Name: qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 학습하세요 qPCR을 활용한 비소세포폐암(NSCLC) 환자 혈장에서 엑소좀 분리 및 miRNA 분석 방법을. 효소 전처리를 통해 비엑소좀 miRNA를 제거하여 바이오마커 발굴의 정확성을 높이는 이 기법은 액체 생검 연구에 필수적입니다.

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이 연구는 2014년 MOCA(Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) 보조금의 지원을 받았습니다.

1. 엑소 좀 격리 참고 : 혈장 샘플에서 엑소 좀의 분리는, 제조 업체의 프로토콜에 따라 및 추가의 RNAse 처리에 의해, 상용 키트와 함께 수행 하였다 : (모든 단계는 생물학적 시료의 조작에 대한 구체적인 법적 절차에 따라 개인 및 환경 보호 장비와 함께 수행해야합니다 ). <ol><li> -80 ° C에 저장된 각 샘플의 플라즈마 1 ㎖를 타고, 얼음에 놓습니다. </li><li> RT에서 20 분 동안 2000 × g에서 샘플을 원심 분리기; 이 구절은 세포와 파편을 제거하기 위해 필수입니다. </li><li> 새로운 1.5 ML 튜브에 깨끗한 플라즈마를 포함 뜨는을 전송합니다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 10,000 × g에서 새 튜브를 원심 분리기. </li><li> 새로운 1.5 ML 튜브에 깨끗한 플라즈마를 포함 뜨는을 전송합니다. </li><li> 10 분에서 37 ° C에서 튜브를 뜨는에 RNAse가 100 ng를 / ㎖를 추가하고 배양순서는 RNA를 순환이 저하 될 수 있습니다. </li><li> 새로운 2 ML 튜브에 모든 플라즈마 처리를 전송하고 1X PBS의 0.5 볼륨을 추가합니다. </li><li> 용액을 혼합하기 위해 샘플을 소용돌이. </li><li> 샘플에 테 K 용액 (키트에 묶)의 0.05 볼륨을 추가합니다. </li><li> 소용돌이 샘플 후 10 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 샘플에 엑소 좀 침전 버퍼의 0.2 볼륨을 추가하고 반전하여 솔루션을 섞는다. </li><li> 30 분 동안 8 ° C에 2 ° C에서 샘플을 품어 후 실온에서 5 분간 10,000 × g에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 기음과 상층 액을 버린다. 펠렛은 고립 된 엑소 좀이 포함되어 있습니다. </li><li> 엑소 좀을 재현 탁하기 위해 엑소 좀 펠렛을 선택한 버퍼를 추가합니다. 버퍼의 선택은이 경우, 계획 하류 분석에 의존 <ol><li> TEM 분석을 수행하기 위해 1X PBS 100 ㎕를 추가한다. </li><li> 특정 용해 버피의 346.5 μl를 추가(상업 키트) RNA 추출 (: 화학 위험주의)에 대한 FER. </li><li> 단백질 추출 용해 완충액 100 ㎕를 추가 (트리스 -HCl 50 mM의 pH를 7.6 - 염화나트륨 300 mM의 - 트리톤 X-100 0.5 % - PMSF 1mM의 - 펩틴 / 아프로 티닌 10 μg의 / mL)로 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 위해서이다. (주의 : 화학적 유해성). </li></ol></li><li> -20 ° C에서 재현 탁 엑소 좀을 저장합니다. </li></ol> 웨스턴 블롯 분석 2. 엑소 좀 특성 참고 : 격리 nanovesicles을 특성화하기 위해,로 Alix와 TSG101 (잘 알려진 exosomal 마커)에 대한 항체와 웨스턴 블로 팅을 권장합니다. <ol><li> 용해 완충액의 엑소 좀 펠릿 재 부유 한 후, exosomal 막을 용해하기 위해 1 시간 동안 얼음에 배치. </li><li> 10 분 동안 12,000g에서 해물을 원심 분리기와 펠렛을 방해하지 않고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 총 exosomal 단백질 conten를 정량화브래드 포드 분석 또는 다른 방법으로 t 및로드 트리스 / 글리신 SDS가 잘되는 당 단백질의 50 μg의 - 8 % 폴리 아크릴 아미드 젤. (주의 : 화학적 유해성). </li><li> 화학적 유해성 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS)에서 1 시간 동안 120 V. 30 분 (주 버퍼 실행 8 % SDS-PAGE 겔 전기 영동에서 단백질 (적절한 분자량 마커)를 별개 ). </li><li> (: 화학적 유해성주의) 일정 50 V.에서 1 시간 동안 4 ° C 저온 전송 버퍼 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 20 % 메탄올)로 electroblotting에 의해 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송합니다. </li><li> 1 배 TBS -Tween 0.1 %에서 5 % 무 지방 건조 우유와 느린 교반 1 시간 동안 멤브레인을 차단합니다. </li><li> 트윈 0.1 % - 1 배 TBS 빠른 교반에 5 분 동안 막 4 회 반복한다. </li><li> 로 Alix 적절한 버퍼에 TSG101 (막 당 하나)에 대한 일차 항체를 추가 (이에 따라 제조업체의 항체 데이터 시트에)와 막 O / N 품다; 천천히 교반한다. </li><li> 과도한 항체를 제거하기 위해 트윈 0.1 % - 멤브레인에게 1 배 TBS 빠른 교반 5 분 동안 5 회 반복한다. </li><li> 적절한 버퍼 (이에 따라 제조업체의 항체 데이터 시트에) 적절한 이차 항체를 추가하고 천천히 교반 1 시간 동안 멤브레인을 품어. </li><li> 과도한 항체를 제거하기 위해 트윈 0.1 % - 멤브레인에게 1 배 TBS 빠른 교반 5 분 동안 5 회 반복한다. </li><li> 화학 발광 분석 (11)에 의해 선택된 단백질을 감지합니다. </li></ol> TEM 분석 3. 엑소 좀 특성 주 : 절연 엑소 좀을 시각화하기 위해서, TEM (투과 전자 현미경) 분석을 실시 하였다. <ol><li> 장소 ~ 10 μg의이 파라 필름에 1X PBS에 재현 탁 그대로 엑소 좀 샘플의 (이전 브래드 포드 분석에 의해 정량) 시료에 넣어 1 시간의 formvar 탄소 코팅 니켈 격자를 놓습니다. </li> &lt;리&gt; PBS 방울 1X 세 40 μL에 위치하여 그리드를 3 회 반복한다. </li><li> 오 30 μl의 초순수 방울에 위치하여 그리드 5 회 반복한다. </li><li> 10 분 동안 2.5 % 글루 타르 알데히드 (화학 위험주의) 한 방울을 첨가하여 샘플을 고정한다. </li><li> PBS 방울 1X 세 40 μL에 위치하여 그리드를 3 회 반복한다. </li><li> 2 % 우라 닐 아세테이트 한 방울 추가 (주의 : 화학 위험) 및 샘플을 대비하기 위해 15 분 동안 그 위에 격자를 넣어. </li><li> 0.13 % 메틸 셀룰로오스 방울에 샘플을 삽입 (주의 : 화학적 유해성) 및 0.4 % 우라 닐 아세테이트와 10 분 동안 방울 위에 그리드를 배양한다. </li><li> 부드럽게 흡수 종이로 액체 과잉을 제거하고 코팅 된면을 위로하여 5 분 동안 그리드를 건조. </li><li> 투과형 전자 현미경 (12)에 의한 격자를 조사한다. </li></ol> 4. Exosomal RNA 추출 및 정량 참고 : 우리는 PERF하기로 결정제조 업체의 프로토콜에 따라, 상용 키트를 사용하여 exosomal 샘플에서 총 RNA 추출을 ORM : (주의 : 화학 물질의 유해성, 제조 업체의 프로토콜과 가이드 라인을 검토합니다). <ol><li> 용해 버퍼의 346.5 μL의 엑소 좀 펠릿의 재 부유 한 후, β-머 캅토 에탄올 3.5 μl를 추가 적극적으로 (주의 화학적 유해성)와 소용돌이를; 이 구절은 지질 세포막을 파괴하기 위해 필수입니다. </li><li> 1 분 동안 11,000 × g에서 수집 튜브와 원심 분리기의 세정 탑에 해물을 추가합니다. 원심 분리 후, 열을 폐기하고 새로운 1.5 ml의의 RNase없는 튜브에 여과 액을 전송합니다. </li><li> 70 % 에탄올 350 μl를 추가 (주의 : 화학적 유해성)을 5 초 동안 볼 텍싱하여 혼합한다. </li><li> 8,000 × g에서 30 초 동안 해결 열 및 원심 분리기의 해물을 넣습니다. 원심 분리 후, 유체 통과를 버리고 새 컬렉션 튜브에 열을 전송합니다. </li><li> 탈염 buffe 350 μl를로드1 분 동안 11,000 × g에서 연구 및 원심 분리기. 원심 분리 후, 유체 통과를 무시하고 동일한 수집 튜브에 열을 반환합니다. </li><li> 컬럼의 실리카 막에의 DNase I 반응 혼합물 95 μL (재구성 DNase를 10 μL I는 각 샘플에 대해, DNase의 완충액 90 μl를 +)를 첨가하고 RT에서 15 분 동안 RT에서 배양한다. (주의 : 화학 위험) </li><li> 1 분 동안 11,000 × g에서 열 원심 분리기에 : (화학 위험주의) 세척 버퍼의 200 μl를 추가합니다. 새 컬렉션 튜브에 열을 놓습니다. </li><li> 1 분 동안 11,000 × g에서 열 원심 분리기로 세척 버퍼의 600 μl를 추가합니다. 원심 분리 후, 유체 통과 무시하고 동일한 수집 튜브에 열을 배치합니다. </li><li> 2 분 동안 11,000 × g에서 열 원심 분리기로 세척 버퍼의 250 μl를 추가합니다. 1.5 ml의 RNA 분해 효소가없는 튜브에 열을 놓습니다. </li><li> 11000에서의 RNA 분해 효소가없는 물을 40 μL의 RNA 원심을 용출<html> 5; 순서로 1 분 g이 작은 볼륨에서 높은 R​​NA 농도를 가지고 있습니다. </li><li> 즉시 -80 ° C에서 잠재력 저하 또는 저장을 방지하기 위해 얼음에 용출 RNA를 놓습니다. </li><li> RNA의 내용을 정량화. 주 : 여기에서, RNA 양자화는 분광 광도계를 통하여 시료 1 μl를 이용하여 수행 하였다. </li></ol> Exosomal의의 miRNAs의 5 Retrotrascription 주 : 엑소 좀의 miRNAs의 내용의 설명 수량 한정하기 위해서는 각 miRNA에 대한 개별 분석을 이용하여 시판 키트를 통해 선택의 miRNAs의 역전사를 수행하기로 결정 하였다 인해 제조사의 프로토콜에 따라. 각 샘플의 경우, 비소 세포 폐암의 상태에 상관 관계 (8)의 miRNAs는 (은 miR-30B를 선택 하였다은 miR-103;은 miR-122은 miR-195,은 miR-203은 miR-221,은 miR-222, 미르-1228-은 miR-30C를 3P) 내생 제어와 같은. <ol><li> 역전사 마스터 믹스 (RT 믹스)를 준비한다. 에 기재된 각 반응의 경우, RT 믹스 7 ㎕를 준비https://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx&quot;&gt;Table 1 (다운로드하려면 여기를 클릭) (주의 : 화학 위험). 주 :이 실험에서, 9 개의 다른 RT 혼합물은 각 시료를 준비 하였다. </li><li> 부드럽게 혼합하고 얼음에 RT 믹스를 저장합니다. 반응 관 당 RT 믹스의 7 μl를 추가합니다. </li><li> 반응 관 당 샘플 RNA (총 RNA의 10 μg의) 5 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 해당 반응 관에 설정 한 각 분석에서 (화학 위험주의)이 5 배 역전사 프라이머의 3 μl를 추가합니다. </li><li> 천천히 혼합 튜브를 닫고 5 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 열 사이 클러에 반응 튜브를 넣고 30 분 동안 16 ° C에서 다음 파라미터 값 (HOLD를 사용하여 역전사 반응을 개시 30 분 동안 42 ° C에서 캔슬 5 분 동안 85 ° C에서 HOLD 및 HOLD ∞ 4 기음). </li></ol> Exosomal의 miRNAs 6. 실시간 PCR 분석 참고 :이 분석했다샘플 당 세 생물학적 및 기술 복제와 실시간 PCR (qPCR에)에 대한 상용 키트를 사용하여 수행. <ol><li> 각 반응의 경우, 리얼 타임 PCR 믹스의 17.67 μL (PCR 마스터 믹스 + 뉴 클레아없는 물 7.67 μl를 10 μl를) 준비를 혼합하고 얼음에 넣어. (주의 : 화학 위험) </li><li> (: 화학 위험주의) 20 배 qPCR에 프라이머의 각 PCR 튜브에 대해, 1 μl를 추가합니다. </li><li> 각 웰 플레이트에 qPCR에 믹스의 18.67 μl를 놓습니다. </li><li> 상대 잘 플레이트로 역전사 제품의 1.33 μl를 추가합니다. </li><li> 판을 닫고 (300 GX 5 초) 스핀. </li><li> 리얼 타임 PCR 시스템의 플레이트를 삽입하고 다음 PCR 조건을 사용하여 실행을 시작 : 10 분 동안 95 ° C에서 HOLD; 95 ° C에서 15 초, 60 ° C에서 60 초 40주기. ΔΔct 13 - 처리는 식 2에 따라 데이터를 정상화. </li></ol>

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</ol>

모든 저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 조합 된 프로토콜로는 NSCLC 환자의 혈장에서의 miRNA exosomal 분석을 수행 할 수 있었다. 이러한 데이터는 질병 상태를 반영 할 수 있지만, 추가 연구에 의해 확인되어야한다. 이 문서에서 사용되는 프로토콜은 엑소 좀 격리를위한 상업 키트를 기반으로했다. 그 이유는 다른 공지 된 분리 절차 (예., 밀도 구배 초 원심 분리) 제한된 표준화 선도 이상의 수동 절차를 필요이었다. 그럼에도 불구하고,이 프로토콜의 제한 중 하나는 엑소 격리를위한 밀도 구배 초 원심 분리에 비하여, 밀도 구배 초 원심 분리는 (- 1.19 g / ㎖ 1.13 사이) 엑소 좀의 특정 밀도를 활용 엑소 분리에 매우 유용한 기술로 남아 있다는 것이다. 잠재적 인 수정이 분야에서 골드 표준이 될 수있는 두 절차의 혼합이다. 가능성은 임상 SAMPL를 처리하는의 RNase 처리와 ES는의 miRNAs 순환의 오염없이 우리에게 ...

NSCLC (비 소 세포 폐암) 환자에서 낮은 생존율 고급 질환 불량을 조기에 발견 치료 1의 제한된 효능에 주로 기인한다. NSCLC 환자의 개체군에서 발견 된 EGFR 유전자의 활성화 돌연변이, 키나제 억제제 (TKIs)를 티로신 민감성을 부여하는 것으로 알려져있다. 불행히도, EGFR 돌연변이 NSCLC 환자의 대부분은 TKI 저항이 개발. 특히 이러한 상황에서, 정확한 진단이 필수적이다. 때문에 종양의 현지화에, 일반적으로 비소 세포 폐암에서 생검 조직을 얻는 것이 항상 가능하지 않습니다. 따라서, 몇몇 연구는이 생체 데이터를 획득하는 비 침습적 방법을 사용하는 것을 계속한다. 엑소 좀은 비 침습적 방법 (3) 진단 및 예후 값을 얻기 위해 조사 할 수있는 액체 생검 컴포넌트로서 기술되어있다. 전자의 - ​​(100 나노 미터 직경 40) 엑소 좀은 nanovesicles 있습니다생리적, 병리 적 상태로 4 모두 다른 세포 유형으로 출시 ndocytic 기원. 그들은 단백질, 지질,의 mRNA 및 마이크로 RNA를 수행 할 수 있습니다. 또한, 몇몇 연구는 종양 세포, 혈관, 간질 및 세포 외 기질 리모델링 및 약제 내성 (5)의 성장과 생존에 영향을 미칠 수있는 종양 유래 엑소 좀의다면 발현 성 역할을 제안한다. 마이크로 RNA (miRNA가)는 대상의 mRNA의 3&#39;- UTR 결합 열화 또는 비 번역 (6) mRNA의 선두, 전사 후 조절에 관여하는 짧은 비 코딩 RNA이다. 엑소 좀에의 miRNAs의 선택적 정렬 설명 하였다. 이러한 맥락에서 최근 관내 및 생체 내에서, 커큐민 처리 후 7 만성 골수성 백혈병 세포주에 의해 방출 엑소 좀 미르-21 (종양 효과를 갖는 공지의 miRNA)의 선택적 포장 입증되었다. 그만큼exosomal miRNA의 프로필은 기본 종양의 miRNA의 프로파일과 유사하며이 기능은 조기 진단 및 예후 3에서 악용 될 수 있습니다. 구체적으로, 실시간 PCR에 의해 특성화 할 수있는 가능성이있는 질병의 분자 프로파일과 상관 선택의 miRNAs 등. 다른 8 중에서 EGFR 돌연변이. 여기서, NSCLC 상관의 miRNAs 8-9 선택된 패널 분석 NSCLC 환자의 혈액에 방출 엑소 좀으로부터 분리 된 것이 기재되어있다. (가) 환자의 동의 보고서를 통보받은 후, 12 비소 세포 폐암 환자 6 건강한 대조군의 플라즈마, 분석 하였다. 엑소 좀 분리는 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트 하였다. 엑소 좀을 분리하기 전에 혈장 샘플은 오염물의 miRNAs 순환을 저하시키기 위해, RNAse가 처리 하였다. 우리는 때문에 다른 TECHNI의 제한된 표준화에 상용 키트이 분석을 수행하기로 결정임상 샘플로 작업 할 때 특히 중요하다 QUES (예., 초 원심 분리). 이 키트는 RNAse가 저하하고, 따라서 엑소 좀 용해 후 exosomal의의 miRNAs을 저하 할 위험을 감소하는 테 K 처리를 포함한다. 마이크로 RNA 분석은 민감하고 특이 리얼 타임 PCR 분석에 의해 수행 하였다; 미르 1228-3p는 화학식 2에 따른 내인성 대조군으로 사용하고, 데이터는 정규화 된 - ΔΔct. 제어 값을 기준으로 사용되며, 그 결과를 대수 눈금으로 나타나있다.

<table><tbody><tr><td>총 엑소좀 분리 키트(혈장에서)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>4484450</td><td>사용 Proteinase K 처리</td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ALIX 항체 (3A9)</td><td>Cell Signaling</td><td>2171S</td><td></td></tr><tr><td>TSG-101 항체 (C-2)</td><td>SantaCruz Biotecnology</td><td>SC-7964&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 HRP 1 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>세포 신호 전달</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>RNAspin Illustra 미니 키트 50</td><td>GE HealthCare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA 역전사 키트</td><td>Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA 어세이</td><td>Life Technologies</td><td>002919</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30b TaqMan MicroRNA 어세이</td><td>Life Technologies</td><td>000602</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30c TaqMan MicroRNA 어세이</td><td>Life Technologies</td><td>000419</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-122 TaqMan MicroRNA 어세이</td><td>Life Technologies</td><td>002245</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-195 TaqMan MicroRNA 어세이</td><td>Life Technologies</td><td>000494</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-203 TaqMan MicroRNA 어세이</td><td>Life Technologies</td><td>000507</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-103 TaqMan MicroRNA 어세이</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>000439</tr><tr><td>has-miR-221 TaqMan MicroRNA 어세이</td><td>Life Technologies</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-222 TaqMan MicroRNA 어세이</td><td>Life Technologies</td><td>002276</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4440043</td><td></td> 없음</tr></tbody></table>

qpcr을 통해 비소 세포 폐암 (nsclc) 환자 &#39;플라즈마에 exosomal의 mirna 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

NSCLC에서 EGFR 및 ALK 유전자의 변형이 발견됨에 따라 선택적 티로신 키나아제 억제제(TKI)를 사용한 표적 약물 요법의 개발이 촉진되었습니다. 이러한 TKI의 사용을 최적화하려면 조기 발견 및 질병 진행을 위한 새로운 바이오마커의 발견이 필수입니다. 이러한 혈장 분리 엑소좀은 이러한 바이오마커의 검출 및 추적 관찰을 위한 비침습적이고 반복 가능한 방법으로 사용할 수 있습니다. 서로 다른 돌연변이와 치료법을 가진 12명의 NSCLC 환자(그리고 대조군으로 6명의 건강한 기증자)의 혈장 1ml를 엑소좀 공급원으로 사용했습니다. RNAse 처리 후, 순환하는 miRNA를 분해하기 위해 엑소좀을 상용 키트로 분리하고 추가 분석을 위해 특정 완충액에 재현탁시켰습니다. 엑소좀은 ALIX 및 TSG101에 대한 웨스턴 블롯팅(western blotting)과 이러한 나노소포의 생화학적 및 차원 데이터를 얻기 위한 표준 기술인 투과전자현미경(TEM) 분석을 통해 특성화되었습니다. 총 RNA 추출은 고수율 상용 키트로 수행되었습니다. 엑소좀의 miRNA 함량이 제한되어 있기 때문에 선택한 각 miRNA에 대해 개별 분석을 사용하여 역전사 PCR을 수행하기로 결정했습니다. NSCLC 질환과 상관관계가 있는 miRNA 패널(30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222)을 Real-Time PCR 분석의 놀라운 민감도와 특이성을 활용하여 분석했습니다. MIR-1228-3P는 내인성 대조군으로 사용하였으며, 데이터는 화학식 2-ΔΔct 13에 따라 처리하였다. 대조값은 기준선으로 사용되었으며 결과는 로그 척도로 표시됩니다.

비소 세포 폐암 환자의 12 플라즈마 및 6 건강한 대조군의 총 플라즈마에서 엑소 좀 격리를위한 상업 키트와 함께 처리했다. 각 샘플은 exosomal 마커로 Alix (96 kDa 이상) 및 TSG101 (43 kDa 이상)을 평가하기 위해서 웨스턴 블롯 분석에 의해 처리 하였다. 이러한 결과의 일례는 혈장 샘플로부터 엑소 절연이 가능한 프로토콜 인 것을 나타내는,도 1과 3의 샘플에 대해 도시된다. biophysically exosomal 샘플을 특성화하기 위해, TEM 분석을 수행 하였다. 100 나노 미터 (도 2) - TEM (40) 사이에,이 분리 프로토콜에 의해 얻어진 nanovesicles exosomal이 크기 범위의 평균 크기를 가지고 있음을 보여 주었다. <p class="...

이 프로토콜은 순환하는 miRNA 오염을 방지하고 NSCLC에서 miRNA의 바이오마커 기능을 평가하기 위해 Proteinase K 및 RNAse 처리와 함께 상용 엑소좀 분리 키트를 통해 NSCLC 환자의 혈장에서 방출되는 엑소좀에서 miRNA 프로파일링을 수행할 수 있는 가능성을 설명합니다.

qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 &#39;플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

이 절차의 전반적인 목표는 엑소좀 분리 전 이중 효소 처리를 통해, 유리 순환 micro RNAse와 같은 비-엑소좀 micro RNA 소스가 제거된 NSCLC 환자 혈장 내 엑소좀을 분리하는 것입니다. 이 방법은 micro RNA 지질 생검 분석을 엑소좀 구획으로 한정함으로써 바이오마커로서의 활용 가능성을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 분석을 방해할 수 있는 비-엑소좀 유래 micro RNA 소스를 제거하는 효소 전처리 과정에 있습니다.먼저 1 mL의 혈장 샘플을 얼음 위에서 해동합니다. 해동이 완료되면 튜브를 여러 번 뒤집어 형성되었을 수 있는 냉동침전물을 분산시킵니다. 그 후, 세포와 잔해물을 제거하기 위해 혈장을 실온에서 2,000 G로 20분 동안 원심분리합니다.상층액을 수집하고 혈장을 다시 10,000 G에서 20분 동안 원심분리합니다. 다시 혈장 상층액을 수집한 후, RNase 10 µL를 첨가합니다. 써모블록 히터에서 혈장을 37 °C로 10분 동안 배양합니다.유리 마이크로 RNA 분해효소를 분해하기 위해 표준 핵심 프로토콜에 RNase 처리 단계를 추가했습니다. 이후 RNA 분석물을 분해하고 엑소좀 마이크로 RNA 분해효소의 무결성을 보호하기 위해 핵심 프로토콜에 포함된 단백질 분해효소 핵심 처리 단계를 활용했습니다. 다음으로 혈장을 새 튜브로 옮기고 1x PBS를 부피의 절반만큼 추가한 후 볼텍싱합니다.그 다음 proteinase case 용액을 0.05 부피만큼 첨가하고 샘플을 다시 볼텍싱한 후 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 이제 exosome 침전 버퍼를 0.2 부피만큼 첨가하고 샘플을 뒤집어 섞어줍니다. 그 후 샘플을 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.저온 배양 후, 상온에서 10,000 G로 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 20에서 50 µL 분취하여 대조군용으로 보관합니다. 그런 다음 남은 상층액을 흡입하여 제거합니다.후속 분석에 따라 적절한 부피의 선택한 완충액으로 엑소좀 펠릿을 재현탁합니다. RNA 분석의 경우, RNA 추출을 위한 전용 용해 완충액을 첨가합니다. 시작 전, RNAse가 없는 환경을 보장하기 위해 적절한 시약으로 작업 영역과 관련 도구들을 세척하십시오.공급업체의 지침에 따라 역전사 마스터 믹스를 준비하십시오. 본 예시에서는 두 개의 샘플을 처리합니다. 각 샘플당 7 µL의 마스터 믹스 분주액을 9개씩 준비하며, 이는 선택한 각 micro RNA당 하나씩 해당합니다.반응 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 이제 총 RNA 농도가 10 µg인 엑소좀 RNA 용액 5 µL를 각 반응 튜브에 첨가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 샘플을 혼합하십시오.그 다음, 각 반응 튜브에 적절한 역전사 프라이머 3 µL를 첨가하고 피펫팅으로 샘플을 부드럽게 혼합합니다. 다음 단계로 진행하기 전, 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 이제 반응 튜브를 서멀 사이클러에 넣을 수 있습니다.공급업체의 요구 사항에 따라 반응 사이클을 실행합니다. 이 절차에서는 각 환자에 대해 모든 micro RNAse를 3회 반복 테스트해야 합니다. 여기에는 음성 대조군에 대한 3회 반복 실행이 포함됩니다.안정적으로 발현되는 순환 micro RNAse에 대한 합의된 기준이 없으므로, 데이터를 적절하게 표준화하기 위해 최소 하나 이상의 참조 micro RNA를 반드시 포함하십시오. 이전에 확보한 후보 micro RNAse를 참조로 사용할 수 있습니다. PCR 믹스 준비부터 시작하십시오.분석할 각 micro RNA에 대해 혼합물을 하나씩 만듭니다. 시약과 프라이머는 사용 전까지 빛이 차단된 얼음 위에 보관하십시오. 각 PCR 웰에 10 µL의 PCR 마스터 믹스를 분주할 수 있도록 준비합니다.nuclease free water 7.67 mL과 PCR 프라이머 1 µL를 사용하여, 플레이트에 채워야 할 웰 수보다 약간 더 넉넉한 양으로 부피를 늘려 준비합니다. 이제 준비된 혼합액 18.67 µL를 해당 플레이트 웰에 분주합니다. 그다음 각 웰의 최종 부피가 20 µL가 되도록, 적절한 역전사 반응 생성물 1.33 µL를 해당 플레이트 웰에 첨가합니다.음성 대조군 웰에는 1.33 µL의 물을 추가합니다. 이제 플레이트를 닫고 플레이트 회전기에 넣어 300 G에서 몇 초간 원심분리합니다. 템플릿의 실시간 PCR 소프트웨어를 사용하여 리포터를 지정하고, 표적 유전자를 할당하며, 반응 부피를 정의하고, 실험 웰을 설정합니다.이제 플레이트를 써모사이클러(thermocycler)에 넣고 공급업체의 사양에 따라 반응 파라미터를 설정하십시오. 런(run)이 완료되면 CT 값을 포함한 데이터를 분석을 위해 스프레드시트로 내보내십시오. NSCLC 환자의 혈장 샘플 12개와 건강한 대조군 6개를 위와 같은 방법으로 처리하였습니다.Western Blot을 통해 엑소좀 마커를 분석하였습니다. 엑소좀 관련 마커인 ALIX와 TSG101이 샘플에서 검출되었습니다. 샘플의 생물물리학적 특성을 분석하기 위해 TEM 분석을 수행하였습니다.40에서 100 nanometers 범위의 원형 소포가 발견되었습니다. 다양한 모델에서 NSCLC의 조절 장애가 보고된 8종의 micro RNA를 RTPCR을 이용하여 분석하였습니다. 내부 대조군인 mir 1228은 별도의 샘플 세트에서 안정적인 내인성 대조군임이 검증되었습니다.분석된 micro RNA들이 대조군과 비교하여 폐암 환자의 임상 시료에서 조절 장애가 나타남을 확인하였습니다. 본 프로토콜을 통해 분석에 방해가 될 수 있는 다른 구획을 배제하고, 혈장 시료로부터 엑소좀 관련 micro RNAse를 분석할 수 있습니다. 효소 처리 효율을 모니터링하기 위해 보관된 상층액 분액을 대조군으로 사용할 것을 권장합니다.액체 생검은 암, 특히 폐암에서 매우 중요한데, CTC나 유리 DNA(free DNA)와 같은 여러 성분들이 현재뿐만 아니라 환자의 추적 관찰을 위해서도 사용되기 때문입니다. 엑소좀(Exosomes)은 이러한 액체 생검의 새로운 성분으로, 중요한 다방면의 활성을 나타냅니다. 예를 들어, 그중 하나는 직접적인 내성 유도입니다.귀하의 실험실에서 엑소좀을 선택하고 특성화하는 방법을 배우기 위해 이 영상을 시청하시길 권장합니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

MicroRNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 조직 특이적이고 작은 비암호화 RNA이며 폐암의 조기 발견에 이상적인 후보가 될 수 있습니다. 주요 프로토콜에서는 조기 폐암 검진을 위해 환자의 혈액 샘플에서 microRNA를 분리할 것입니다.

miRNA 추출: 혈장 샘플에서 miRNA를 추출하는 방법

혈장 분리 엑소좀은 조기 발견 및 질병 진행을 위한 바이오마커의 검출 및 추적 관찰을 위한 비침습적이고 반복 가능한 방법으로 사용할 수 있습니다. 이 동영상은 비소세포폐암 환자의 혈장 샘플에서 엑소좀을 분리하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 DNA 및 단백질 추출에 사용될 수 있습니다.

엑소좀 분리: 비소세포폐암 환자의 혈장에서 엑소좀을 분리하는 기법

이 비디오는 유기 추출과 유리 섬유 컬럼 농축을 사용하여 대장암 환자의 혈장 샘플에서 순환 microRNA를 추출하는 방법을 설명합니다. miRNA는 혈청 및 혈장과 같은 생물학적 유체에서 안정적이므로 암 진단, 예후, 치료 의사 결정 및 모니터링을 위한 이상적인 순환 바이오마커입니다. 이 방법은 환자의 임상 결과를 예측할 수 있는 새로운 순환 바이오마커를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

순환 miRNA 추출: 유기 추출 및 Small RNA 농축을 통해 혈장 샘플에서 miRNA를 분리하는 방법

여기, 우리 조기 폐 암 발견에 대 한 순환 예측에 관한 서명 분류자 테스트를 수행 하는 시험 검사는 BioMILD에 채택 하는 상세한 프로토콜 제시.

예측에 관한 기반 액체 생 검: 플라즈마 미르 폐 암 검 진에 대 한 서명 분류자 (MSC)의 경험

순환 혈액에서 ribonucleic 산 (cRNA)의 임상 진단에 unmet 필요 이다. 여기 우리가 과민 하 고 특정 디지털 연쇄 반응을 사용 하 여 비 작은 세포 폐 암 환자에서 cRNA를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 테스트 72 시간 이내 퓨전 변종 감지 하 디자인 요구 사항을 충족.

혈액 기반 ROS1의 검출을 위한 테스트 및 RET Ribonucleic 산 디지털 연쇄 반응을 사용 하 여 순환에서 퓨전 성적표

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

질병 및 악성 세포에 대 한 엑 소 좀 유래 바이오 마커의 임상 번역은 신속 하 고 정확한 정량 방법의 결여에 의해 방해 된다. 이 보고서는 작은 부피의 혈 청 또는 혈장 샘플에서 특정 엑 소 좀을 정량화 하는 저 배율 어두운 영역 현미경 이미지의 사용을 설명 합니다.

종양 유래 엑 소 솜을 정량화 하는 나노 플라즈마-강화 된 산란 및 저 배율 현미경 이미징 사용

치료 저항은 수시로 향상된 전립선암을 가진 환자에서 발전하고, 어떤 경우에는, 암은 신경 내분비 전립선암에게 불린 치명적인 특수형으로 점진합니다. 이 전이를 촉진하는 작은 비 코딩 RNA 매개 분자 변경을 평가하면 신경 내분비 전립선암의 발달로 이어지는 인과 메커니즘의 더 나은 질병 계층화 및 식별이 가능합니다.

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

표시 셀 다중 광자 현미경을 통해 혀를 이내 구강 암 종양 침략의 양적 모니터링 마우스 모델을 생성에 관련된 기술의 포괄적인 개요는 제공됩니다. 이 시스템은 침입 방지 화합물의 분자 평가 및 약물 효능을위한 유용한 플랫폼이 될 수 있습니다.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

학습하세요 qPCR을 활용한 비소세포폐암(NSCLC) 환자 혈장에서 엑소좀 분리 및 miRNA 분석 방법을. 효소 전처리를 통해 비엑소좀 miRNA를 제거하여 바이오마커 발굴의 정확성을 높이는 이 기법은 액체 생검 연구에 필수적입니다.

qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 '플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구

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