름H는 샘플 상하 깊이 게이지의 중심선이 동일하도록 시료의 깊이를 조절하기 위해 시료 튜브를 당기거나. </li><li> 깊이 게이지를 제거하고 냉동 프로브가 장착 된 600 MHz의 NMR 분광계에 부착 된 자동 샘플러로 샘플을 삽입합니다. </li><li> 로그인 및 오픈 분광계 제어 소프트웨어. 샘플 파일 이름을 입력합니다. 기존 데이터 집합을 열고 다음 새 이름으로 저장 &quot;EDC&quot;명령을 사용합니다. 자동 샘플러의 샘플의 위치 번호를 입력하고 &quot;ENTER&quot;키를 누릅니다. 참고 :이 프로브의 상부에 위치한다 자석 구멍에 조심스럽게 샘플 튜브를 드롭 것 &quot;ENTER&quot;버튼을 누르면. </li><li> 명령 줄에서 &quot;edte&quot;를 입력하여 원하는 샘플 온도를 설정합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 원하는 값에 도달하기 위해 시료 온도 기다린다. 입력 명령 행에서 &quot;잠금&quot;적절한 용매를 선택 (D 2 O). &amp; # 기다립니다(34); 창 하단에 표시 완료 &quot;메시지를 잠급니다. </li><li> 명령 줄에서 &quot;ATMM&quot;를 입력하고 ATMM 메뉴 바의 상단에있는 &quot;최적화&quot;를 클릭합니다. 선택된 채널 (이 경우 1 H)에 대한 조정 및 프로브의 매칭 시작을 선택합니다. </li><li> 균일 한 자기장이 명령 줄에서 &quot;ZG&quot;를 입력하고 입력하여 sample.Acquire 주위에 신호를 얻을 때까지 약간의 조정이 자기장에 대한되는 shimming 프로세스에 대한 명령 줄에서 &quot;topshim&quot;를 입력합니다. </li><li> 2.225 ppm으로 아세톤 내부 표준에 언급 한 H 화학 시프트 제조업체의 지시에 따라 소프트웨어 (15)를 사용하여 스펙트럼을 분석한다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

대부분의 매트릭스 상 세포벽 다당류는 겉으로는 무작위로 매우 다양있는 식물 종, 발달 단계 및 조직 유형 3에 따라 (글리코 및 비 글리코 잔류 모두 포함) 백본을 교체했습니다. 다당류 이차 유전자 산물이기 때문에 그 서열은 주형 유도되지 않고, 핵산과 단백질의 존재와 같은 단일 분석 방법들은 시퀀싱, 따라서 존재하지 않는다. 정제 된 링크 관련 가수 분해 효소의 유용성은 크로마토 그래피 분별 될 수 올리고당 다당을 분해하는 강력한 도구를 제공하고, 화학적 및 물리적 방법과 조합하여 사용될 때 완전히 서열 분석 하였다. 도전은 성공적이 될 해결하기 위해 여전히 원래의 다당류 서열 - 하나에 이러한 복잡한 혼합물을 다시 조립하는 것입니다. 여기에서 우리는 접근 방식 (응용 캘리포니아의 그 순서를 설명N 설립 효소 적, 화학적 환원 말단 (RE) 및 heteroxylans의 내부 영역 글리코 서열 (들) 모두의 구조적 특성에 대한 물리적 기술의 통합에 의존하는...

Heteroxylans는 잔디의 주요 벽과 모든 피자 식물 3-6의 2 차 벽의 주된 비 셀룰로오스 다당류있는 다당류의 가족입니다. 크 실란 백본은 유형과 글리코 (글루 쿠 론산 (GlcA), 아라비 노스 (Araf)) 및 비 - 글리코 (O 아세틸, 페룰 산) 조직 유형, 발달 단계 및 종 7에 따라 잔류와 대체 패턴에 차이가 있습니다. 밀에서 벽 (밀 및 aestivum L.) 배젖은 주로 아라비 (AX를) (70 %) 및 (1 → 3)로 구성되어 있습니다 (1 → 4) -β-D 글루칸 (20 %) 셀룰로오스 heteromannans 소량으로 (2 % 씩) 8. 자일란 백본 주로 (주로 O-2 위치 및 정도는 덜 O-3 위치)로 치환 된 모노 - 및 디 - 치환 된 α-L-아와 (O-2, O-3 위치) 다양 - 미 치환 될 수 있고 F 잔류 9. 환원 말단 (RE) 이종의(예를 들면, 가문비 스 (Picea의 구상)) (예를 들어, 애기 장대) dicots에서 크 실란 10 겉씨 11 특징 테트라 사카 라이드의 글리코 시퀀스를 포함 -β-D-Xyl 피 - (1 → 3) -α-L-라곤 피 - (1 → 2) -α-D-갈 P는 A- (1 → 4) -D-Xyl 피. heteroxylan 생합성 기능 (생물 산업)를 이해하기 위해서는 충분히 종류 및 치환 패턴뿐만 아니라 환원 말단 (RE)의 순서를 이해하는 자일란 골격을 시퀀싱하는 것이 중요하다. 단부 (RE) 및 heteroxylans 내부 영역 글리코 서열 (들)을 감소시키는 구조 특성에 사용될 특정 기술이 논문에 기재되어있다. 기술은 효소 (endoxylanase) 가수 분해 전의 heteroxylan 사슬의 환원 말단 (RE) (2- 아미노 벤즈 아미드 (2AB)에) 태그를 형광체에 의존한다. 특히 RE 서열이 접근했다먼저 뉴욕 실험실 10,12-13에 의해보고하지만 지금은 격리 자신의 소스의 독립적 인 모든 heteroxylans에 동일하게 적용 할 설립 기술의 조합을 내부 영역의 염기 서열을 포함하도록 확장하고 있습니다. 이 방법은 (가능) 적절한 엔도 가수 분해 효소를 사용하여 폴리 사카 라이드의 다른 클래스에 적용될 수있다. 설명한 바와 같이, 본 연구에서는 디 먹인 밀 배유 세포벽 물 (W 졸 천을)로 추출 알콜 불용성 잔사 (AIR)와 순차적으로 분리하고 1M KOH 1 %의 NaBH 4 (KOH 졸 프랑)을 함유 한 Ratnayake에서 외. (2014) 2. W- 및 KOH 졸 FRS 모두로부터 방출 된 올리고당은 함께 HPLC로 ESI-QTOF-MS 결합 MALDI-TOF-MS의 조합을 사용하여 수행 한 다음 메틸화 모두 천연 및 메틸화 올리고당의 상세한 구조 분석이다 RP C-18 컬럼을 사용하여 온라인 크로마토 그래피 분리및 ESI-MS 없음. Endoxylanase는 KOH 졸 AX를 또한 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 분석되었다 분해.

<table><tbody><tr><td>2 아미노벤즈아미드(2AB)</td><td>시그마-알드리치(www.sigmaaldrich.com)</td><td>A89804</td><td></td></tr><tr><td>소듐보로하이드라이드(NaBH4)시</td><td>그마-알드리치(www.sigmaaldrich.com)</td><td>247677</td><td>위험, 주의해서 취급:</td></tr><tr><td>시아노보로하이드라이드나트륨(NaBH3CN)156159</td> <td>www.sigmaaldrich.com 위험</td><td></td><td>, 취급 주의:</td></tr><tr><td>endo-1,4-&beta;-Xylanase M1 (Trichoderma viride에서) (120101a)</td><td>Megazyme (www.megazyme.com)</td><td>E-XYTR1</td><td></td></tr><tr><td>중수소 산화물 (D2O)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기 (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 Zorbax eclipse plus column&nbsp;</td><td>애질런트&nbsp;</td><td></td><td>(2.1&times; 100 밀리미터; 1.8 &마이크로; M 비드 크기)&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로플렉스 MALDI-TOF MS&nbsp; &nbsp; (모델 - MicroFlex LR)</td><td>(Bruker Daltonics, 독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ESI) -(QTOF) MS&nbsp; &nbsp; (모델 # 6520)</td><td>(애질런트, 팔로알토, 캘리포니아)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSn &nbsp;- 이온 트랩&nbsp; (모델 # 1100 HCT)</td><td>(애질런트, 캘리포니아주 팔로알토).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 600MHz -NMR</td><td>Bruker Daltonics, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topspin(버전 3.0)-Biospin- 소프트웨어&nbsp;</td><td>브루커&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (모델 # 7890B)</td><td>애질런트&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

효소 적, 화학 (메틸화) 및 물리 (질량 분석, 핵 자기 공명) 기법을 사용하여 공장 벽 heteroxylans의 연속

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

이 프로토콜은 단부 (RE) 및 heteroxylans 내부 영역 글리코 서열 (들)을 감소시키는 특성을 위해 사용되는 특정 기술을 설명한다. 탈 먹인 밀 배유 세포벽은 알코올 불용성 (W 졸 천을)로 추출 잔사 (AIR) 1 순차적 Ratnayake 외 기재된 바와 같이 1 M KOH 1 %의 NaBH 4 (KOH 졸 천을)를 함유로서 단리 하였다 등. (2014) 2. 두 개의 서로 다른 접근 방법은 (그림 1의 개요 참조)를 채택하고 있습니다. 처음에는 그대로 W 졸 AX를 원래 RE 골격 쇄 당 잔기 태그를 2AB로 처리하고 2AB 표지 RE 각각 올리고당을 감소 내부 영역의 혼합물을 생성하는 endoxylanase로 처리 하였다. 두 번째 접근에서, KOH 졸 천을 먼저 2AB 연속적으로 표시되는 당사슬의 혼합물을 생성하는 가수 분해 endoxylanase. 모두에서 enzymically 발표 ((UN) 태그) 올리고당W- 및 KOH 졸 FRS는 MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS 및 ESI-MS n의 조합을 사용하여 수행 한 다음 메틸화 모두 천연 및 메틸화 올리고당의 상세한 구조 분석이다. Endoxylanase는 KOH 졸 AX를도 또한 아노 머 구성에 대한 정보를 제공하고, 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 특징 분해. 이러한 기술은 적합한 엔도 가수 분해 효소를 사용하여 폴리 사카 라이드의 다른 클래스에 적용될 수있다.

AX를가 2AB 표지 RE 올리고당의 혼합물 및 자일란 쇄 (도 1의 내부 영역으로부터 유래되지 않은 표지 (2AB 라벨없는) 올리고당의 시리즈를 생성 W-졸 Endoxylanase 소화 2AB는 표지]에서 Ratnayake 외. 2). 크로마토 그래피 방법의 시리즈는 이성질체의 착체 혼합물을 분별하기 위해 사용된다. 최종적으로, MS 기술은 다음 기술에 의해 해당 MS 서열화 된 이성질체 구조를 식별하기 위해 사용된다. 여기에서 우리는 오히려 접근 방식의 포괄적 인 예보다, 대표을 제시한다. 2AB 표지 네이티브 W 졸 AX를 (도 2A)로부터 유래 당사슬의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼 신호는 표지 된 일련 나타내는 매우 풍부한 의사 - 분...

이 프로토콜은 효소(엔톡실라나아제) 가수분해 전에 RE에 2개의 아미노벤즈아미드를 태그한 다음 질량 분석법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 결과 올리고당을 분석함으로써 헤테록실란의 말단(RE) 및 내부 영역 글리코실 서열의 구조적 특성화에 사용되는 특정 기술을 설명합니다.

효소 적, 화학 (메틸화) 및 물리 (질량 분석, 핵 자기 공명) 기법을 사용하여 공장 벽 Heteroxylans의 연속

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

전체적인 목표는 수용성 헤테로자일란의 원래 환원 말단 당 잔기에 태그를 지정하고 엔도자일라네이스(endoxylanase)로 처리하여 표지된 올리고당 혼합물을 생성함으로써, 헤테로자일란의 환원 말단 및 내부 영역 당쇄 서열을 분석하는 것입니다. 이 방법은 계획된 성장 발달뿐만 아니라 비생물적 및 생물적 스트레스 요인에 반응하여 나타나는 올리고당 또는 다당류의 미세 구조 변화와 같은 당생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 모든 글리칸 또는 다당류의 환원 말단 서열과 내부 영역 서열을 분석하는 통합적인 접근 방식을 제시한다는 점입니다.1 mL의 물에 1 M 소듐 시아노보로하이드라이드 용액을 준비합니다. 그 다음, 반응 혼합물의 pH를 10% 아세트산으로 pH 5.5로 조정하고 65 °C에서 가열하여 27.2 mg의 2AB 시약을 소듐 시아노보로하이드라이드 용액에 녹입니다. 캡이 있는 유리 튜브에 들어있는 1 mg의 수용성 아라비노자일란에 반응 혼합물 200 µL를 첨가하고 볼텍스 믹서를 사용하여 혼합합니다.흄 후드 내에서 샘플을 65 °C로 2시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 현탁액을 실온으로 냉각시키고 4배 부피의 절대 에탄올을 첨가합니다. 다당류를 침전시키기 위해 현탁액을 저온 저장고에 넣어 하룻밤 동안 보관하십시오.그런 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 각 세척 단계마다 원심분리를 수행하며, 펠릿을 절대 에탄올, 아세톤 및 메탄올로 충분히 세척합니다. 펠릿을 40 °C에서 하룻밤 동안 진공 건조합니다.마이크로 원심분리 튜브에 준비된 2AB 표지 수용성 arabinoxylan 1 mg을 sodium acetate 완충액 500 µL에 녹입니다. endoxylanase 4 units를 첨가하고 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 반응 혼합물을 끓는 물 중탕에서 10분 동안 가열하여 효소 활성을 제거합니다.현탁액을 실온으로 냉각하고 캡이 있는 유리 튜브로 옮깁니다. 절대 에탄올을 4배 부피로 첨가한 후, 소화되지 않은 다당류를 침전시키기 위해 현탁액을 저온 보관함에 하룻밤 동안 둡니다. 원심분리하여 엔도자일라나아제(endoxylanase)로 생성된 올리고당으로부터 소화되지 않은 다당류를 펠렛 형태로 분리합니다.그 후, 상층액을 깨끗한 플라스틱 튜브에 따라내고 따뜻한 수조에 넣습니다. 질소 가스 기류 하에서 에탄올을 최종 부피까지 증발시킵니다. 상층

sequencing-plant-wall-heteroxylans-using-enzymic-chemical-methylation

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 내용과 polyphenolic의 리그닌의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

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세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

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속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

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#946;-1,3-Glucanase 및 Peroxidase Physicochemical 특성 Diuraphis noxia 감염에 대한 밀 세포벽 방어 메커니즘 설명

단백질의 입체 구조와 역학은 단백질 구조 및 기능 사이의 관계를 이해하기위한 열쇠이다. 고해상도 질량 분광법과 결합 수소 교환은 단백질의 형태 적 역학 연구뿐만 아니라 접촉 인터페이스 및 알로 스테 릭 효과를 포함하여 단백질 - 리간드와 단백질 - 단백질 상호 작용을 특성화하기 위해 다양한 방법이다.

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

배우세요 헤테로자일란의 환원 말단과 내부 글리코실 서열을 효소적 가수분해와 질량 분석, 핵 자기 공명을 통해 특성화하는 방법을. 이 통합 접근법은 식물 세포벽 다당류의 미세 구조 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

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