Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

광유전학과 동결-파괴 복제 면역 표지 기술을 결합한 이 절차의 목표는 확인된 전후 시냅스 요소와 함께 마우스 편도체의 시냅스에서 이온성 글루타메이트 수용체의 밀도를 분석하는 것입니다. 동결-파괴 복제 면역 표지 기술의 높은 재현성과 다양성은 광유전학과 결합될 때 시냅스의 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 위한 매우 강력한 접근 방식을 제공합니다. 이 절차의 주요 장점은 시냅스 전후 요소에 대한 평면적 관점과 이러한 특수 마이크로 도메인에서 단백질의 정량적 분석입니다.

통합 막 단백질의 분포와 조직을 연구하기 위해 다양한 조직에 다양한 기술을 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 결합된 광유전학 FRIL 접근 방식은 다양한 장치와 기계가 필요하기 때문에 초보자에게는 어렵습니다. 일부 다른 단계는 배우기 어렵기 때문에 다른 방법으로 변조를 시작하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 얼어붙은 표본을 파쇄하고 복제하는 것: 이 절차를 시작하려면 마우스 뇌의 관상 블록을 진동 슬라이서 홀더에 붙입니다. 신피질이 진동하는 칼날을 향하도록 조직 블록의 방향을 지정합니다. 다음으로, 편도체를 포함하는 코로나 단면을 140마이크로미터 두께로 영점 1대구치, 얼음처럼 차가운 PB로 자릅니다. 그리고 같은 완충액에 있는 6웰 접시에 모으십시오.

실체 현미경으로 실리콘 엘라스토머로 코팅되고 영점 1몰 PB로 채워진 페트리 접시에서 슬라이스에서 관심 영역을 잘라냅니다. 그런 다음 트리밍된 블록을 극저온 보호 용액에 옮기고 섭씨 6도에서 밤새 유지합니다. 이 단계에서는 구리 캐리어를 FRIL 절차의 연속 단계에서 사용할 수 있도록 준비하며, 변색 제거제로 샤미 스킨 시트로 연마합니다. 현미경 아래에서 양면 테이프 링을 구리 캐리어에 부착하면 트리밍된 블록의 고정 웰 역할을 합니다.

그런 다음 백금 와이어 루프를 사용하여 트리밍된 블록을 양면 테이프의 구멍에 놓습니다. 여과지나 브러시를 사용하여 과도한 동결 보호 용액을 제거합니다. 그런 다음 다른 캐리어로 보관 캐리어를 덮으십시오.

따라서 조직 블록이 두 캐리어 사이에 끼워집니다. 시편을 동결하려면 캐리어 샌드위치를 시편 홀더에 삽입하십시오. 그런 다음 시편 홀더를 고압 냉동 장치에 삽입합니다.

제트 자동 버튼을 눌러 동결 과정을 시작하고 즉시 시편 홀더를 제거한 다음 팁을 액체 질소가 든 절연 상자에 담그십시오. 그런 다음 표본 홀더에서 캐리어 샌드위치를 조심스럽게 제거하고 미리 냉각된 냉동 용기에 넣습니다. 복제될 때까지 carriers를 포함하는 cryovials를 cryotank에 보관하십시오.

전자빔 건을 삽입하기 전에 디플렉터 플레이트가 있는 실드를 제거하십시오. 필라멘트를 중앙에 배치하기 위한 설정 게이지를 하단 음극 덮개를 통해 콜릿 척에 놓습니다. 그런 다음 압력 층이 필라멘트의 끝을 고정할 때까지 새 필라멘트를 게이지 위로 밉니다.

그런 다음 설정 게이지를 제거하고 카본 로드를 삽입합니다. 증발기 로드 홀더의 콜릿 척을 조여 고정하십시오. 막대 끝의 높이가 바닥에서 두 번째 코일의 중간에 있는지 확인합니다.

그런 다음 디플렉터 플레이트를 교체하고 전자빔 건을 동결 파괴 장치에 삽입합니다. 이 절차에서는 증발을 위해 전류와 전압을 조정합니다. 다음으로, 냉동 캐리어 샌드위치를 액체 질소의 이중 복제 테이블에 삽입합니다.

그런 다음 이중 복제 테이블을 듀어 용기로 옮기고 45도 각도로 표본 스테이지 수신기에 고정합니다. 테이블 조작기로 이중 복제본 테이블을 선택합니다. 동결 파괴 장치에 콜드 스테이지에 삽입하고 이중 복제 테이블의 온도가 섭씨 영하 115도로 조정될 때까지 약 20분 동안 기다립니다.

그 후, 이중 복제 테이블 위의 슈라우드에 연결된 휠을 수동으로 시계 반대 방향으로 돌려 조직을 골절합니다. 슈라우드가 회전하면 이중 복제 테이블이 강제로 열리게 되어 조직이 파괴됩니다. 90도 각도의 탄소 층이 파괴된 면에 적용됩니다.

그런 다음 이중 복제 테이블에서 복제된 표본을 제거하고 TBS로 채워진 세라믹 12웰 플레이트로 옮깁니다.백금 루프 선재를 사용하여 표본 캐리어에서 복제된 조직을 제거합니다. SDS 분해를 위해 1ml의 SDS 분해 버퍼로 채워진 4ml 유리 바이알에 복제본을 옮깁니다.

섭씨 80도에서 18시간 동안 흔들면서 소화시킵니다. 면역 라벨링을 위해 새로운 SDS 소화 버퍼에서 복제품을 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 2% BSA-TBS로 희석된 1차 및 2차 항체와 함께 섭씨 15도의 습한 챔버에서 24-72시간 동안 배양합니다.

그런 다음 형태가 코팅된 100라인 평행 막대 그리드에 복제본을 장착합니다. 투과 전자 현미경으로 80 또는 100 킬로 볼트에서 복제품을 이미지화합니다. 그런 다음 CCD 카메라를 통해 디지털 이미지를 획득합니다.

오프라인 상태일 때는 다른 랜드마크를 사용하여 복제본에서 이미지의 해당 영역을 찾습니다. AAV 주입 4주 후, 후방 시상 핵 그룹에서 Channelrhodopsin-2를 발현하기 위해 Channelrhodopsin-2는 시상 축삭을 따라 전행성으로 효과적으로 운반되어 편도체 삽입 세포 덩어리에 도달합니다. 글루타메이터성 시냅스의 시냅스후 전문화는 복제품에서 원형질막의 E-면에 있는 막내 입자의 클러스터로 인식될 수 있으며, 종종 시냅스전 요소의 P-면이 동반됩니다.

여기서, Channelrhodopsin-2 및 글루타메이트 수용체는 2차 항체에 접합된 다양한 크기의 금 입자를 사용하여 시각화되었습니다. 동일한 복제본에서 시냅스후 막이 삽입된 뉴런에 속하는지 여부를 감지할 수 있는 구조적 또는 분자적 도구가 부족하기 때문입니다. 해당 복제본은 이러한 뉴런에 대한 마커인 mu opioid receptors에 대해 라벨링되었습니다.

이러한 시냅스에서 글루타메이트 수용체 밀도의 정량적 분석의 예로, 다음은 가시 및 수상돌기의 시냅스 영역과 비교하여 암파 수용체에 대한 금 입자 수에 대한 산점도입니다. 이는 두 구조에서 양의 상관 관계를 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 개별 단계가 매우 상호 의존적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 단계 중 하나에서 실수가 발생하면 전체 절차가 위태로워질 수 있습니다. 복제본의 2차원 표면에서 원형질막 전문화의 많은 부분을 보면 연속적인 절지체 절편을 힘들고 시간이 많이 걸리는 재구성 없이 관심 분자의 공간 분포 및 물리적 연속성을 검사할 수 있습니다. 이 접근 방식은 다른 연구자가 신경 회로에서 특정 시냅스의 구조-기능 관계에 대한 통찰력을 얻는 데 사용할 수 있습니다.

그것이 풀리는 곳, 입력의 기원과 시냅스 후 요소의 본질. 중요하지만 문제가 있습니다.