개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

LAM을 위한 이 프로토콜의 전반적인 목표는 전사 분석을 위한 고순도 RNA를 생성하기 위해 특정 식물 세포를 분리하는 것입니다. 특히 유성 및 무성 생식 boechera 종의 난세포와 같이 접근하기 어려운 세포에 초점을 맞춥니다. 이 방법은 종자를 통한 식물의 유성 및 무성 생식의 기저가 되는 전사적 기초와 같은 식물 발달 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 특정 유형의 특수한 스타일을 수행할 수 있다는 것입니다. 이는 죽상경화증 조직 분석 시 희귀 세포 유형의 전사체가 가려지는 효과를 극복하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 블로킹 스테이션(blocking station)을 사용하여 56 °C로 가열된 신선한 플라스틱 평형 트레이에 녹인 파라핀 왁스를 채웁니다.

파라핀 배스의 뚜껑을 열고 카세트를 하나씩 꺼냅니다. 샘플을 밸런싱 트레이에 담긴 56 °C의 액체 파라핀 왁스로 옮깁니다. 카세트를 취급하는 동안 샘플 주변의 왁스가 굳지 않도록 빠르게 진행하십시오.

그 다음, 준비용 바늘을 사용하여 실험 설계에 따라 시료를 배치합니다. 모든 시료가 옮겨질 때까지 이 과정을 반복합니다. LAM을 위한 박절편을 준비하려면, 라이트 박스 위에서 플라스틱 트레이에 담긴 시료의 파라핀 왁스를 제거합니다.

RNase-free 면도날을 사용하여 꽃눈이나 꽃과 같은 샘플이 포함된 왁스 블록을 절단하여 분리합니다. 그다음, 스패튤라 끝에 파라핀 왁스를 소량 녹입니다. 그리고 뜨거운 왁스를 사용하여 샘플이 내장된 블록을 지지대에 고정합니다.

면도날을 사용하여 시료 주변의 불필요한 파라핀을 제거하고, 블록의 표면이 정사각형이며 모서리가 서로 평행한지 확인하십시오. 그다음, 가열판의 온도를 42°C로 설정하십시오. 시료를 마이크로톰에 안전하게 장착하십시오.

Boechera 성숙 배우체 세포를 위해 7 µm 두께의 절편을 준비합니다. 그 후, 10~15 cm 길이의 파라핀 리본을 바닥에 검은색 판지가 깔린 플라스틱 상자로 옮긴 다음 LAM 슬라이드 위에 배치합니다. LAM용 슬라이드를 준비하려면, 금속 프레임 슬라이드 5~10개를 평평한 면이 위로 향하게 하여 가열판 위에 놓습니다.

슬라이드의 플라스틱 부분에 RNase-free water 1~2 mL를 피펫으로 분주합니다. 면도날을 사용하여 파라핀 리본을 약 4~5 cm 길이의 짧은 조각으로 자릅니다. 이때 길이는 슬라이드의 플라스틱 윈도우를 가로지를 수 있을 정도여야 합니다.

그 다음, 핀셋과 준비용 바늘을 사용하여 파라핀 스트립을 슬라이드의 플라스틱 윈도우 위에 서로 평행하게 배치합니다. 슬라이드의 한쪽 끝을 조심스럽게 들어 올려 물을 제거한 후 다시 내려놓습니다. 슬라이드에 닿지 않도록 플라스틱 덮개로 가열판을 덮되, 플라스틱 덮개를 통해 공기가 교환될 수 있도록 합니다.

슬라이드를 42 °C에서 하룻밤 동안 건조합니다. 화학 흄후드 내에서 자일롤(xylol)을 사용하여 슬라이드의 왁스를 10분씩 두 번 제거합니다. 이때 슬라이드의 플라스틱 부분만 잠기게 하고, 나중에 꺼낼 수 있도록 각 슬라이드 금속 프레임의 넓은 끝부분은 건조한 상태로 유지하십시오.

LAM을 수행하기 전, 화학 흄후드 내에서 슬라이드를 10분 동안 건조하십시오. 이 절차에서는 LAM을 위해 컴퓨터와 현미경의 전원을 켭니다. 그다음 현미경과 레이저를 제어하는 프로그램을 실행하십시오.

레이저 제어 박스의 전원을 켜고 제어 박스에 있는 해당 버튼을 눌러 레이저를 켭니다. 그다음, 캡 홀더에 캡을 넣습니다. LAM 슬라이드를 현미경용 유리 슬라이드 위에 배치하고, 조직이 부착된 슬라이드의 평평한 면이 유리 슬라이드 쪽을 향하도록 합니다.

그런 다음, 유리 슬라이드를 아래에 둔 상태로 슬라이드를 기기에 배치하십시오. 마지막으로, 캡이 끼워진 캡 홀더를 기기에 배치하십시오. 4x 대물렌즈를 선택하십시오.

프로그램에서 캡을 위쪽 위치로 이동시킵니다. 그 후, 슬라이드를 스캔하십시오. 슬라이드를 탐색하여 관심 구조를 식별합니다.

절단 단계에서 정확한 위치로 돌아올 수 있도록 슬라이드 상의 위치를 정확히 찾아 저장하십시오. 그런 다음 적절한 대물렌즈를 선택하십시오. 레이저 조사 버튼을 한 번 눌러 레이저 위치를 확인하십시오.

이상적으로는 조직이 없는 막의 일부에서 수행합니다. 캡을 아래 방향으로 둔 상태에서, 핸드 펜 도구를 사용하여 관심 있는 세포 유형이나 조직의 경계를 표시합니다. 예를 들어, 난세포를 표시할 수 있습니다.

Cut 버튼을 눌러 레이저로 절단하십시오. 개별 세포를 분리하기 위해서는 적절한 단면에서 세포를 명확하게 식별하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 세포 유형 특이적 전사 분석을 가능하게 하려면 세포의 직경이 최소 8 µm 이상이어야 합니다.

세포 주변의 경계가 완전히 절단되지 않은 경우(일반적으로 화면에서 확인 가능) 섹셔닝을 반복해야 하므로 주의하시기 바랍니다. 이 경우, 표준 설정으로 소프트웨어가 해당 섹션을 자동으로 2회 반복 실행하도록 설정하는 것이 좋습니다. 그 후, 캡을 들어 올리고 관심 구조가 있는 다음 저장 위치로 이동하여, 한 슬라이드에서 원하는 모든 세포가 수집될 때까지 다음 세포 섹션을 절단하십시오.

새로운 섹션이 캡의 빈 위치에 부착되도록 캡의 위치를 조정하십시오. 모든 슬라이드에서 관심 있는 세포 유형의 분리가 완료되면, 기기에서 슬라이드를 제거하십시오. 캡 홀더를 아래쪽 위치로 내리고 캡 표면을 육안으로 확인하십시오.

4배 배율 대물렌즈를 사용하여 시료의 비특이적 오염 여부를 확인하고 제외하십시오. 그런 다음 캡을 닫으십시오. 이후 사용 시까지 동결 건조된 절편을 -80 °C에서 냉동 보관하십시오.

성숙한 암배유의 모식도입니다. 이는 boechera divaricarpa의 암배유를 포함하는 배주를 얇게 절편한 것으로, 암배유의 특징적인 형태 덕분에 난세포를 명확하게 식별할 수 있습니다. 대조군으로서 동일한 슬라이드에서 채취한 더 넓은 조직 영역과 비교했을 때, 난세포 절편에서도 유사한 수준의 RNA 품질이 얻어졌습니다.

확보된 RNA 품질은 세포 유형 특이적 RNA 시퀀싱에 적합하였으며, 이를 통해 무포자성 난세포에서는 발현되지만 무포자성 중앙세포, 조세포 또는 무포자성 초기 세포에서는 발현되지 않는 236개의 유전자를 식별하였습니다. 또한 arabidopsis thaliana의 성숙한 유성 배우체 세포에서도 발현되지 않았습니다. 발달 유전학의 추가적인 질문에 답하기 위해 다른 종의 다른 세포 및 조직 유형에 대해서도 프로파일링을 수행할 수 있습니다.

식물 종자의 배유와 배에서 각인된 분자적 기초와 같은 연구가 이에 해당합니다. 이 기술의 발전으로 발달 유전학 및 식물 번식 분야의 연구자들은 Boechera 속의 무성생식에 대한 전사적 기초를 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 영상을 시청하고 나면 레이저 보조 미세 절단술(laser-assisted micro-dissection)을 이용하여 세포 유형 특이적 전사 분석을 위한 고품질의 RNA를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.