결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링
2016년 4월 6일
비소세포폐암(NSCLC) 표적 치료에 대한 민감도를 연구하기 위해 생물학적 콜라겐 골격을 기반으로 하는 3차원(3D) 폐암 모델을 제시합니다. 우리는 증식 지수, 세포사멸 및 상피-중간엽 전이(EMT) 상태를 결정하기 위해 다양한 판독 기술을 보여줍니다. 수집된 데이터는 약물 민감성 예측을 위해 인실리코(in silico) 모델에 통합됩니다.
이 결합된 In Vitro/In Silico Lung Cancer Model의 전반적인 목표는 비소세포폐암 표적 치료의 민감도를 연구하고 새로운 물질의 효능을 예측하는 것입니다. 이 3D 모델 시스템을 사용하면 표적 치료 또는 직접 조합에 대한 세포 특이적 반응을 모니터링할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 in Silico 예측을 통해 생리학적으로 보다 관련성이 높은 환경에서 전임상 약물 테스트를 용이하게 할 수 있다는 것입니다.
이 기술의 의미는 특정 돌연변이 배경을 기반으로 약물 반응 예측을 최적화하는 데 사용할 수 있기 때문에 다양한 종양 개체의 치료로 확장됩니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 조교인 Franziska Schmitt가 할 것입니다. 동적 배양을 설정하려면 기존 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 5%CO2의 세포 크라운에서 정적 배양 조건에서 종양 모델을 배양하는 것으로 시작합니다.
3일 후, 오토클레이브 생물반응기를 조립하고 파종된 생물학적 소장 점막하와 점막 골격을 시스템에 삽입합니다. 다음으로, 적절한 양의 FCS가 보충된 45ml의 RPMI를 플라스크에 추가하고 바늘이 없는 샘플링 장치를 Bioreactor와 배지 플라스크 사이의 튜브 시스템에 연결합니다. Bioreactor를 인큐베이터에 넣고 펌프에 연결하여 분당 3ml의 일정한 매체 흐름으로 추가로 14일 동안 종양 모델을 배양합니다.
기존 인큐베이터에서 배양 11일째에 정적 종양 모델을 Gefitinib으로 치료하려면 먼저 파스퇴르 피펫을 사용하여 웰에서 오래된 배지를 제거합니다. 그런 다음 FCS와 Gefitinib이 보충된 새로 준비된 RPMI 1ml를 각 세포 크라운 내부에 추가하고 각 웰 바닥에 1.5ml를 추가합니다. 동적 배양에서 Elisa의 샘플을 수집하려면 배양 11일에서 14일에 주사기를 샘플링 장치에 부착하고 Bioreactor 시스템에서 1ml의 배지를 제거합니다.
그런 다음 Elisa가 수행될 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. Ki67 양성 핵의 수를 측정하려면 먼저 도립 현미경을 사용하여 표본의 겹치지 않는 부분에서 각 조건의 20배 배율로 2D 배양물의 5개의 DAPI 및 5개의 Ki67 염색 형광 이미지를 얻습니다. Ki67 양성 핵을 수동으로 계산하려면 피지에서 출현 이미지를 열고 플러그인 및 세포 계수기를 선택한 다음 초기화를 클릭하고 계수 유형을 선택한 다음 각 Ki67 양성 핵을 클릭합니다.
클릭한 셀의 수가 선택한 카운터 유형 옆에 나타납니다. 2D 이미지에서 총 핵 수의 자동 세포 계수를 위해 매크로 레코더를 시작하고 DAPI 이미지를 연 다음 이미지, 유형 및 8비트를 클릭한 다음 대비 향상을 클릭하고 포화 매개변수를 1로 설정하고 정규화합니다. 이미지를 선명하게 하려면 반지름 1과 마스크 60을 사용하여 언샵 마스크를 설정합니다.
이미지를 바인더화하려면 자동 임계값을 클릭하고 검은색 배경에 흰색 개체가 있는 Reny/Entropy 방법을 선택합니다. 그런 다음 Plugins(플러그인)를 클릭한 다음 BioVoxxel을 클릭하고 침식 반경이 5인 유역 불규칙 피쳐를 클릭하여 세포를 분리합니다. analyze(분석)를 클릭하고 particle을 분석한 후 크기를 02 infinity로 설정하고 summarize를 선택합니다.
셀 수는 요약 테이블에 개수로 표시됩니다. 그런 다음 create를 클릭하여 추가 2D 세포 배양 이미지에서 핵의 자동 계수를 허용하도록 매크로를 저장합니다. 알려진 데이터베이스를 사용하여 종양 네트워크를 생성한 후 적절한 네트워크 분석 소프트웨어를 열고 파일 및 새로 만들기를 클릭한 다음 jove 종양 모델을 입력합니다.
ok를 클릭하여 새 네트워크를 생성한 다음 closeup North 및 ok를 클릭하여 이중 멤브레인의 수용체를 시각화합니다. 노드를 직사각형으로 시각화하려면 일반 단백질을 클릭한 다음 EGFR을 클릭한 다음 네트워크의 노드에 레이블을 지정 Ok.To 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 색상과 모양을 변경하고 표시된 대로 노드 색상 코드를 설정합니다. 판독 매개변수를 육각형으로 시각화하려면 표현형을 선택하고 proliferation을 입력한 다음 확인을 클릭합니다.
그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 색상 및 모양 변경을 다시 선택하여 색상 코드를 255, 204, 204로 설정합니다. 절점 상호 작용의 가장자리를 시각화하려면 활성화 화살표에 대해 상태 전이를 클릭하고, 둔화된 억제 화살표에 대해 억제를 클릭합니다. 그런 다음 file(파일)을 클릭하고 save as(다른 이름으로 저장)를 jove tumor models.xml로 저장합니다.
시스템 평형의 정상 상태 분석을 위해 SQUAD 소프트웨어를 열고 로드 네트워크를 클릭한 다음 jove tumor models. xml 파일을 업로드합니다. 클릭하여 분석을 실행합니다.
시뮬레이션 프로토콜을 작성하려면 advanced(고급) 및 pertubator(침투기)를 클릭한 다음 edit protocol(프로토콜 편집)을 클릭하여 anit-EGFR 저항성을 시뮬레이션합니다. 다음으로, 클릭하고 삽관을 클릭하고 표준 초기 상태가 정상 상태 4와 같도록 선택합니다. 추가를 클릭하여 새 상수 펄스를 추가한 다음 상태 매개변수를 선택하고 대상을 FLIP으로, 시간을 0으로, 값을 4로 설정합니다.
클릭, 확인 및 같은 방식으로 c-MET 및 Gefitinib에 대한 상태를 설정합니다. 상태 값을 활성 EGFR 노드로 설정하려면 활성 노드를 클릭한 다음 편집을 클릭합니다. 상태를 8로 설정하고 확인을 클릭합니다.
확인을 클릭하여 프로토콜을 저장합니다. 특정 곡선을 표시하려면 옵션 패널에서 EGF-EGFR, 스타 EGF-EGFR, 스타 Mek, 카스파제, PI3K, 게지티닙, 아폽토시스, 증식, MEk 억제제 및 PI3K 억제제를 선택합니다. 그런 다음 초기화 및 실행을 클릭하여 시스템 응답의 전체 시뮬레이션을 시작합니다.
PI3K 및 Mek 억제제 병용 치료를 시뮬레이션하려면 edit protocol을 클릭합니다. 다음으로, 방금 설명한 것과 동일한 노드 매개변수를 사용하여 pertubation을 클릭한 다음 add를 클릭하여 새 constant pulse를 추가합니다. 그런 다음 상태 매개변수를 선택하고 대상을 PI3K 억제제로, 시간을 0으로, 값을 1로 설정한 다음 확인을 클릭합니다.
추가를 다시 클릭하여 또 다른 새로운 상수 펄스를 추가하고 상태 매개변수 아래에서 대상을 Mek 억제제로 설정하고 시간을 0으로 설정하고 값을 1로 설정한 다음 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭하여 프로토콜을 저장합니다. 옵션 패널에서 방금 설명한 것과 동일한 그래픽 표현을 사용하여 initialize 및 run을 클릭하여 시스템 응답의 완전한 시뮬레이션을 시작합니다. 그런 다음 시뮬레이션을 완료하려면 재설정을 클릭합니다.
이 3D 종양 검사 시스템은 증식 지수의 결정을 용이하게 합니다. 그리고 M30 Elisa를 이용한 세포사멸의 정량화. 예를 들어, 이 대표적인 실험에서는 정적 배양 조건에서 배양된 EGFR 돌연변이 HCC827 종양 세포만이 표피 성장 인자 억제에 반응했습니다.
티로신-키나아제 억제제인 게피티닙(Gefitinib)에 의해, HCC827 종양 모델 시스템에서 관찰된 세포사멸(apoptosis)의 증가에 의해 명백히 드러납니다. 다음은 상피-중간엽 전이 유도제, TGF-beta-1 시뮬레이션을 유무에 관계없이 정적 3D 종양 모델의 대표적인 이미지입니다. 처리된 종양 세포 배양에서 비멘틴 발현의 증가에 주목하십시오.
동적 조건에서 Gefitinib은 EGFR 돌연변이가 발생한 HCC827 세포에 강력한 효과를 발휘하며, 티로신-키나아제 억제제가 있는 상태에서 처리되지 않은 대조 배양액에 비해 조직 유사 구조의 감소로 입증되었습니다. 이 그래프에서는 시간 경과에 따른 HCC827 세포의 알려진 돌연변이 구동, EGFR 및 c-MET 동시 활성화, 증식 속도 증가 및 세포사멸 속도 감소에 대한 시뮬레이션이 관찰되며, 이는 MEK 및 PI3K의 활성화와 상관관계가 있는 Gefitinib 유도 내성을 반영합니다. 실제로, PI3K 및 MEK 억제제의 결합을 모델링하면 항-EGFR 내성 효과가 역전되고 증식이 감소하며 세포사멸이 유도됩니다.
이 절차에 따라 웨스턴 블롯과 같은 다른 방법을 수행하거나 다운스트림 신호 경로를 조사하기 위해 수행할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 세포 유형을 가진 공동 배양 시스템을 사용하여 종양 미세 환경에서 다양한 세포 간의 혼선을 분석할 수도 있습니다. 이 기술은 약물 개발 분야의 연구자들이 인실리코(in Silico)의 약물 효능을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.
이 비디오를 시청한 후에는 신호 변화를 시뮬레이션하고 다양한 돌연변이 및 배경에서 결과 시스템 반응을 분석하여 계층화된 환자 그룹에서 약물 효능을 예측하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
본 연구는 비소세포폐암(NSCLC) 치료법의 민감도를 조사하기 위해 생물학적 콜라겐 스캐폴드를 활용한 3D 폐암 모델을 제시합니다. 이 모델은 약물 반응 예측 능력을 높이기 위해 in vitro 및 in silico 접근 방식을 통합하였습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 종양학
- 약리학
- 세포 생물학
배경
- 비소세포성 폐암은 폐암의 흔한 형태입니다.
- 표적 치료는 효과적인 치료를 위해 매우 중요합니다.
- 3D 모델은 약물 테스트를 위해 생리학적으로 더 적합한 환경을 제공합니다.
- in silico 모델은 종양 특성에 기반하여 약물 효능을 예측할 수 있습니다.
연구 목적
- 표적 치료제에 대한 NSCLC의 민감도를 평가하기 위함입니다.
- 새로운 치료 물질의 효능을 예측하기 위함입니다.
- 돌연변이 배경을 기반으로 약물 반응 예측을 최적화하기 위함입니다.
사용된 방법
- 콜라겐 스캐폴드를 이용한 3D 폐암 모델 구축.
- 치료제에 대한 세포 특이적 반응 모니터링.
- in silico 예측 결과와 실험 데이터의 통합.
- 종양 모델 설정을 위한 정적 배양 조건.
주요 결과
- 표적 치료제에 대한 NSCLC의 다양한 반응을 입증하였습니다.
- in vitro 결과와 in silico 예측 간의 상관관계를 확립하였습니다.
- 약물 테스트 프로토콜의 최적화에 대한 통찰력을 제공하였습니다.
- 다른 종양 유형에 대한 본 모델의 적용 가능성을 강조하였습니다.
결론
- 3D 폐암 모델은 약물 민감도를 연구하는 데 효과적입니다.
- in silico 예측은 전임상 시험의 관련성을 높여줍니다.
- 이 접근 방식은 다양한 암 유형에 맞게 조정되어 치료 결과를 개선하는 데 활용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업계 주요 관련성
이 결합된 3D in vitro/in silico 폐종양 모델은 변이 배경 특이적 약물 반응을 포착할 수 있는 생리학적으로 유의미한 전임상 시스템의 필요성을 충족합니다. 세포외 기질 구조와 계산 신호 네트워크 시뮬레이션을 통합함으로써, 이 접근법은 EGFR 변이 NSCLC의 타겟 검증 및 리드 물질 발굴에 대한 예측 신뢰도를 향상시킵니다. 본 모델은 표현형 출력(증식, 세포사멸, EMT)을 내성 기전의 in silico 시뮬레이션과 연결하여 기전적 리스크 감소를 지원하며, 이를 통해 초기 발굴 단계에서 보다 정보에 기반한 go/no-go 결정을 내릴 수 있게 합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 등유전적 세포주 쌍을 사용하여 EGFR 변이 NSCLC와 KRAS 변이 NSCLC 맥락에서의 치료 가설 조사를 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 정의된 ECM 조성을 가진 탈세포화 스캐폴드 상에 인공 종양 조직을 생성하기 위한 표준화된 14일 프로토콜을 제공합니다.
- 예측적 가치: 3D 배양 표현형을 임상 증식률과 상관시켜 2D 모델보다 중개 연구 관련성을 향상시킵니다.
스크리닝 및 어세이 개발
- 분석 준비도: Ki67 증식 지수, M30-ELISA 세포사멸 검출 및 vimentin/pan-cytokeratin 염색을 통한 EMT 평가를 포함한 정량적 판독을 지원합니다.
- 재현성: 3 mL/min의 유동-바이오리액터 관류를 사용하여 생리적 조건을 유지하고 조직 생성의 일관성을 향상시킵니다.
- 스크리닝 유용성: 돌연변이 배경(HCC827 EGFR-돌연변이 vs A549 KRAS-돌연변이)에 따라 층화된 티로신 키나아제 억제제(예: gefitinib) 민감도 평가가 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 돼지 소장 점막하층 지지체를 사용하여 조직 특이적 ECM 구조 및 기저막 특성을 재현함.
- 중개 연구의 연속성: 동적 약물 반응 데이터(apoptosis, proliferation, EMT)를 Boolean in silico 모델에 통합하여 내성 및 병용 중재 전략을 시뮬레이션함.
- 기전적 위험 감소: 시뮬레이션된 PI3K 및 MEK 공동 억제를 통해 gefitinib 내성의 역전을 입증함으로써 in vitro 표현형을 네트워크 수준의 적응과 연결함.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 모델은 리드 최적화 전 표적 치료제의 효능을 평가하기 위한 변이 층화 플랫폼을 제공함으로써, 발견 생물학(discovery biology)과 전임상 검증 사이의 가교 역할을 합니다.
- 발견 생물학: 특정 돌연변이 배경을 가진 NSCLC 모델에서 EGFR 의존성에 대한 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 정량적인 증식, 세포 사멸 및 표현형 전환 지표를 통해 분석 준비가 완료된 재현 가능한 3D 조직을 제공합니다.
- 분석: 신호 전달 네트워크 역동성 및 내성 진화를 시뮬레이션하는 계산 모델의 입력값으로 적합한 다중 파라미터 약물 반응 데이터를 생성합니다.
- 중개 연구: in vitro EMT 유도 및 약물 반응을 획득 내성에서 관찰되는 적응 경로 활성(예: MET, PI3K, MEK)의 in silico 시뮬레이션과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 특정 유전적 상황에서 약물 효능을 예측할 수 있는 재사용 가능한 프레임워크를 구축하며, 이는 다른 종양 유형 및 표적 제제에도 적용 가능합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 표현형 약물 반응을 네트워크 상태 변화의 in silico 예측과 상관시켜 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 탈세포화 지지체와 관류 배양을 사용하여 종양 모델 생성을 표준화함으로써 기관 간 재현성을 높입니다.
- 전략적 가치: 내성 기전을 예측하고 발견 초기 단계에서 합리적인 병용 전략을 식별함으로써 go/no-go 의사결정을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 바이오마커로 정의된 하위 집단에서의 예측 효능을 바탕으로 화합물의 위험 조정 우선순위 선정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 3D 조직 배양, 탈세포화 스캐폴드 처리 및 관류 바이오리액터 운용에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 정적 및 동적 배양을 위한 기구, Ki67/vimentin 염색을 위한 형광 현미경, 그리고 세포 사멸 정량을 위한 ELISA 플랫폼이 필요합니다.
- 통합적인 데이터 해석을 위해 세포 배양, 이미징 및 계산 생물학 팀 간의 교차 팀 표준화가 요구됩니다.
- 해당 모델을 돼지 스캐폴드 이외의 다른 종양 유형이나 ECM 소스로 확장할 때 적응 고려 사항이 수반됩니다.
- 14일의 배양 기간으로 제한되며, 예측 인 실리코(in silico) 모델링을 위해 정의된 돌연변이 배경에 의존합니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Dynamic Culture Conditions and Static Tumor Model Gefitinib Treatment
2:35
ELISA Samples Collection and Proliferation Index Determination
5:21
In Silico Tumor Model Generation and Anti-EGFR Therapy Simulation in HCC827 Cells
7:13
In Silico Simulation Using SQUAD
10:32
Results: The Effects of Gefitinib Treatment on Cell Growth in Static and Dynamic Tumor Model Systems
12:42
Conclusion
