Name: 방법은 쥐 Bcrp1의 대체 발기인 사용 및 전사 규정을 발견 할 수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 발견하세요 쥐 Bcrp1 유전자의 대체 발기인 사용 및 전사 규정 메커니즘을 인실리코 분석과 루시퍼라제 리포터 분석을 통해 연구하는 방법을 배우세요. 이 기법은 유전자 발현 조절 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 더글러스 D. 로스와 재향 군인 담당 부서에서 아리프 후세인에 대한 공로 검토 포상에 의해 지원되었다.

마우스 EST 데이터베이스의 BLAST 분석을 사용하여 Bcrp1의 대안 첫 번째 엑손의 실리 예측 1. 참고 :이 프로토콜을 확인하기 위해 게놈 서열에 일치하는 EST 서열을 정렬하는 방법을 다음 마우스 표현 된 시퀀스 태그 (EST) (포함 번역 시작 사이트) Bcrp1의 2 엑손하는 서열의 유사성과 EST를위한 데이터베이스를 검색하는 방법에 대해 설명 자신의 Bcrp1 엑손 (2)의 5 &#39;말단에 마우스 Bcrp1 유전자의 상대적인 위치. <ol><li> 의 Ensembl 게놈 브라우저 (17)의 검색 창에 mRNA를 참조 시퀀스 ID (NM_011920.3)를 입력하여 마우스 Bcrp1 엑손 2의 순서를 얻기를 클릭 &quot;GO.&quot; 다음 화면에서, 전체 길이 시퀀스 (16 개의 엑손을 포함) 선택 : <ol><li> 다음 화면 ( &quot;대본 기반 디스플레이&quot;)에서 &quot;16 엑손 &#39;을 선택합니다. 이 Bcrp1의 모든 엑손의 서열을 포함하는 화면이 표시됩니다. Bcrp1의 엑손 2 5 &quot;읽9; -AAAGGC ... TATCAA-3 &#39; &quot;기준 18에 도시 된 것과 유사한 것이다 얻어진 결과.. </li><li> &quot;다운로드 순서&quot;옵션을 클릭합니다. 다음 화면에서, FASTA 형식을 선택하고 다음을 클릭합니다 &quot;미리보기.&quot; 다음 화면에서 클립 보드에 엑손 2의 미리보기 시퀀스를 복사합니다. </li></ol></li><li> 생명 공학 정보 (NCBI)의 웹 사이트 (20)를위한 국가 센터에 BLAST 홈페이지 (19)로 이동합니다. <ol><li> &quot;마우스&quot;게놈을 선택합니다. 쿼리 상자에 클립 보드에서 엑손 2 시퀀스를 붙여 넣습니다. </li><li> 데이터베이스 드롭 다운에서 &quot;EST를&quot;를 선택하여 최적화 &quot;매우 유사한 서열,&quot;다음 선택 &quot;BLAST를.&quot; 실행 시간은 몇 분 정도 걸릴 것입니다. 폭발 실행이 완료되면, &quot;결과&quot;페이지가 나타납니다. </li><li> 은 &quot;결과&quot;페이지의 &quot;설명&quot;소호에서 (전체를 &quot;ALL&quot;다음 &quot;다운로드&quot;를 선택한 다음 &quot;FASTA를 선택&quot;드롭 다운 메뉴에서 다음 선택&quot;순서) 계속 &quot;A .txt 파일이 나타납니다;. 열려있는 클립 보드에 전체 파일을 복사 .txt 파일을 마우스 Bcrp1의 exon2 높은 서열 유사성을 가진 모든 EST를의 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다. 하지만 관계에서의 위치는 Bcrp1 유전자에 2 엑손합니다. 참고 : 2015 년 4 월 15 수행 분석이 Bcrp1 엑손 2. 정렬이 표 1에 나와있는 14 쥐 EST를 식별. </li></ol></li><li> Bcrp1 유전자에 2 엑손하는 5 &#39;를 인 EST 서열의 위치를​​ 확인합니다. 마우스 Bcrp1 유전자는 염색체 6 인접 NC_000072.6 (: 372099104 GI)에 위치하고 있습니다. <ol><li> 은 &quot;전문 폭발&quot;부제목 아래 BLAST 홈페이지에서 선택 &quot;BLAST (bl2seq)를 사용하여 두 개 (또는 그 이상)의 순서를 맞 춥니 다.&quot; </li><li> 쿼리 상자에 클립 보드에서 텍스트 파일을 붙여 넣기와 피사체의 순서 상자에 372099104를 입력합니다. 프로그램에서 &quot;매우 유사한 서열&quot;최적화선택 및 실행 BLAST. </li><li> 결과 창이 나타나면, 그래픽 &quot;선형&quot;창에서 &quot;그래픽&quot;을 클릭하여 정렬을 볼 수 있습니다. 오른쪽 및 왼쪽 화살표를 사용하고 Bcrp1 / ABCG2와 서열 정렬에 초점을 확대합니다. </li><li> 순서 정렬을 저장 : &quot;설명&quot;상자에 &quot;ALL&quot;을 선택한 후 &quot;다운로드&quot;드롭 다운 메뉴에서 &quot;테이블 (CSV)를 히트&quot;를 선택하고 다음을 클릭합니다 &quot;계속합니다.&quot; 이 파일은 Bcrp1 엑손 2의 서열 정렬 및 마우스 염색체 6 인접에있는 뉴클레오티드의 번호를 기준으로 Bcrp1 Exon2에 서열 유사성을 가진 모든 EST 서열의 정렬이 포함되어 있습니다. 각 전체 EST 시퀀스는 Bcrp1 엑손 2 중첩 시퀀스를 포함하여 2 엑손하는 지역 5 &#39;및 3&#39;에 걸쳐 여러 정렬을 생성 할 수 있습니다. </li><li> 엑손 (2)의 5 &#39;말단의 위치는 6 번 염색체에 인접 뉴클레오티드 58655638에 대응하는 바와 같이,으로 지정할+1하고는 58,655,638 각각 EST (5 &#39;)의 부분 서열의 위치를​​ 계산한다. 14 EST를위한 결과는 표 1에 나타내었다. 참고 : 5 &#39;잠재적 첫 번째 엑손로 (즉,이 음의 염기 값) +1에 있습니다 EST 서열을 분석하는 데주의해야합니다. 예를 들어, 표 1 (AI647825 및 AI664571)에 도시 Bcrp1 엑손 2 정렬 EST를 두 가지의 나머지 순서는 3 2 엑손하기 &#39;입니다. </li></ol></li></ol> 2. 평가 Bcrp1의 대체 발기인 기능 <ol><li> 기자의 디자인 Bcrp1 E1U, E1A, E1B 및 E1C 프로모터에 대한 구축 <ol><li> 에서 EST 데이터베이스를 검색 얻은 E1U의 시퀀스를 이용하여, +1로 E1U의 제 5 &#39;뉴클레오티드를 나타낸다. </li><li> 세균 인공 염색체 (BAC)의 상류 Bcrp1 / ABCG2 유전자 서열과 순서를 적어도 1백킬로바이트 포함 마우스 염색체 6의 복제를 얻Bcrp1 / ABCG2 유전자 (재료 및 장비의 목록 참조). <ol><li> 이러한 루시퍼 라제 리포터 플라스미드 pGL3-기본으로 적합한 기자 벡터를 식별합니다. </li><li> 기자 벡터의 여러 복제 사이트를 확인합니다. KpnI으로, SacI로, Mlu1, 된 NheI,를 SmaI, XhoI에, BglII에 및 HindIII로 배향 &#39;3&#39;5에서 pGL3-기본 벡터의 다중 클로닝 부위에서 제한 효소 부위이다. 참고 : 소화 사이트의 순서는 제한 효소를 생산하는 회사의 제품 카탈로그에서 사용할 수 있습니다. </li><li> E1U 엑손의 모든 소화 사이트와 E1U는 DNA5 같은 소프트웨어 프로그램을 사용 &#39;을 2킬로바이트 영역 (5)을 확인합니다. E1U 또는 2킬로바이트 상류 지역에서 발견되지 않은 pGL3-기본 다중 클로닝 부위에 적어도 두 개의 소화 사이트를 식별합니다. 참고 : 확인하기 위해 역방향 프라이머 위해 선택된 하나의 상류 인 정방향 프라이머에 대한 여러 복제 사이트 제한 사이트를 선택해야하는 삽입 줘야난 올바른 방향으로합니다. </li></ol></li><li> 앞으로 준비 및 상업 유전자 / 프라이머 합성 서비스 나 프라이머 선택 소프트웨어 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 선택된 pGL3-기본 다중 클로닝 부위의 제한 효소 사이트에 대한 시퀀스를 포함하는 PCR 용 프라이머 역. E1U 순서와 E1U 시퀀스 내에서 역방향 프라이머에서 ~ 2킬로바이트 상류에 위치하는 정방향 프라이머를 선택합니다. 저자들에 사용 된 프라이머 &#39;전작 순방향 프라이머에서의 SacI 부위 및 역방향 프라이머의 된 NheI 부위를 포함하고, 상기 제 5 +64 약 -1,906의 게놈 영역을 증폭&#39;로 지정 E1U의 뉴클레오티드 + 1 (위의 단계 2.1.1 참조), 참조 (16)에 제공됩니다. <ol><li> PCR은 0.01 BAC의 μg의 1이 프라이머를 사용하여 E1U 게놈 영역을 증폭하고, PCR 마스터 믹스에 변성 높은 충실도 Taq 중합 효소를 (재료 및 장비의 목록 참조) 포함(30) 72 ℃ (2 분)에서 확장자 초 후 PCR의 35 내지 40 사이클 및 어닐링에 사용되는 프라이머의 용융 특성에 기초하여 용해 온도가 95 ° C. 주 : 고성능 Taq 중합 효소의 사용은 높은 GC 함량이 시퀀싱 프로모터 영역에 대해 필수적이다. 예 주형 인 BAC 큰 게놈 DNA 단편을 사용하는 경우, 게놈 DNA의 2 차 구조가 곤란 PCR 프라이머가 결합 할 수 있도록 할 수있다. 이런 문제가 발생하면 긴 게놈 DNA 템플릿의 PCR 반응 전에 초음파에 의해 부드럽게 전단 경우 더 PCR 결과를 얻을 수있다. </li><li> 0.8 % TAE 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 1 킬로바이트 DNA 래더에 대해 비교하여, 증폭 된 PCR 산물의 길이를 확인한다. </li></ol></li><li> 얻어진 PCR 생성물 및 pGL3-기본 벡터 다이제스트 제한을 사용하여 전방에 도입 된 제한 효소 부위에 특이적인 엔도 뉴 클레아 제 및 기능에 따라 역방향 프라이머제한 효소 소화가 공급 tructions. <ol><li> 키트 프로토콜 (21) 다음과 같은 상업 SV 젤과 PCR 클린 업 시스템 키트 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 소화 반응을 정화. <ol><li> 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 미가공 벡터에 대해 비교하여 벡터의 소화 및 선형화 확인 후 절단하고 절단 벡터 DNA 밴드를 정제. 정제 된 PCR 제품의 농도와 UV 분광법을 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 정제 벡터를 측정한다. </li></ol></li></ol></li><li> 정제를 결찰하여 E1U 기자 구문을 준비, 제한 효소는 소화 PCR 제품 및 pGL3-기본 반딧불이 루시퍼 라제 리포터 벡터 (리포터 분석 키트에 포함, 재료 목록 및 장비를 참조) 삽입에 : 11, 21, 31의 벡터 비율, 이에 E1U 연구 제조 키트 지시 (22)에 따라, &quot;T4 DNA 리가 퀵 라이 게이션 키트&quot;를 사용하여pGL3-E1U 이름 eporter 구조. <ol><li> 클론 적 조교 복제 키트 pGL3-E1U 다음 지침을 확장하는 박테리아를 변환하는 pGL3-E1U 플라스미드를 사용 (재료 및 장비의 목록 참조). </li><li> 서열 분석에 의해 삽입의 방향과 충실도를 확인합니다. </li></ol></li><li> 준비 기자 E1U에 관해서는 비슷한 방법을 사용 E1A, E1B 및 E1C에 대한 구성한다. 섹션 2.1.5.2에서와 같이 염기 서열에 의한 삽입의 충실도를 확인합니다. 참고 : E1A, E1B 및 E1C의 프로모터 삽입이 있어야 할 약 -1,875 / + 10, -1,847 / + 60 및 E1A, E1B의 (+1로 지정) 처음 5 &#39;뉴클레오티드에 -1,904 / + 83 기준, 각각 또는 E1C. </li></ol></li><li> 리포터 분석 방법 참고 : 기자 분석의 일반적인 전략 : 유전자의 추정 프로모터 (5 &#39;업스트림 영역 것은)는 &quot;reporte를 포함하는 빈&quot;기자 &quot;벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입다중 클로닝 부위로부터 하류 R 유전자 &quot;(예를 들어, 개똥 벌레 루시퍼 라제). 벡터이어서 관심의 유전자를 발현 진핵 세포 내로 형질 감염된다. 활성화해야 이들 세포에서 관심있는 유전자의 발현을 촉진 트랜스 - 작용 인자 형질 리포터 벡터의 프로모터, 용이하게 발광 분석법으로 정량 할 수 반딧불이 루시퍼 라제의 발현을 일으키는. <ol><li> 리포터 분석에 사용하기위한 적절한 세포주를 선택한다. 주 : E1U 다른 프로모터 리포터 구조물의 활성을 평가하기 위해, 즉 E1U 프로모터의 제어하에 Bcrp1 발현 세포로 형질 구축 할 필요가있다. TM4 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포 라인 (재료 목록 및 장비를 참조)는 Bcrp1 단백질을 표현하고 Bcrp1의 mRNA는 E1U뿐만 아니라 E1A, E1B 및 E1C 5를 포함. 음성 대조군으로, Bcrp1 단백질 또는 mRNA를 표현하지 않는 세포주를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> TM4 가전 문화200,000 세포의 초기 밀도 / 웰의 1에서 24 웰 플레이트에서 LLS : 햄 F12 배지와 1.2 g / L 중탄산 나트륨을 가진 둘 베코 변형 이글 배지 1 혼합물은 15 mM의 HEPES 5 % 말 혈청, 2.5 % 이전 5 바와 같이 37 ° C, 5 % CO 2에서 소 태아 혈청, 페니실린 (100 IU / ㎖) 및 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖). </li><li> 여섯 시간 배양 세포를 배치 한 후, 빈 pGL3-기본 벡터 0.2 μg의과 또는 -1,906 / + 64 E1U 또는 -1,875 / + 10 E1A 또는 -1,847 / + 60 E1B를 포함 pGL3 벡터 0.2 μg의와 세포를 형질 또는 -1,904 / + 83 E1C Bcrp 1 삭제 상업 DNA 형질 전환 키트 제조 업체의 프로토콜 23을 사용하여, 내부 통제 등의 pRL-TK (A 레 닐라 루시퍼 라제 발현 벡터)의 4 NG와 함께 구성 (재료 및 장비의 목록 참조) . </li><li> 30 시간 다음과 같은 형질의 cultur에서 성장 미디어를 제거혼성 세포를 형질. PBS 200 μl를 한 번 세포를 세척 한 후 세척 용액을 제거. <ol><li> 개똥 벌레 및 레 닐라 측정 된 루시퍼 라제 활성은 제조자의 프로토콜 (24)에 따른 상업용 키트를 사용. </li></ol></li><li> 내부 (레 닐라 루시퍼 라제) 제어부에 의해 분할 된 반딧불 루시퍼 라제 활성의 비율로 각 튜브에 대한 활성을 발현; 각 리포터의 활성은 1의 값을 특정하는 빈 pGL3 기본 벡터로 형질 감염된 세포의 상대적인 구성으로 전체적인 결과는 일반적으로 표현된다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

더글러스 D. 로스와 메릴랜드 대학, 볼티모어 인간 BCRP에 대한 특허권을 보유.

제시된 방법과 대표적인 결과의 대부분은 2013 5 년에 출판되었다 ​​&quot;마우스 고환에서 B의 crp1 전사 상류 steroidogenic 요소-1에 의해 규제 소설 첫 번째 엑손 (E1U)의 프로모터에 의해 제어된다&quot;라는 이전 작업에 설명되어 있습니다 . 여기에 도시 된 대표적인 결과에 더하여, 이전의 논문은 5&#39;-RACE PCR 및 RT-PCR 방법을 이용하여 대안적인 제 엑손 활용 추정치를 제공 하였다. 또한, 인 실리코 상류 E1U 중 프로모터의 추정 SF-1 반응 요소의 인식을 수행하고, 염색질 면역 (칩) 분석은 SF-1은 추정 SF-1 반응 요소에 결합 된 것을 증명 하였다. 기능 연구는 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포에서, Bcrp 한 전사가 E1U 프로모터의 SF-1 응답 요소를 통해 SF-1에 의해 제어되는 것으로 나타났습니다. 이러한 기능성 연구에 의해 TRA TM4 셀 SF-1의 상향 조절을...

더 많은 인간 유전자의 절반 이상은 다른 발기인 (1)에 의해 조절된다. 각 대안 프로모터는 다른 대안 발기인에서와 다를 수 있습니다 조절 요소를 포함 할 수 있습니다. 하나의 조직에 사용되는 프로모터 (들) 다른 조직에서 사용되는 것과 다를 수 있습니다. 예를 들면, 소정의 신호 전달 경로의 활성화는 하나의 조직에 이용되는 유전자 대안 적 프로모터를 실행하면서도에 영향을 미치지 또는 다른 조직에서 이용되는 것과 같은 유전자에 대한 별도의 다른 프로모터를 금할 수있다. Bcrp1 유전자의 발현은 다른 발기인이 적용됩니다. Bcrp1은 인간의 유방암 저항 단백질 (BCRP) 유전자의 쥐 orthologue입니다. BCRP는 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 트랜스 포터, 공식적으로 지정 ABCG2 2, 3입니다. 정점 세포막 단백질로서, BCRP / Bcrp1 기능 천연 및 생체이 다양한 기질을 유출하는 <sup&gt; 3,4-. (12) - 인간과 쥐에서 BCRP / Bcrp1은 매우 예컨대 태반, 뇌와 고환 2, 5 등 혈액 조직 장벽과 간 (담즙 누소관), 소장, 신장,뿐만 아니라 기관으로 약학 관련 기관 표현된다. 조혈 암 줄기 세포를 포함한 다른 줄기 세포에서 BCRP / Bcrp1 생체 이물질의 발현은 암 화학 요법 제 약물 (3)에 이들 세포의 내성을 부여 할 수있다. 정상 및 종양 세포에서 BCRP 식의 규정을 이해하는 초기 연구에서 cDNA를 종료 (5&#39;-RACE) BCRP의 mRNA의 분석 5 &#39;빠른 증폭 정확한 전사 개시 사이트 (13)을 결정 하였다. 뿐만 아니라 다수의 발견 전사 개시 사이트시켰다 또한 BCRP에 번역되지 않은 첫 번째 엑손, 세 가지 다른 형태가되었다가 발생했습니다. 이러한 대안 첫 번째 엑손 - E1A 지정, E1B, E1C는 - 인체 조직의 다양한 다르게 표현했다. 두 개의 추가적인 제 엑손 변이체 BCRP 13 번째 엑손을 사용하여 인간의 EST 데이터베이스의 BLAST 검색에서 발견되었다. 네 경기는 상류 E1u를 지정되었다 엑손 2에서 첫 번째 엑손&gt; 70킬로바이트를 한 것으로 밝혀졌습니다; 네 개의 다른 경기는 E1- (13)를 지정되었다 완전히 첫 번째 엑손 부족 BCRP의 mRNA를 밝혔다. 대안 리더 엑손의 존재는 다른 프로모터 사용 (14)의 표현 인 것으로 간주된다. 마우스에서, Bcrp1 네 다른 제 엑손 다른 마우스 조직에서 Bcrp 한 전사를 제어하는 프로모터 대신에 대응할 수 것이 기재되어있다; 이러한 엑손 / 발기인 E1U, E1A, E1B 및 E1C을 지정하고, 약있는 70, Bcrp1 엑손 2 5, 15 상류 58, 15, 및 5킬로바이트 E1A mRNA의 이소 형은 murin에서 지배적 인 것으로 밝혀졌다즉 조혈 줄기 세포, 심장, 폐, 비장, 뇌의 E1B 이성체가 골수 5, 15 마우스 대장, 태아 간 세포 및 적혈구 전구 세포에서 발현 된 반면. 상류 E1B로부터 프로모터 포스 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질 (p-CREB) 그 대안 고유 CREB ​​반응 요소에 의해 적어도 부분적으로 조절 마우스 장내 Bcrp1 전사를 지배하는 중요한 대안 프로모터 것으로 나타났다 Bcrp1 프로모터 (16). E1C mRNA의 이성체가 주로 성인 쥐의 간 및 신장 (5)로 표현된다. E1U 이소 형은 5 표현 지배적 인 이소 인 쥐의 고환을 제외하고 테스트 대부분의 조직에서 발견 할 수없는 것입니다. Bcrp1은 (는 말기 정자 4를 보호 할 수있는 정액을 운반하는 내피 세포에서) 모두 체세포 (내피 꽉 접합, 세뇨관 myoid 세포와 세르 톨리 (Sertoli) 세포)와 배아 세포에서 발견되는 쥐의 고환에 표현했다. 등록상류 E1U에서 이온 steroidogenic 인자 -1 (SF-1) 5 기능 응답 요소가 포함되어 있습니다. Bcrp1의 mRNA와 단백질은 크게 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포에서 Bcrp1 발현 SF-1 (5)에 의해 제어되고 있음을 시사 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 특정 SF-1 녹아웃 생쥐의 고환에서 감소된다. 구체적 방법을 제시 프로토콜에 실리 Bcrp1 대체 엑손 제를 검출하고, 상류 식별 된 다른 제 엑손에서 추정 프로모터 루시페라아제 기반 리포터 분석법을 확립.

<table><tbody><tr><td colspan="4">COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:</td></tr><tr><td>First Choice RLM-RACE kit</td><td>Ambion Inc., Austin, TX, 현재 Life Technologies를 통해 구매 가능</td><td>AM1700</td><td>5'-RACE PCR 키트</td></tr><tr><td>TOPO TA 클로닝 키트</td><td>Life Technologies</td><td>K450001</td><td>이 키트에는 TOP10 화학적으로 유능한 E. coli 박테리아가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 빠른 결찰 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart 고화질 Taq- DNA 중합효소</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&nbsp;</td><td>high-fidelity Taq 중합효소 혼합물 함유</td></tr><tr><td>XtremeGENE HP DNA 형질주입 시약</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Dual-luciferase reporter assay kit</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>pGL3-basic empty reporter vector(firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase 발현 벡터 및 기타 control 벡터를 포함합니다.</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>For plasmid miniprep - 박테리아 콜로니에서 플라스미드 DNA의 분리 및 정제</td></tr><tr><td>pCR2.1 벡터</td><td>부분 TOPO TA 클로닝 키트</td><td></td><td></td>의</tr><tr><td>pGL3-basic luciferase 함유</td><td>벡터 Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr><tr><td>pRL-TK Renilla luciferase expressing vector</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial artificial chromosome</td><td>BACPAC 리소스 센터, 아동' s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 및 RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV 겔 및 PCR 클린업 시스템&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>제한 엔도뉴클레아제로 소화 후 PCR 산물을 정제하는 데 유용</td></tr><tr><td>CRYOVIALS</td><td>Denville Scientific</td><td>V9012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SOFTWARE:</td></tr><tr><td>Ensembl software</td><td>Ensembl project</td><td>http://Ensembl.org&nbsp;</td><td>Ensembl 프로젝트는 척추동물 및 기타 진핵생물 종에 대한 게놈 데이터베이스를 제작하고 이 정보를 온라인에서 무료로 사용할 수 있도록 합니다.</td></tr><tr><td>폭발 소프트웨어</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= 웹& PAGE_TYPE=BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3 소프트웨어</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>5'-RACE PCR</td></tr><tr><td>NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CELL LINES:</td></tr><tr><td>TM4 murine Sertoli cells</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715&trade;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS:</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>이것은 상대적으로 저렴하고 수동으로 작동되는 광도계입니다. 96웰 플레이트를 사용하는 동일한 제조업체의 자동화 시스템도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NanoDrop 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>NanoDrop 2000</td><td>분광 광도계는 매우 적은 양의 시료</td></tr><tr><td>DU 800 UV/VIS 분광 광도계 및 핵산 분석 II 소프트웨어</td><td>BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr>을 사용할 수</tbody></table> 있습니다.

방법은 쥐 bcrp1의 대체 발기인 사용 및 전사 규정을 발견 할 수

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

일반적으로 번역되지 않은 - - 첫 번째 엑손 다른 조직에서 유전자 발현은 종종 독특한와의 mRNA의 합성 결과 다른 프로모터에 의해 제어된다. E1U, E1A, E1B 및 E1C : Bcrp1 (ABCG2)는 ABC 트랜스 포터 유방암 저항 단백질 (BCRP, ABCG2)의 쥐 orthologue는, 생산 대응하는 네 개의 대안 첫 번째 엑손에 의해 지정된 적어도 네 개의 대안 발기인이 있습니다. 여기에 실리 프로토콜은 Bcrp1에 대한 대체 발기인 사용량을 예측하기 위해 제공됩니다. 또한, 리포터 분석 방법은 다른 프로모터 리포터 작 제물을 제조하고,이 상류 식별 대안 제 엑손의 추정 프로모터의 기능을 결정하기 위해 설명된다.

리더 엑손의 분석에 의해 마우스 고환에서 Bcrp 한 다른 프로모터 활용의 식별 NCBI의 EST 데이터베이스 프로토콜 1에서 설명 된 단계 (2015 에이프릴) 프로브되었을 때, EST를 게놈에서의 위치와 함께, 하나의 mRNA를 표 1에 나타낸다 Bcrp의 엑손 (2)의 5 &#39;말단으로 연속적인 것으로 나타났다 엑손 E1U (표 1)에 대응하는 mRNA를 엑손 2 ~ 70킬로바이트 상류 게놈 DNA의 서열을 갖는다 Bcrp 1 2 엑손에 인접 인 C...

예로서, 뮤린 ABC 수송 Bcrp1 (ABCG2)을에 실리 프로토콜은 마우스 조직에서 발현하는 유전자로 대체 프로모터 사용량을 검출하고, 리포터 분석법을 사용하여 확인 된 다른 프로모터의 기능을 평가하기 위해 제공된다.

방법은 쥐 Bcrp1의 대체 발기인 사용 및 전사 규정을 발견 할 수

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

이 프로토콜 세트의 전반적인 목표는 Bcrp1과 같은 유전자의 mRNA에서 선택적 첫 번째 엑손을 검출하고 확인된 대안적인 첫 번째 엑손의 상류에 있는 추정 프로모터에 대한 루시퍼라아제 기반 리포터 분석을 확립하는 것입니다. 사용된 인실리코(in-silico) 방법은 다양한 조직에서 mRNA 발현이 어떻게 제어되는지와 같은 전사 및 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 공개적으로 사용 가능한 유전 데이터를 사용하여 관심 유전자의 mRNA에서 대체 첫 번째 엑손을 식별한다는 것이며, 이는 대체 프로모터 사용을 의미합니다.리포터 분석을 준비, 보고, 구성 및 수행하는 이 방법은 추정되는 대체 프로모터의 기능적 활성과 같은 유전자 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 Ensembl 게놈 브라우저의 검색 창에 mRNA 참조 염기서열 ID를 입력하여 마우스 Bcrp1 엑손 2에 대한 염기서열을 얻고 Go를 클릭합니다.그런 다음 16개의 엑손이 포함된 전체 길이 염기서열을 선택합니다. Download sequence(순서 다운로드) 옵션을 클릭합니다.그런 다음 FASTA 형식을 선택하고 미리보기를 클릭합니다. 다음 화면에서 exon 2의 미리보기 시퀀스를 클립보드에 복사합니다. NCBI 웹 사이트에서 폭발 홈페이지로 이동합니다.마우스 게놈을 선택합니다. 클립보드의 exon 2 염기서열을 쿼리 상자에 붙여넣습니다. 그런 다음 데이터베이스 드롭다운에서 EST를 선택합니다.매우 유사한 시퀀스에 대해 최적화한 다음 BLAST를 선택합니다. BLAST 실행이 완료되면 결과 페이지가 나타납니다. 결과 페이지의 Descriptions(설명) 하위 제목에서 All(모두), Download(다운로드), 드롭다운에서 FASTA를 차례로 선택한 다음 Continue(계속)를 선택합니다.txt 파일이 나타납니다. 전체 파일을 열고 클립보드에 복사합니다. Bcrp1 유전자에서 엑손 2에 대한 5 프라임인 EST 염기서열의 위치를 식별하려면 BLAST 홈페이지의 Specialized BLAST 부제목 아래에서 Align two sequences using BLAST를 선택합니다.클립보드의 텍스트 파일을 쿼리 상자에 붙여넣고 제목 순서 상자에 372099104 입력합니다. Program Selection에서 매우 유사한 시퀀스에 맞게 최적화하고 BLAST를 실행합니다. 결과 창이 나타나면 Alignments 창에서 Graphics를 클릭하여 선형을 그래픽으로 봅니다.오른쪽 및 왼쪽 화살표를 사용하고 확대/축소하여 Bcrp1/ABCG2 및 시퀀스 정렬에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 Descriptions(설명) 상자에서 All(모두)을 선택하여 시퀀스 정렬을 저장합니다. Download(다운로드) 드롭다운에서 Hit Table(히트 테이블)을 선택한 다음 Continue(계속)를 클릭합니다.엑손 2의 5 프라임 말단의 위치는 6 개의 염색체 콘티그에서 뉴클레오티드 58, 655, 638에 해당하므로, 이것을 플러스 1로 지정한 다음 각 EST 5 프라임의 부분 서열의 위치를 계산하여 58, 655, 638. 이 절차에서 중요한 단계는 여러 개의 첫 번째 엑손을 예측하는 것입니다. 따라서 대체 프로모터는 여기에서 식별됩니다.EST 데이터베이스에서 얻은 E1U의 염기서열을 사용하여 E1U의 처음 5개의 프라임 뉴클레오타이드를 플러스 1로 지정합니다. Bcrp1/ABCG2 유전자 염기서열과 Bcrp1/ABCG2 유전자의 상류 100킬로베이스 이상 떨어진 곳에 있는 6번 염색체의 백클론을 얻습니다. 그런 다음 luciferase reporter plasmid pGL3-Basic과 같은 적절한 리포터 벡터를 식별합니다.리포터 벡터에서 여러 클로닝 부위를 결정합니다. KpnI, SacI, MluI, NheI, SmaI, XhoI, BglII 및 HindIII는 5 프라임 내지 3 프라임 배향에서 pGL3-Basic 벡터의 다중 클로닝 부위에 있는 제한 내핵 부위입니다. 다음으로, E1U 엑손의 상류에 있는 2개의 킬로베이스 영역을 선택하고 염기서열을 DNA5에 붙여넣은 다음 프로그램을 실행합니다.단일 및 다중 소화 사이트의 세부 정보가 표시됩니다. 그런 다음 엑셀 시트에서 E1U 영역의 분해 부위 목록을 pGL3-Basic 벡터의 MCS와 비교합니다. 그 후, 상용 유전자 프라이머 합성 서비스 또는 프라이머 선택 소프트웨어를 사용하여 제한 내핵 부위를 포함하는 PCR에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 준비합니다.E1U 염기서열의 약 2km 상류에 위치한 순방향 프라이머와 E1U 염기서열 내에서 역방향 프라이머를 선택합니다. 그런 다음 PCR 01과 함께 이 프라이머를 사용하여 고충실도 Taq 중합효소를 함유한 1마이크로그램의 Bak 및 PCR Master Mix로 증폭합니다. 그 후, 0.8%TAE 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 1킬로베이스 DNA 사다리와 비교하여 증폭된 PCR 산물의 길이를 확인합니다.그 후, 순방향 및 역방향 프라이머에 도입된 제한 분해 부위에 특이적인 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 얻어진 PCR 산물과 pGL3-Basic 벡터를 분해합니다. 그런 다음 아가로스 젤 전기영동을 사용하여 PCR 산물의 분해를 확인합니다. 아가로스 겔에서 분해된 벡터 DNA와 2개의 kilobase PCR 밴드를 절단합니다.다음으로, 상용 SV 겔 및 PCR 클린업 시스템 키트를 사용하여 겔 슬라이스에서 소화된 벡터 DNA와 2킬로베이스 PCR 밴드를 추출합니다. UV 분광법을 사용하여 정제된 PCR 산물과 정제된 벡터의 농도를 측정합니다. 이어서, T4 DNA 리가제 퀵 라이게이션 키트를 이용하여 정제된 제한효소 분해된 PCR 산물과 pGL3-Basic 반딧불이 루시페라제 리포터 벡터를 결찰하여 E1U 리포터 구축물을 제조하고, 이에 따라 pGL3 E1U라는 이름의 E1U 리포터 구축물을 제조한다.이 단계에서는 웰당 200, 000개의 세포의 초기 밀도로 24웰 플레이트에서 TM4 세포를 배양합니다. 세포를 배양한 후 6시간 후에 내부 대조군으로 4나노그램의 pRL-TK와 함께 0.2마이크로그램의 MP pGL3-Basic 벡터 또는 0.2마이크로그램의 pGL3 벡터로 세포를 transfection합니다. 형질주입 후 30시간이 지나면 형질주입된 세포에서 성장 배지를 제거합니다.PBS로 세포를 씻은 다음 세척 용액을 제거하십시오. 그 후, 상업용 키트를 사용하여 반딧불이와 Renilla 루시페라아제 활성을 측정합니다. 각 튜브에 대한 활성을 반딧불이 루시퍼라제 활성의 비율을 내부 대조군으로 나눈 값으로 표현합니다.이 단계는 고환 특이적 프로모터의 기능적 활성을 확인합니다. 다음은 전구의 Bcrp1 프로모터 E1U, E1A, E1B 및 E1C에 대한 리포터 분석법이며, 이들은 완전히 세포 유래 TM4 세포입니다. 데이터는 Renilla luciferase의 발광으로 정규화된 반딧불이 luciferase의 발광으로 표현됩니다.별표는 MP pGL3 벡터 컨트롤과 상당한 차이를 나타냅니다. 이 그래프는 Bcrp1 E1U 리포터 구성물에서 SF-1 반응 요소의 돌연변이가 루시페라제 활성에 미치는 영향을 보여줍니다. 추정되는 SF-1 결합 영역을 가진 Bcrp1 리포터 구축물을 SF-1의 강제 발현이 있거나 없는 TM4 세포로 형질주입했습니다.그림에서 a는 빈 벡터 pGL3 컨트롤과 상당한 차이를 나타냅니다. b는 벡터 형질주입된 세포에서 E1U promoter 구조체와 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 리포터 분석에 적합한 세포주를 선택하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 세포주는 리포터 구축물에서 프로모터의 제어 하에 관심 유전자를 발현해야 합니다.이 절차에 따라 여러 조직 샘플에서 선택적 프로모터 사용의 평가를 용이하게 하기 위해 정량적 RT-PCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 관심 유전자에 대한 대체 프로모터 사용을 예측하고 해당 프로모터의 기능을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

methods-to-discover-alternative-promoter-usage-transcriptional

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

유전자 리포터 분석은 DNA 염기서열과 유전자 조절 활동 사이의 관계를 해부하기 위한 잘 정립되고 강력한 도구입니다. 후보 조절 요소를 식별 염기서열 태그를 운반하는 리포터 유전자에 결합하면 이러한 분석의 대규모 병렬화가 가능합니다.

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

여기에 설명된 방법은 anti-apoptotic bacterial effector 단백질의 활성을 해부하기 위해 정의된 단계에서 apoptotic signaling cascade를 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 또한 pro-apoptotic 또는 독성 단백질의 유도성 발현 또는 다른 신호 경로와의 간섭을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

강화, 같은 DNA 규제 요소, 물리적으로 대상 유전자 발기인, 큰 게놈 거리에 걸친 장거리 염색체 상호 작용을 통해 자주 연락 하 여 유전자 발현을 제어 합니다. 발기인 캡처 안녕-C (PCHi-C) 그들의 표적 유전자를 잠재적인 규제 시퀀스의 지정을 활성화 발기인 및 원심 지역 사이 중요 한 상호 작용을 식별 합니다.

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

이 프로토콜은 살아있는 동물 또는 향상 된 락 진압 및 tet 활성 시스템을 사용 하 여 셀에 있는 관심사의 내 생 유전자의 녹음 방송을 통제 될 수 있다 조건에 따라 모델 시스템을 생성 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다.

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

미리 조립된 Cas9/가이드 RNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 직접 전달은 조혈 세포에서 게놈 편집을 위한 빠르고 효율적인 수단입니다. 여기서, 우리는 RUNX1 인트로닉 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 백혈병 세포에서 전사 반응을 검사하기 위해 이 접근법을 활용한다.

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.

뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.

희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations

발견하세요 쥐 Bcrp1 유전자의 대체 발기인 사용 및 전사 규정 메커니즘을 인실리코 분석과 루시퍼라제 리포터 분석을 통해 연구하는 방법을 배우세요. 이 기법은 유전자 발현 조절 연구에 필수적입니다.

방법은 쥐 Bcrp1의 대체 발기인 사용 및 전사 규정을 발견 할 수

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