Name: Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 배우세요 마우스 편도체 시냅스에서 옵토제네틱스와 동결 골절 복제 면역표지법을 결합하여 이온성 글루타메이트 수용체 밀도를 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 특정 신경 회로의 구조-기능 관계 연구에 활용됩니다.

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기금은 오스트리아 과학기금 FWF 보조금 번호 P-22969-B11이 F. Ferraguti에게, 자선단체인 Hertie 재단과 Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience에서, 그리고 DFG(CIN-Exc. 307)가 I. Ehrlich에게 제공했다.

<ol><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes%3A+practical+procedure%2C+interpretation+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li>
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<li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li>
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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

동결 골절 전자 현미경은 40 년 이상 미세 구조 연구의 주요 기술하고있다. 그러나, 막의 고분자 조성물을 연구하는 유효한 수단의 결여는 그 사용에 상당한 감소를 일으켰다. 최근 인해 immunogold 라벨 (1, 2), 즉 FRIL 기술에 의해 세포막 단백질을 표시하기위한 효과적인 방법의 개발이 동결 골절 전자 현미경의 주요 부활되고있다. FRIL 기술은 다른 immunogold 미세 방법에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 첫째, 단백질은 감도를 증가 항체에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 둘째, 복제의 2 차원 표면 등 시냅스 막으로서 세포막 전문, 큰 부분의 노출 세리의 힘들고 시간 소모적 재구성없이 관심 분자의 공간적 분포 및 물리적 연속성의 검사를 허용알 얇은 섹션. 셋째, 세포막의 양쪽 절반의 이용은 각각의 구성에 대해 표시 할 수 단백질의 수가 제공 적합한 항체를 사용할 수를 증가시킨다. 파쇄시 분할 멤브레인의 소수성 표면은 골절 표면에 잔류 된 단백질 도메인을 구축하고 그리고 탄소, 백금으로 코팅된다. 이것은 이러한 도메인의 항원에 대한 항체의 접근을 방지 할 수 있습니다. 복제의 P-얼굴 인스턴스의 원형질 공간 대향 만 에피토프 반면 단지 항체에 의해 결합 될 수있는 공간 exoplasmic 대향 에피토프 전자 표면에 항체가 검출 될 수있다 (도 2 참조). 한편, FRIL 기법은 특정 제한이 앓고. 골절이 무작위로 발생, 특정 세포 또는 구조를 대상으로 어려울 수 있습니다. 이것은 또한 FRA의 다른 확률이 주어진, 시냅스 컬렉션, 예를 들어 샘플링 바이어스로 이어질 수 있습니다다른 곡률 (샤프트 대 예를 들어, 등뼈)와 구조의 멤브레인을 따라 cturing. 또한, 상기 두면 중 한 막 단백질의 배치를 예측할 수있다. 따라서, P-E-얼굴이나 얼굴 단백질의 분포는 특별히 정량적 연구에 신중 될 세포와 세포 외 도메인에 대한 반응성 항체를 사용하여 검사한다. 유일한 형태 적 특징에 기초 할 때 마지막으로, 시냅스 축삭 단자로서 특정 구조의 복제본의 식별이 어려울 수있다. 그러나, 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 사용하거나 태그 세포막 단백질 또는 추가 도구 바이러스 벡터를 제공하여 채널의 전달은 골절 막의 식별을 용이하게한다. 예를 들어,이 연구는 시냅스 날 공개 μ-오피오이드 수용체의 편도 또는 라벨에 자신의 축삭의 efferents를 식별하기 위해 시상 신경 세포에 ChR2 - YFP의 전달을 이용했다ITC 뉴런의 mbranes. 성공적 FRIL 기술을 수행하기 위해 특별한주의가 조직 정착 관한주의해야한다. 강 조직을 고정 (&gt; 2 % 파라 포름 알데히드)를 교차 골절 고속 라벨링 감도의 감소를 초래할 수있다. 한편, 약한 고착 티슈 운반 제제 (예 : 부분 절단)을 어렵게 만든다. 이 트리밍 된 블록의 두께는 양면 테이프의 두께와 일치하는지 제어하는​​ 것도 중요하다. 시편의 두께는 테이프보다 낮은 경우, 조직의 표면은 두 개의 금속 담체의 표면에 부착 할 수있는, 따라서 고정 된 시편을 파단되지 않는다. 조직이 두꺼운 경우 두 구리 캐리어 샌드위치이 이루어질 때, 그것은 불가피 구조적 왜곡으로 압축 될 것이다. 시험편이 파단되는 온도 (이 프로토콜에서, -115 ° C)도 중요한 역할을복제의 구조. 높은 온도는 이전 또는 증발 동안 조직의 표면에 수증기 축합 생성물로의 더 높은 레이트를 생성 할 수있다. 낮은 온도 (&lt;-125 ° C) 골절 중 물질의 오프 분할의 위험을 증가시킬 수있다. 이 물질은 시료의 표면에 떨어지거나 연결된 숙박 할 수 있습니다. 재료의이 조각은 코팅 된 이미지에 어두운 반점을 생산 대조된다. 낮은 온도에서 파쇄도 특히 돌기 쪽이 작은 미세 구조물 간 골절의 주파수에 영향을 미칠 수있다. 복제의 제조에서 또 다른 중요한 단계는 세제 소화이다. 소화가 완료되지 않으면, 소화 조직은 TEM의 구조 분석을 교란 복제본에 어두운 패치 나타난다. 또한, 소화 조직 배경 라벨링 증가 비특이적으로 결합하는 항체 또는 트랩을 할 수있다. 세제 한편, 사용조직 소화의 자신의 2 차 및 3 차 구조를 변경 복제에 관련된 분자를 변성 수 있습니다. 따라서, 특정 항원 서서히 추가 세척 단계 SDS 농도를 희석 할 필요가있을 수도있다. immunolabeling 들어, 이차 항체에 접합 된 금 입자의 크기가 서로 다른 가능성이 동시에 검출 할 수 있지만, 단지 성적, 심지어 시냅스 특성화와 세포막의 특정 마이크로 도메인에 여러 단백질. 그러나, 입체 장해로 정량 연구는 일반적으로 단지 하나의 분자의 검출에 한정된다. 금 입자의 크기는 또한 라벨 효능에 영향을 미칠 수있다. FRIL에서 라벨의 해석 들어, 인해가요 복잡한 형태로 immunogold 입자는 항원 20-25 nm의 반경을 갖는 반구 내의 어딘가에 위치 할 수 있음을 명심해야한다일차 및 이차 항체 (26)에 의해 에드. 이론과 FRIL 및 관련 기술의 연습에 대한 자세한 내용은, 우리는 다른 방법 론적 기사 (27), (28)에 또한 독자를 참조하십시오. FRIL 기술은 최근 30. 또한, AMPA-RS에 대한 FRIL 기술의 검출 감도는 하나의 기능 AMPA 하나씩 immunogold 입자 높이로 추정 다양한 시냅스 인구 29에서 글루타메이트 수용체 지역화 고해상도 정량 분석에 사용 된 -R 채널 29. 따라서,이 방법은 정량화 및 중앙 시냅스에서 AMPA-RS 및 NMDA-R과의 시냅스 표현의 패턴을 분석하기 위해 전반적으로 매우 유용합니다. 여기, 우리는 PIN / MGN-ITC 시냅스에서의 적용 가능성, 공포 조건화 동안 미국의 정보를 중계 가능성이 중요한 사이트를 보여 주었다. AMPA 수용체 아 단위의 Glu의 고도로 보존 된 세포 외 아미노산 잔기에 대해 발생하는 항체를 사용하여A1-GluA4, 우리는 시냅스 막 전문 분야에 해당하는 IMP 클러스터 내에서 금 입자의 고른 분포를 발견했다. ITC의 등뼈에서 AMPA-RS의 밀도는 PIN / MGN 시상 구 심성의 대상이 축 시냅스에 비해 유의하게 높았다. 모두 척추와 샤프트 시냅스에서 AMPA-RS에 대한 표시와 시냅스 영역 사이에 양의 상관 관계는 다른 글루타메이트 성 시냅스 (25)에 공통 기능을 검출 하였다. PIN / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS의 밀도가 낮은 분산은 대뇌 피질의 시냅스 (25)에서 시상 efferents (7)에 의해 형성된 다른 시냅스와 유사하지만 서로 다른 균일 한 분포를 나타냅니다. 반대로, NMDA-RS의 밀도보다 변수이고 AMPA-RS는 상이한 규제 건의 척추 축 시냅스 차이가 없었다. 미래에, FRIL 기법의 재현성는 중심 시냅스 기저 고분자 조성물을 평가하는 것을 허용하지 않지만 (C)의 검출을 용이하게 할 수있다공포 학습 후 이온 성 글루타메이트 수용체의 숫자와 subsynaptic 분포 hanges, 이러한 입력의 사전 및 시냅스 속성의 전 생체 내 녹음을 보완. 입력의 기원과 시냅스 후 소자의 특성 및 조성 disentangling 것은 중요하지만, 문제가되는 결론적으로,이 방법은 많은 다른 신경 회로에 입력 특정 흥분성 시냅스의 구조 - 기능 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 연구자들에 의해 사용될 수있는 .

나노 미터 크기의 생체막의 기능적 구조의 정의는 투과 전자 현미경에 적합한 immunolabeling 기술 다수의 발달로 최근에는 도전되었다. 그러나, 이러한 기술은, 예를 들면 전후의 매립 immunogold을, 항원 및 / 또는 막 결합 단백질의 양적 제한 평가 불량한 검출 포함 중요한 제한들을 갖는다. 이러한 제한은 셀 다양성과 시냅스 이질성 높은 것을 특징으로하는 신경 조직의 미세 구조의 연구에 특히 중요해진다. 사전 및 시냅스 소자 차동 식 농축, 또는 수용체 전송기 및 이펙터 분자로서 시그널링 단백질의 상호 작용에 의해 결정 구조적 및 기능적 다양성이 이질성 결과. 직접 immunolabe에 대한 새로운 접근 방식세제 용해 동결 골절 복제 (FRIL)의 통합 또는 가교 막 단백질의 링은 원래 20 년전 1 후지모토에 의해 소개되었다. 이 원래의 방법이 있었다, 그러나 몇 가지 제한 사항, 즉, 같은 두뇌와 같은 복잡한 조직에서 개별적으로 매핑 된 셀 라벨 분자의 의미있는 상관 관계를 방해 복제의 심각한 분열. 약 10 년 전, Shigemoto와 카자는 점진적으로 기술이 향상되었습니다. 이것은 또한 크게 갭 접합 (3)의 연구, 특히 기술을 향상 콜로라도 주립 대학의 볼더 연구소, 과학자의 또 다른 그룹의 노력이 병행되었다. 동결 파쇄 프로토콜 및 시스템의 개선뿐만 아니라, (고압) 빠른 냉동의 도입은 지금 하이 연구자들은 상대적으로 큰 크기의 시험편의 단절 복제본을 생성 할 수 있도록한계와 강한 화학 고착에 의해 생성 된 유물없이 대부분의 세포 성분의 GH 품질​​의 이미지. FRIL 기술은 사전 및 시냅스의 평면도의 또 다른 장점으로, 이러한 뇌 복잡한 조직 내의 하나 이상의 매핑 학적에서 (동시에) 단백질 및 미세 침 흡인 세포 검사 식별 세포 동일계 식별에 고 정량의 큰 장점을 제공한다 하나의 복제 요소. 따라서, FRIL 기술은 많은 기술적 장애에도 불구하고, 특히 각각의 시냅스의 구조적 및 기능적 특성의 관계에 대해 매우 중대한 과학적 돌파구로 사용하는 가능성을 보유하고있다. 지난 몇 년 동안, 많은 정보는 분자 구성, 구조에 획득하고 있으며, 시냅스의 생리 기능; 아직 시냅스는 형태 학적 및 분자 매우 다양한 사전 및 시냅스 파에 따라 있습니다임대 뉴런 4. 시냅스 만 종류의 소수에 대한 구조 - 기능 연구가 지금까지 5-7 수행 하였다. 이는 사전 및 시냅스 요소의 특성에 대한 정확한 식별을 방지 기술적 제약에 대부분이었다. 미세 분석은 시냅스 전달의 강도와 소성에 큰 영향을 미치는 신경 전달 물질 수용체 6 별개의 시냅스 접촉에 걸쳐 모두 시냅스 크기와 내용면에서 시냅스 막 전문의 변동성에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 또한, 많은 연구 기관은 시냅스의 종류 발현 이온 성 글루타메이트 수용체의 수는 afferent- 및 목표 의존적 7-10으로 조절되는 것을 나타낸다. 여기에서, 방법은 정의와 시냅스 막 전문의 구조와 수용체의 조성 분석을 허용하는 개략되어D 시냅스 요소 및 기능. 이 방법은 channelrhodopsin2 (ChR2)와 같은 최근 개발 된 감광성 조류 단백질의 연접 식을 활용하고 FRIL 기술의 α 아미노 -3- 히드 록시 -5- 메틸 -4- isoxazolepropionic의 시냅스 발현의 패턴을 분석 산 (AMPA-RS) 및 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA-RS) 글루타메이트 수용체. 이는 편도 (ITC)의 인터 셀 대중의 신경 세포에 후방 시상 - 중간 geniculate 핵 (PIN / MGN)에서 발생하는 축색 돌기에 의해 형성된 시냅스에서 시연된다. ITC 뉴런은 기저 amygdaloid 복합 (BLA) (11), (12)을 둘러싼 클러스터 구성 작은 가시 GABA 성 세포이다. ITC 신경 세포가 BLA 주요 신경 세포에서 흥분성 입력을 수신하고 (CEA)를 중심 핵을 대상으로하는 것으로 알려져있다, 따라서 억제 게이트 역할을 정보에 대한 BLA와 CEA 12 ~ 15 사이에 흐른다. 최근에, 우리는 IT 시연BLA와 CEA의 메디 - 지느러미 클러스터에있는 C 뉴런은 두려움 파블로프 청각 공포 조건화 16시 학습에 수정 감각 시상 및 시간 대뇌 피질의 영역에서 직접 수렴 흥분성 입력을받을 수 있습니다. 공포의 조절은 뇌 메커니즘의 관점에서 연관 학습의 가장 좋은 이해 형태 중 하나입니다. 공포 에어컨, 초기 중립 조건 자극 (CS, 예를 들면, 톤)에서 CS-US 협회 초래하는 혐오 무조건 자극 (US, 예를 들면, 가벼운 발 충격)와 짝과 공포 응답 (17), (18)를 조절한다. 흥분성을 연사 및 미국을 대표하는 정보를 전달 시상 및 신피질 영역 모두에서 입력은 각각 편도 (LA)의 측면 핵의 피라미드 뉴런에 수렴 및 소성 (19)를 받아야하는 것으로 알려져 있었다. 우리의 이전 작품은 감각 입력 정보가​​ ITC의 신경 세포에 전달 병렬도 밝혀 <s&gt; 16입니다. 각각의 감각 입력의 기계적인 분자 분석을 향한 첫 번째 단계는 ITC의 신경 세포에 시냅스, 우리는 ChR2는 노란색 형광 단백질 (YFP) 태그로 표현하는 아데노 관련 바이러스 (AAV)을 사용했다. AAV는 PIN / MGN에 주입하고, 축삭 단자는 ChR2 - YFP의 발현에 의해 확인되었다. 우리는 PIN / MGN 엑손 단말기들에 의해 ITC 뉴런 형성 시냅스 시냅스 AMPA-RS와 NMDA-RS의 밀도를 평가하기 FRIL 기술에 의해 생성 된 양면을 사용했다.

<table><tbody><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>마우스용 다른 정위 프레임으로 교체 가능</td></tr><tr><td>Stereotactic frame 마우스 어댑터</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>마우스용 가스 마취 마스크</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>더 이상 사용할 수 없으며 품목 번호 51609M</td></tr><tr><td>로 대체됨압력 주입 장치, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, 미국</td><td>T25-2-900</td><td>기타 압력 주입 장치(예: Picospritzer)를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Kwik Fill 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperature Controler and heating pad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>수평 마이크로피펫 풀러 모델 P-1000</td><td>Sutter Instruments, 미국</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>수술 도구 살균기, 살균기 75</td><td>Melag, 독일</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP(혈청형 2/9)</td><td>Penn Vector Core, 미국</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린</td><td>로스, 독일</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 마취제, 이소푸란 CP(1ml/ml</td><td>) CP Pharma, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>방부제, 베타딘 (프로비돈 - 요오드)</td> <td>Purdure Products, 미국</td><td>BSOL32</td>는 <td>다른 소독제로 대체 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>진통제, Metacam Solution (5 mg / ml meloxicam)</td> <td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>는 다른 진통제로 대체 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Bepanthen 눈 연고</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>은 다른 눈 연고로 대체 할 수 있습니다</td>.</tr><tr><td>드릴 NM3000 (SNKG1341 및 SNIH1681)</td><td>Nouvag, 스위스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox 봉합사 바늘</td><td>미세 과학 도구, 독일</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>꼰 실크 봉합사</td><td>미세 과학 도구, 독일</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Tissue preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde EM grade</td><td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>포화 피크르산 용액</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H20</td><td>Merck Millipore, 독일</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-2H2O&nbsp;</td><td>Merck Millipore, 독일</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, 독일</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, 독일</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, 오스트리아</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure 초순수 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td></td>50131235</tr><tr><td>연동 펌프</td><td>ISMATEC, 독일</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>MACHEREY-NAGEL, 독일</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, 오스트리아</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안과 메스</td><td>Alcon Laboratories, 미국</td><td></td> 다른 <td>안과 메스로 대체 가능</td></tr><tr><td>관류 캐뉼라</td><td>Vieweg, 독일</td><td>F560088-1</td><td>은 다른 회사의 유사한 항목으로 대체될 수 있습니다</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>High-pressure&nbsp; 냉동</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>구리 캐리어</td><td>엔지니어링 오피스 M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Germany</td><td></td><td>는 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>샤모아 스킨</td><td>가정 용품점</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole punch, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>는 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 할 수 있습니다</td>.</tr><tr><td>변성 에탄올</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td>는 <td>다른 회사의 동일한 품목으로 대체 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth, Germany</td><td>9372.5</td><td>주의!</td></tr><tr><td>고압 냉동 기계 HPM 010</td><td>BalTec, CH; 이제 Leica Microsystems</td><td>HPM010</td>은 <td>더 이상 생산되지 않으며 LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Olympus, 일본</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr>로 대체됩니다.<tr><td>Cryo-vials</td><td>Roth, Germany</td><td>E309.1</td><td>은 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International, USA</td><td>5015-0001</td><td>은 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International, USA</td><td>5016-0001</td><td>은 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>액체 질소 저장 용기</td><td>Cryopal, France</td><td>GT38</td><td>다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>비이온 성 세제 (Lavocid)</td><td>Werner & Mertz Professional, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>동결 파괴 및 복제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten & Kettenbaum, 독일</td><td>SANDURET 2-K</td><td>는 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, 입자 크기 25-21 &micro;</td><td>JOKE 조이스틴 & Kettenbaum, 독일</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>동결 파괴 시스템 BAF 060</td><td>BalTec, CH; 현재 Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic 12 웰 플레이트</td><td>Gr&ouml; pel, Austria</td><td>14511</td><td>은 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>은 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>은 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck, Germany</td><td>1,064,041,000</td>은 <td>다른 회사의</td></tr> <tr><td>동일한 품목으로 교체 가능SDS, 나트륨 라 우릴 설페이트</td><td>Roth, 독일</td><td>5136.1</td><td>주의! ; &nbsp; 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, 독일</td><td>1,076,871,000</td>은 <td>다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>5429.3</td><td>은 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>Universal Hybridization Oven</td><td>Binder, Germany</td><td>7001-0050</td><td>은 다른 회사의 동일한 품목으로 교체 가능</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>은 다른 회사의 동일한 품목으로 교체할 수 있습니다</td></tr><tr>.<td>Anti-GFP Antibody Molecular</td><td>Probes, USA</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR 항체</td><td>Frontier Institute, 일본</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 항체, 클론 54.1</td><td>Merck Millipore, 독일</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>오피오이드 수용체-Mu (MOR) 항체</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM 염소 항기니피그, 5 nm; 2차 항체</td><td>BBInternational, 영국</td><td>EM. GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM 염소 항토끼, 15nm; 2차 항체</td><td>BBInternational, 영국</td><td>EM. GAR15</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티-토끼, 10nm, 2차 항체</td><td>AURION, 네덜란드</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>구리 그리드, 100 병렬 바</td><td>&nbsp; Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>는 다른 회사의 동일한 품목으로 교체할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. Pioloform Powder</td><td>&nbsp; Agar scientific, 영국</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>로스, 독일</td><td>3313.1</td><td>주의! ; &nbsp; 다른 회사의 동일한 항목으로 교체 할 수 있습니다</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>EM 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD 카메라</td><td>소프트 이미징 시스템, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, 이미징 소프트웨어</td><td>Soft Imaging Systems, 독일</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetic 및 동결 골절 복제 immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

동결 골절 전자 현미경은 40 년 이상 미세 구조 연구의 주요 기술하고있다. 그러나, 막의 고분자 조성물을 연구하는 유효한 수단의 결여는 그 사용에 상당한 감소를 일으켰다. 최근 immunogold 라벨링함으로써 세포막 단백질을 표시하기위한 효과적인 방법의 개발이 동결 골절 전자 현미경 덕분에 큰 부활되고있다. 이러한 방법 중 하나는 세제 용해 동결 골절 복제 Immunolabeling (FRIL)로 알려져있다. optogenetics와 FRIL 기술의 조합은 중앙 시냅스의 구조 및 기능적 특성의 상관 분석을 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 식별 및 태깅 channelrhodopsin 각각 식 특정 분자 표지로 사전 및 시냅스 후 뉴런 모두를 특성화 할 수있다. glutamat의 시냅스 막 전문의 독특한 외관ergic 정량화 이들 수용체의 intrasynaptic 분포를 분석하기 위해, 상기 시냅스 이온 성 글루타메이트 수용체의 라벨링시에 허용한다. 여기서 우리는 페어 복제 방법을 immunolabel하는 방법을 준비하는 데 필요한 절차를 단계별 설명을 제공합니다. 우리는 또한 잠재적 인 샘플링 편견과 관련된 특히 사람들을 FRIL 기술의주의 사항 및 제한 사항에 대해 설명합니다. optogenetics와 결합 할 때 FRIL 기술의 높은 재현성과 다양성은 뇌에서 확인 된 신경 세포의 미세 회로의 시냅스 전달의 다양한 측면의 특성에 대한 매우 강력한 접근 방식을 제공합니다. 여기서는 이러한 접근은 마우스 편도의 인터 세포 질량의 뉴런에서 흥분성 시냅스의 구조 - 기능 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용 된 방법의 예를 제공한다. 특히,이 확인 입력에서 이온 성 글루타메이트 수용체의 발현을 조사 하였다하거나시상 후방 intralaminar와 중간 geniculate 핵에서 iginated. 이 시냅스는 두려움 학습을위한 관련 감각 정보를 중계하고 공포 조건화에 플라스틱 변화를 겪는 것으로 나타났다.

FRIL 기술은 미생물 기원 (21) 즉, 세포막 통합 효과적으로 축삭을 따라 anterogradely 전송 채널 optogenetic 액추에이터 식으로 결합 될 때, 정의 된 서브 그룹에서 정량 AMPA-RS와 NMDA-RS의 시냅스 발현을 조사 할 수 있도록 시냅스의. 이 편도에 ITC 뉴런에 (예를 들어, PIN / MGN) 별개의 시상 핵에서 발생하는 축삭을 위해 여기에 표시됩니다. 이 접근법은 ITC 뉴런, 지금까지 상세한 해부학 분자 특성화 난치성이었다 셀 그룹 상 개별 감각 입력 시냅스의 분자 분석을 가능하게한다. 4 주 PIN / MGN에 rAAV-ChR2 - YFP의 정위 주사 후, ChR2 - YFP 양성 축색 돌기 밀도가 LA의 amygdalostriatal 전이 지역 (Astria) 및 내측 paracapsular의 I를 신경 지배<html> 편도선에 TC 클러스터는, 이전의 추적과 완벽하게 일치하는 패턴은 22, 16 연구. 우리는 또한 rAAV-ChR2-YFP-에서 동결 골절 복제의 축삭과 단자의 P-얼굴에 ChR2 - YFP에 대한 immunolabeling 강한 금을 감지 주입 된 마우스 (도 5a), 그러나 비 - 주입 된 쥐에서 복제된다. 복제에서 글루타메이트 시냅스의 시냅스 막 특성화 원형질막 2 (23)의 E-얼굴 intramembrane 입자 (하는 IMP)의 클러스터로서 관찰 될 수 있고, 종종 시냅스 전 혈장 막 (7)의 P-얼굴 수반 (그림 5B-C). PIN / MGN의 축삭 단자에 의해 형성 글루타메이트 성 시냅스의 시냅스 전문화를 식별 할 수 이러한 기능 (그림 5, 6). 우리는 NMDA-RS는 필수 NR1 서브 유닛에 대한 항체를 사용하여 검출 된 반면, 네 개의 서브 유닛 (GluA1-4)를 인식하는 항체와 AMPA-R을 표시. &quot;FO : 유지-together.within 페이지를 =&quot;ntent 1 &quot;은&gt;이 시냅스가 돌기 쪽 또는 ITC 뉴런의 축으로 만들어진 여부를 동일한 복제본에 감지 할 수있는 도구의 부족 때문에, 우리는 μ에 대한 대응 복제의 얼굴을 표지 ITC 뉴런이 수용체 (24)의 postsynaptically 높은 수준의 발현으로 -opioid 수용체. 이것은 최적의 고용 전략을 사용하여 두 개의 복제본 (도 5C-F 및도 6A-D)에서 동일한 시냅스 정보의 확인 요구 (도 4E) . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> 그림 5. Immunogold 입자에 의한 복제에 ChR2 - YFP 및 이온 성 글루타메이트 수용체의 검출. (A) 크로스 골절 축삭 터미널 (하늘색)과 ChR2 - YFP을 검출하는 15 나노 금 입자로 표지의 P-얼굴의 작은 부분. the 터미널 내에있는 경우의 O-F 수많은 시냅스 소포가 관찰 될 수있다 (SV). 원형질막에 한정되는 대부분의 immunolabeling의 특이성 주. ChR2에 대한 라벨링은 PIN / MGN에서 발생 등의 단말기를 식별합니다. 단말은 척추 비대칭 시냅스를 형성한다. 전자의 얼굴에 시냅스 막 전문화 (PSD)는 intramembrane 입자의 특성 클러스터를 보여줍니다 AMPA-R을 공개 5 나노 금 입자로 표지한다. (B) (15 나노 금 입자로 표지)를 ChR2 발현 축삭의 P-얼굴이 수상 돌기, 그들이 NMDA-R을 공개 5 나노 금 입자로 표지 두의 PSD를 보유 중 하나를 경계 표시됩니다. (CD)는 PIN / MGN-ITC 시냅스의 사전 및 시냅스 막의 반대면. (C) 상기 단말기의 P-얼굴 (15 nm의 금 입자로 표지) ChR2 표현 두 돌기 축, 그들 AMPA-RS (5 nm의 금 입자) 표지 두 개의 PSD를 포함하는 하나의 E-면 위에 연장된다. ( <strong&gt; D) 두 개의 수상 돌기의 대응 P-얼굴 μ-아편 유사 수용체 (10 나노 금 입자) 표지 할 것. (EF) 점선으로 설명하는 부분 확대도. 스케일 바 :. 500 nm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> PIN을 / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS에 대한 Immunoparticles은 시냅스 전문 (그림 5E) 내에서 균일 한 분포를 제안, 모든 IMP 클러스터를 통해 발견되었다. 유의하게 높은 (짝 t 테스트 페이지가 &lt;0.018) AMPA-R 라벨의 밀도는 PIN / MGN에서 관찰되었다 ITC의 등뼈에 시냅스 (715 ± 38 금 입자 / μm의 2, N = 32) ITC의 수상 돌기 위에 시냅스에 비해 (590 ± 44 금 입자 / ㎛의 2, N = 32). 전반적으로, PIN / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS의 밀도가 비교적 낮은 나타났다분산 (분산 계수, CV = 0.37) 균일 한 분포와 일치. PIN을 / MGN-ITC 시냅스에서 NMDA-RS에 대한 Immunoparticles은 종종 불균일 시냅스 IMP 클러스터 (그림 5B) 내에 분포 관찰되었다. NMDA-R 라벨의 밀도는 (짝 t 테스트 P = 0.39) PIN / MGN은 ITC의 등뼈에 시냅스 사이에 유사했다 (1070 ± 153 금 입자 / μm의 2, N = 8)과 ITC의 수상 돌기 (812 ± 183 금 입자 / μm의 2, N = 9). AMPA-RS에 대한 관찰 내용과는 달리, PIN / MGN-ITC 시냅스에서 NMDA-RS의 밀도 (CV는 = 0.54)이 높은 변수였다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> 확인 된 PIN / MGN-ITC 시냅스에서 그림 6. AMPA-RS 및 NMDA-R과 Immunolabeling. (AB)는 PIN / MGN-ITC의 사전 및 시냅스 막의 반대면단말기의 P-얼굴 ChR2을 표현하는 수지상 척추에 만들어진 시냅스는 (15 나노 금 입자로 표지) 및 수지상 척추 상에 PSD는 AMPA-RS (5 나노 금 입자) 표지 할 것. (CD)에 점선으로 설명하는 부분 확대도. 이 지역은 PSD의 더 잘 볼 수 있도록 약 45 ° 시계 반대 방향으로 회전하고있다. (E) ITC 등뼈와 돌기 시냅스 영역 대 AMPA-R 입자 수의 산점도. 두 구조에서 양의 상관 관계가 관찰되었다. (F) ITC 등뼈와 돌기 시냅스 NMDA 영역에 대해 R-입자 수의 산점도. 유의 한 양의 상관 관계 만 돌기 쪽이 검출되었다. 스케일 바 :. 500 nm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 때문에종종 부분적으로 시냅스 IMP 클러스터에 겹쳐 시냅스 세포막의 P-면, 우리는 시냅스의 30 %의 시냅스 영역을 추정 수 (등뼈는 : 영역을 0.032 ㎛의 제 2 범위의 의미 : 0.007 ㎛의 2 0.063로를 N = 8; 수상 돌기 : 0.047 μm의 2 범위 : 0.024 11 μm의 2 0.166로, N =). 이전 분석 telencephalic 글루타메이트 25 시냅스 이러한 유사한 범위에 있었다. 두 쪽과 수상 돌기에서, 각각의 시냅스에서 AMPA-R과 골드 immunoparticles의 수는 긍정적 인 시냅스 영역과의 상관 관계를 보였다 (스피어, 쪽 : R = 0.88, 수상 돌기 : R = 0.60, p &lt;0.0001) (그림 6E). 하지만 수상 돌기 (R = 0.21, P = 0.29) (그림 6 층에서 : 반대로, NMDA-R과 골드 immunoparticles의 수는 쪽 (R = 0.90, P &lt;0.002 스피어, 등뼈)의 시냅스 영역과 상관 관계가 밝혀졌다 ).

이 논문은 신경전달물질 수용체의 발현을 정량화하는 방법과 광유전학 도구의 바이러스 전달과 동결-파괴 복제 면역 표지 기술의 조합을 사용하여 식별된 시냅스 전후 요소로 시냅스에서 분석된 패턴을 설명합니다.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

광유전학을 동결 파쇄 복제 면역표지법(freeze-fracture replica immunolabeling)과 결합한 이 실험 절차의 목적은, 전시냅스와 후시냅스 요소가 확인된 생쥐 편도체 시냅스에서 이온성 글루타메이트 수용체의 밀도를 분석하는 것입니다. 동결 파쇄 복제 면역표지법의 높은 재현성과 다재다능함은 광유전학과 결합될 때 시냅스의 구조적 및 기능적 특성에 대한 상관 분석을 수행할 수 있는 매우 강력한 접근 방식을 제공합니다. 이 절차의 주요 장점은 전시냅스 및 후시냅스 요소의 평면적 시야 확보와 이러한 특수 미세 도메인 내 단백질의 정량적 분석이 가능하다는 점입니다.적분 막 단백질의 분포와 조직을 연구하기 위해 다양한 조직에 맞추어 서로 다른 기술을 적용할 수 있습니다. 일반적으로, 이러한 결합된 광유전학적 FRIL 접근 방식은 필요로 하는 장비와 기계의 종류가 매우 다양하기 때문에 초보자에게는 까다로울 수 있습니다. 일부 단계는 학습하기 어렵기 때문에, 서로 다른 방법으로 조절을 시작하는 것이 매우 중요합니다.동결 표본의 파쇄 및 복제와 같은 과정입니다. 이 절차를 시작하려면 마우스 뇌의 관상면 블록을 진동 슬라이서(vibro-slicer) 홀더에 접착합니다. 신피질(neo-cortex)이 진동하는 칼날을 향하도록 조직 블록의 방향을 잡습니다. 다음으로, 0.1 M의 얼음처럼 차가운 PB 내에서 편도체(amygdala)를 포함하는 관상면 절편을 140 µm 두께로 절단합니다. 그리고 동일한 완충액이 담긴 6-웰 디쉬에 이를 수집합니다.실리콘 엘라스토머가 코팅되고 0.1 M PB가 채워진 페트리 접시에서, 실체 현미경을 사용하여 슬라이스로부터 관심 영역을 절단합니다. 그런 다음, 절단된 블록을 동결 보호 용액으로 옮겨 6 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 이 단계에서, 변색 제거제인 샴미 가죽 시트로 구리 캐리어를 닦아 광택을 내어 이후 FRIL 절차 단계에서 사용할 수 있도록 준비합니다. 현미경 하에서 구리 캐리어에 양면테이프 링을 부착하며, 이는 절단된 블록을 고정하는 웰 역할을 하게 됩니다.그런 다음, 백금 루프를 사용하여 다듬어진 블록을 양면테이프의 구멍에 배치합니다. 여분의 동결 보호제 용액을 거름종이나 브러시를 사용하여 제거합니다. 그 후, 홀딩 캐리어를 다른 캐리어로 덮습니다.조직 블록이 두 개의 캐리어 사이에 끼워지도록 합니다. 시료를 동결시키려면 캐리어 샌드위치를 시료 홀더에 삽입하십시오. 이어서, 시료 홀더를 고압 동결 장치에 삽입하십시오.jet-auto 버튼을 눌러 급속 동결 사이클을 시작하고, 즉시 시료 홀더를 꺼내 액체 질소가 담긴 단열 박스에 팁을 담급니다. 그런 다음, 시료 홀더에서 캐리어 샌드위치를 조심스럽게 분리하여 미리 냉각된 크라이오바이알(cryovial)에 넣습니다. 캐리어가 담긴 크라이오바이알을 복제 단계 전까지 크라이오탱크(cryotank)에 보관하십시오.전자빔 건을 삽입하기 전에 편향판이 부착된 쉴드를 제거하십시오. 필라멘트 중심을 맞추기 위한 세팅 게이지를 하단 캐소드 커버를 통해 콜렛 척에 배치하십시오. 그다음, 압착 층이 필라멘트 끝단을 고정할 때까지 새 필라멘트를 게이지 위로 밀어 넣으십시오.그런 다음, 세팅 게이지를 제거하고 탄소봉을 삽입합니다. 증발봉 홀더의 콜렛 척을 조여 탄소봉을 고정합니다. 이때 봉 끝의 높이가 아래에서 두 번째 코일의 중앙에 오도록 합니다.그 후, 편향판을 교체하고 전자빔 총을 동결 파단 장치에 삽입합니다. 이 과정에서 증발을 위한 전류와 전압을 조절합니다. 다음으로, 동결된 캐리어 샌드위치를 액체 질소 속에 있는 이중 복제 테이블에 삽입합니다.그런 다음, 이중 복제 테이블을 듀어 용기로 옮기고, 이를 시편 스테이지 리시버에 45도 각도로 고정합니다. 테이블 매니퓰레이터를 사용하여 이중 복제 테이블을 집어 올립니다. 이를 동결 파단 장치의 콜드 스테이지에 삽입하고, 이중 복제 테이블의 온도가 -115 °C로 조절될 때까지 약 20분 동안 기다립니다.그 후, 이중 복제 테이블(double-replica table) 위의 슈라우드(shroud)에 연결된 휠을 수동으로 시계 반대 방향으로 회전시켜 조직을 파쇄합니다. 슈라우드가 회전하면 이중 복제 테이블이 강제로 열리며, 이로 인해 조직이 파쇄됩니다. 파쇄된 면에 90도 각도로 카본 층을 코팅합니다.그 다음, 이중 복제 테이블에서 복제된 시료를 제거하고, TBS가 채워진 세라믹 12-well 플레이트로 옮깁니다. 백금 루프 와이어 로드를 사용하여 시료 캐리어에서 복제된 조직을 제거합니다. SDS 소화를 위해, 복제물을 1 mL의 SDS-digestion buffer가 채워진 4 mL 유리 바이알로 옮깁니다.흔들어주며 80 °C에서 18시간 동안 소화시킵니다. 면역표지를 위해, 신선한 SDS 소화 버퍼로 레플리카를 10분 동안 세척합니다. 그 후, 2% BSA-TBS로 희석한 1차 및 2차 항체와 함께 습윤 챔버 내 15 °C에서 24~72시간 동안 배양합니다.그 후, 레플리카를 폼-포(form-far) 코팅된 100-라인 평행 바 그리드(parallel bar grid) 위에 마운트합니다. 투과전자현미경을 사용하여 80 또는 100 kilo-volts에서 레플리카의 이미지를 촬영합니다. 그런 다음, CCD 카메라를 통해 디지털 이미지를 획득합니다.오프라인 상태일 때는 서로 다른 랜드마크를 사용하여 레플리카의 이미지에서 해당 영역을 찾습니다. AAV 주입 4주 후, 후시상핵군에 Channelrhodopsin-2를 발현시키면, Channelrhodopsin-2가 시상 축삭을 따라 전방으로 효과적으로 운반되어 편도체 개재세포 집단에 도달합니다. 글루타메이트성 시냅스의 시냅스 후 특수화는 레플리카 상에서 세포막의 E-face에 있는 막내 입자 군집으로 인식할 수 있으며, 종종 시냅스 전 요소의 P-face가 동반됩니다.본 실험에서는 서로 다른 크기의 금 입자가 결합된 2차 항체를 사용하여 Channelrhodopsin-2와 글루타메이트 수용체를 시각화하였습니다. 동일한 레플리카 상에서 시냅스 후 막이 삽입 뉴런(intercalated neurons)에 속하는지 여부를 감지할 수 있는 구조적 또는 분자적 도구가 부족했기 때문에, 해당 레플리카를 이 뉴런들의 마커인 mu 오피오이드 수용체로 라벨링하였습니다.이러한 시냅스에서 글루탐산 수용체 밀도의 정량 분석 예시로, 가시와 수지상 돌기 내 시냅스 면적에 따른 AMPA 수용체의 금 입자 수 산점도를 제시합니다. 이는 두 구조 모두에서 양의 상관관계가 있음을 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때는 개별 단계들이 서로 밀접하게 연관되어 있음을 기억하는 것이 중요합니다.따라서, 단계 중 하나에서 발생한 실수는 전체 과정에 지장을 줄 수 있습니다. 복제본의 2차원 표면에서 형질막 특수화의 넓은 영역을 관찰하면, 힘들고 시간이 많이 소요되는 연속 절편 재구성 과정 없이도 관심 분자들의 공간적 분포와 물리적 연속성을 검사할 수 있습니다. 이 접근법은 다른 연구자들이 신경 회로 내 특정 시냅스의 구조-기능 관계에 대한 통찰을 얻는 데 활용될 수 있습니다.입력의 기원과 포스트시냅스 요소의 성격을 규명하는 것이 매우 중요하지만, 이는 까다로운 문제입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 생쥐의 급성 편도체 뇌 절편을 사용하여 내측 전전두엽 피질(mPFC)과 편도체 뉴런 사이의 시냅스 연결성을 분석하는 절차를 보여줍니다. 이 마우스의 mPFC 뉴런은 형광 단백질에 융합된 채널로돕신을 발현합니다. 채널로돕신은 광 활성화 시 mPFC 뉴런에서 이온 유입 및 활동 전위 생성을 촉진합니다. 결과적으로, mPFC 뉴런은 시냅스후 편도체 뉴런에 결합하는 신경전달물질을 방출하여 mPFC-편도체 연결성을 시각화하기 위해 기록된 시냅스후 전류를 트리거합니다.

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice(편도체 뇌 절편에서 신경 경로의 시각화 및 매핑)

출처: Schönherr, S., et. al. 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특이적 배열을 조사하기 위해 광유전학 및 동결 파괴 복제 면역 라벨링을 결합했습니다. J. Vis. 특급. (2016)이 비디오는 전자 현미경을 위한 마우스 뇌 조직의 동결 파괴 복제본의 면역 라벨링을 보여줍니다. 파쇄되고 코팅된 복제품은 수용체를 노출시키기 위해 소화됩니다. 1차 및 골드 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 특정 신경세포막 수용체를 표지합니다. 복제본은 그리드에 장착되고 전자 현미경으로 시각화됩니다.

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

Optogenetic 방법이 널리 신경 활동을 조작하고 뇌 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 사용된다. 여기서, 기술은 광학 활성 Channelrhodopsin의 생체 내 발현에 두려움 관련 회로의 특정 장거리 및 지역 신경 연결의 시냅스 속성의 생체 분석을 위해 수 있다는 설명이다.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

이 프로토콜은 인공 예측에 관한 중재 RNA 간섭 그대로 신경 회로 내에서 선택적 gene(s)의 감소 식이 구체적으로 연 접 boutons를 자극 하는 optogenetics와 결합 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 합니다.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

이 작품은 optogenetic 단일-단위 맞춤 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 안정적으로 녹화를 수행 하는 방법을 소개 합니다.

깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

우리는 성인 마우스에서 급성 조각에 단일 코르티코스트 리아 탈 글루타마티터지시냅스에서 글루타메이트 방출과 클리어런스 사이의 균형을 평가하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 글루타메이트 검출을 위해 형광 센서 iGluu, 신호 수집을 위한 sCMOS 카메라 및 초점 레이저 조명장치를 사용합니다.

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

생체 내 미세 엔도스코픽 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 실시간으로 모니터링 할 수있는 귀중한 도구입니다. 그러나, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 어려웠습니다. 이 프로토콜은 마우스에 있는 소형화된 현미경으로 편도체 세포를 성공적으로 표적으로 하기 위한 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.

자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에 있는 머리 산 소형 현미경을 가진 성공적인 생체 내 칼슘 화상 진찰

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

배우세요 마우스 편도체 시냅스에서 옵토제네틱스와 동결 골절 복제 면역표지법을 결합하여 이온성 글루타메이트 수용체 밀도를 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 특정 신경 회로의 구조-기능 관계 연구에 활용됩니다.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

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