Name: 개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 배우세요 레이저 보조 미세절단(LAM)을 이용하여 Boechera 종의 난세포와 같은 특정 식물 세포를 분리하고 고품질 RNA를 추출하는 방법을. 이 기술은 식물 생식의 전사적 기전 연구에 활용됩니다.

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Boechera divaricarpa 씨앗을 제공해 주신 Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben)님과 비평적 독해와 교정을 해주신 Sharon Kessler (오클라호마 대학교)님께 감사드립니다. UG 실험실에서 gametophyte 발달 및 apomixis를 연구하기 위한 세포 유형별 전사체 분석 작업은 취리히 대학교, "Deutsche Forschungsgemeinschaft" 펠로우십 및 Marie Curie 프로젝트 IDEAGENA to AS, COST action FA0903(UG 및 AS) 프레임워크 내 "Staatssekretariat für Bildung und Forschung"의 보조금 및 스위스 국립 재단(UG에 문의)의 지원을 받고 있습니다.

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<li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis+-+the+asexual+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li>
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<li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685(2012).</li>
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<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

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의정서는 다른 세포와 조직에 적합하다 사체와 함께 LAM은 마이크로 어레이 또는으로 분석 RNA-서열은 개발 또는 생리 학적 과정 7-11,13,14을 조절하는 유전자 활동의 특정 패턴에 대한 통찰력을 얻을 수있는 유용한 도구입니다. 그러나, 특정 세포 타입에 대해,이 방법의 적합성 구조적 문제에 비판적으로 의존한다. 셀은 명확하게 볼 수 있고 LAM에 사용되는 건조 섹션에서 명확하게 식별 할 필요가있다. Boechera의 divaricarpa에서 배우체의 형태는 계란 세포 (그림 2, 그림 3)의 쉽게 식별 할 수 있습니다. 결국, 특정 세포 집단의 분리 속도 또한 세포 유형 새로운 슬라이드를 슬라이드 교환 스캔으로 하나의 슬라이드에서 발견 될 수있는 주파수에 따라 시간이 걸리는 단계이다. 250 셀 분파 - 적어도 (200), 세포 유형에 해당 의존을 감안할 때이온이 샘플 당 ...

조직 수준에서 수행 전사 연구에서 매우 전문화하지만 희귀 세포 유형의 전 사체는 종종 더 풍부 주변 세포에 의해 마스크된다. 이러한 고도로 전문화 된 세포 유형에 대한 예는 식물에서 여성의 생식 계통 (생식 세포)의 세포이다. 여성 생식 계열은 꽃 1, 2의 gynoecium 내부 개발 난자 내 씨의 전구체를 지정합니다. megaspore 모 세포 (MMC)는 여성 생식계의 첫번째 셀이다. 그것은 감​​소 megaspores의 테트라을 형성하는 감수 분열을 거친다. syncytium에, 즉, 일반적으로 이러한 megaspores 중 하나만이 살아과 세포질 분열없이 mitotically 나눕니다. 세 antipodals 두 synergid 세포, 난자, 중앙 셀 : 유사 분열이 전형적으로는 네 종류의 세포로 구성된 성숙 배우체를 형성 cellularization 뒤 따른다. 계란과 중앙 세포는 DOU 동안 두 개의 정자 세포에 의해 수정 된 얻을 여성의 생식있다BLE 시비 현상 시드 1,2 배아 및 배유을 야기한다. 80 씨앗 밀접한 관련 속 Boechera에 꽃 당 개발 - 약 50 동안 성적 모델 시스템 애기 장대에서 만 ~ 50 씨앗은 꽃마다 개발한다. 따라서 암컷 생식선은 휴대 사양과 분화 발달 과정 등을 연구하는 우수한 모델을 만드는 몇 매우 특별한 종류의 세포로 구성된다. 또한, 식물의 재생을 지배하는 유전자 조절 과정에 대한 통찰력은 응용 가치가있을 수 있습니다. 식물, 씨앗 (무수정 생식)을 통해 모두 성적과 무성 생식가 발생할 수 있습니다. 유성 생식은 인구의 유전 적 다양성을 생성하는 동안, 어머니 공장에 유 전적으로 동일 클론 자손의 형성에 리드를 무수정 생식. 따라서, 무수정 생식은 복잡한 산모의 유전자형이 할 수있는, 농업과 종자 생산에 응용 프로그램에 대한 큰 잠재력을 가지고여러 세대 3,4,5를 통해 변경되지 않은 유지 될 수있다. 무수정 생식 자연스럽게 주요 작물에 발생하지 않기 때문에, 작물의 무수정 생식의 공학은 큰 관심의 3,4,5이다. 그러나, 이러한 장기 목표 무수정 생식의 근본적인 유전 및 분자 기초는 충분히 상세히 6에서 이해되지 않기 때문에 달성하기 어렵다. 레이저를 이용한 미세 절제 (LAM) 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 apomictic 재생, 세포 유형 특정 전사 프로파일 링을 지배하는 전사 기준에 대한 통찰력을 확보하는 것은 매우 강력한 방법 7,8를 나타냅니다. LAM 먼저 동물과 생물 의학 연구를 위해 설립되었습니다. 지난 몇 년 동안 LAM은 식물학 6,9,10 적용되었다. 개별적인 세포 및 조직 유형의 프로파일을 허용하는 다른 방법들과 대조적으로, LAM 마커 라인 6,9,10의 생성을 필요로하지 않는다. 따라서, 애플리케이션이 될 수있다이전 분자 지식없이 세포 또는 조직 유형에 거짓말. LAM의 또 다른 장점은 셀이 위치 및 / 또는 구조적 특성에 기초하여 건조 부에서 인식 될 수있는 것이 긴 어떠한 세포 유형에 적용 할 수 있다는 것이다. LAM은 처리 중에 전사 프로파일의 변화를 방지 고정 조직을 사용하는 추가적인 장점을 갖는다. 관심, 예를 들어, 꽃 조직의 조직은, 이전에 파라핀 왁스에 매립 비 가교 고정액에 고정되어있다. 파라핀 왁스에 포함 설립 프로토콜 9,11 다음, 수동으로 수행 할 수 있습니다. 그러나, 왁스의 침투와 탈수를위한 자동 조직 프로세서의 사용은 일반적으로 RNA 품질 및 조직 형태의 보전의 관점에서 높은 재현성을 초래한다. 수지 조직을 포함하는 대안의 전략은 성공적 LAM 8 세포 유형 특정한 분석을 위해 사용되어왔다. 그러나, 자동 게이트의 사용많은 샘플 일단 시간의 실질적인 최소 요구 처리 될 수있는 왁스 매립 ated 조직 프로세서는 시간이 매우 효과적이다. RNA의 질 전형적으로 상당한 손실이 고정 및 매립시 발생하는 동안, 마이크로톰 얇은 부분의 제조 및 특히는 LAM에 사용 frameslides에 장착하면 RNA 품질의 보존을위한 중요한 단계 남아있다. 이는 앞서 언급 한 내용 및 테이프 이송 시스템의 이용이 단계 (12)에서 더 RNA 품질 결과를 설명 하였다. 그러나,이 슬라이드의 제조시 추가의 시간 소모적 인 단계를 추가하고 또한 특별한 장치를 필요로한다. 설명 최적화 된 프로토콜은 재현성 GeneCHIPs 및 차세대 시퀀싱 (NGS)이 7,11,13,14 접근과 전사 프로파일에 충분한 품질의 RNA를 생성합니다. 또한, 사용되는 레이저 미세 절제 현미경 단리 세포 유형의 고순도 ROUT은inely은 7,11,13,14을 생산했다. 속 Boechera는 apomictic 재생의 주요 단계를 공부를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. Boechera에서, 상이한 성적 apomictic 가입 나 다양한 식별되고, 비교에 사용될 수 15, 16, 17은 해석한다. 성적 애기 장대와 apomictic Boechera에서 여성의 배아에서 세포의 세포 유형 별 전 사체의 비교에서, 우리는 이에 7 무수정 생식에 적용되는 규제 프로세스의 새로운 측면을 식별 차별적으로 발현되는 유전자와 경로를 확인했다. 또한,이 연구는 세포 유형 특이 적 전사 대 LAM의 적합성 작은 ​​희귀 세포 유형의 분석을 확인 하였다. 이미 식물 종의 다양한 상이한 세포 유형의 분석이 프로토콜을 사용하지만, 종 - 상기 프로토콜 조직 - 특이 적 변형은 특정한 경우에 요구 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>1,009,861,000</td><td>절대 EMPROV Ph Eur,BP,USP</td></tr><tr><td>15 ml 팔콘 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 바이오분석기</td><td>애질런트</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% 분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>Ambion Nuclease free water</td><td>life technologies</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S</td><td>라이카</td><td>14048043624</td><td>티슈 프로세서&nbsp;</td></tr><tr><td>검은색 판지는</td><td></td><td></td><td>특수 제지 상점에서 구입할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td>DNA 및 RNAse-free 프레임 슬라이드</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 &micro; m PET- 멤브레인; 또한 Leica</td></tr><tr><td>Dumond Forceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>확장기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA</td><td>Nalgene Vaccuum Dessicator 또는 유사한 장비</td></tr>에서 구매할 수 있습니다. <tr><td>필터 팁 10&nbsp; &마이크로; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td>는 <td>유사한 팁으로 교체할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 필터 팁 1,000&nbsp; &마이크로; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td>는 유사한 팁 필터 팁 20&nbsp<td>로 교체 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. &마이크로; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td>는 유사한 팁 필터 팁 200&nbsp<td>로 교체 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. &마이크로; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>유사한 팁으로 교체 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>집게 정밀도</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드 홀더</td><td>Huber &</td><td>Co.AG 10.0540.01</td><td>F &auml; rbek&auml; sten nach Hellendahl</td></tr><tr><td>유리 염색 트로</td>프 <td>Huber & Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F &auml; rbekasten</td></tr><tr><td>가열 파라핀 임베딩 모듈 Leica</td><td>Leica</td><td>Leica EG 1150 H</td><td>차단 스테이션, 유사한 장치가 적합합니다</td></tr><tr><td>. 가열 및 건조 테이블</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>다른 모델 및/또는 공급업체는 적합한</td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>VWR 얼음 양동이 뚜껑이 있습니다&nbsp;</td><td>10146-184</td><td>유사한 양동이 똑같이 적합한</td></tr><tr><td>라이트 테이블</td><td>UVP 분석 Jena Company</td><td>TW-26&nbsp;</td><td>백색광 Transluminator</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>절단 가장자리</td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 마이크로톰 블레이드 일회용</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml</td><td>life technologies</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>조직학을 위한</td> <td>X882.2</td></tr><tr><td>PicoPure RNA 분리 키트</td><td>생명 기술</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA 분리 키트</td></tr><tr><td>플라스틱 밸런싱 트레이</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 상자</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>플라스틱 뚜껑 가열판</td><td></td><td></td>용 <td>수제</td></tr><tr><td>준비 바늘</td><td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNAse 무료 마이크로퓨지 튜브</td><td>생명 기술</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNAse ZAP 오염 제거 솔루션</td><td>생명 기술</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>반자동 회전 마이크로톰&nbsp;</td><td>라이카</td><td>RM2245</td><td>유사한 장치는 똑같이 적합합니다</td></tr><tr><td>Tissue Loc Histo 스크린 카세트</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>다른 공급 업체의 유사한 카세트는</td></tr><tr><td>적합합니다 디퓨저 500 &마이크로가없는 접착 뚜껑이있는 튜브가 적합합니다. 엘&nbsp;</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>분. 99%, P.A., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>프로세스 임베딩 카세트</td><td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Leica Jet Cassette I 뚜껑 없음</td></tr><tr><td>Universal</td><td>Oven Memmert</td><td>UF55</td><td>기타 모델 및/또는 공급업체가 적합합니다.</td></tr></tbody></table>

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 microdissection (lam)

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

분자 수준에서 발달 과정을 이해하려면 개별 세포 유형 수준에서 전사 조절에 대한 통찰력이 필요하므로 전사체에 대한 통찰력이 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 일반적으로 광범위한 종과 세포 유형에 적용할 수 있지만, 본 연구는 식물 번식에 중점을 둡니다. 식물 재배 및 종자 생산은 인간과 동물의 영양에 매우 중요합니다. 생식 계통(생식세포)의 형성과 궁극적으로 종자의 형성을 지배하는 조절 네트워크에 대한 자세한 이해는 식물 번식의 표적 조작을 위한 전제 조건입니다. 특히, 아포믹시스(apomixis, 종자를 통한 무성 생식)를 농작물에 엔지니어링하는 것은 모체와 유전적으로 동일한 클론 종자의 형성으로 이어지기 때문에 큰 개선을 약속합니다. 결과적으로, 암컷 생식세포의 세포 유형은 아포믹시스의 이해와 공학에 매우 중요합니다. 그러나 해당 세포가 꽃 조직 깊숙이 박혀 있기 때문에 세포 유형 특이적 전사체학을 포함한 실험 분석에 접근하기가 매우 어렵습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 개별 세포의 절편을 LAM(Laser-assisted Microdissection)으로 분리할 수 있습니다. LAM과 전사 프로파일링을 함께 사용하면 특이성이 높은 모든 세포 유형에서 활성 유전자와 경로를 식별할 수 있지만, 적절한 프로토콜을 확립하는 것은 어려울 수 있습니다. 특히, LAM 후 얻은 RNA의 품질은 특히 작은 단일 세포가 표적이 될 때 손상될 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해 당사는 apomictic Boechera에서 암컷 생식세포의 세포를 분리한 것에서 볼 수 있듯이 전사체학에 매우 적합한 높은 RNA 품질을 재현 가능하게 생성하는 LAM에 대한 워크플로우를 구축했습니다. 이 프로토콜에서는 조직 준비 및 LAM에 대한 절차와 RNA 추출 및 품질 관리와 관련하여 설명됩니다.

샘플 준비 및 LAM은 연속 단계에서 완료 연속적인 단계들의 수는 LAM (도 1)에 의해 선택된 세포 유형에서 전사 분석을 위해 RNA를 준비해야한다. 이 RNA의 인구는 수확 후 변경되지 않도록 꽃과 즉시 고정의 수확을 시작합니다. 조직은 임베디드 구분, 슬라이드에 장착된다. 이 LAM에 의해 세포 하나 또는 여러 개의 모자 (그림 1)의 세포 유형 특정 섹션의 풀링의 분리를 할 수 있습니다. 재료는 이후 동결 또는 직접 RNA 추출법에 의해 처리 될 수있다. 외에 두 모델 비 모델 종 LAM 분석의 장점은 셀 타입 별 적용되어야에서, 상기 방법은 시간 소모적 오히려 남아있다. 때로는 더 많은 시간을 작업 중 적어도 1 주일, TI의 단계에 필요RNA 추출에 ssue...

여기에서는 전사 프로파일링을 위한 특정 식물 세포 유형의 레이저 보조 미미해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 종과 세포 유형에 적합하지만, 십자화과 속 Boechera에서 유성 생식 및 종말 생식에 중요한 암컷 생식세포의 접근하기 어려운 세포에 초점을 맞추고 있습니다.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

LAM을 위한 이 프로토콜의 전반적인 목표는 전사 분석을 위한 고순도 RNA를 생성하기 위해 특정 식물 세포를 분리하는 것입니다. 특히 유성 및 무성 생식 boechera 종의 난세포와 같이 접근하기 어려운 세포에 초점을 맞춥니다. 이 방법은 종자를 통한 식물의 유성 및 무성 생식의 기저가 되는 전사적 기초와 같은 식물 발달 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 특정 유형의 특수한 스타일을 수행할 수 있다는 것입니다. 이는 죽상경화증 조직 분석 시 희귀 세포 유형의 전사체가 가려지는 효과를 극복하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 블로킹 스테이션(blocking station)을 사용하여 56 °C로 가열된 신선한 플라스틱 평형 트레이에 녹인 파라핀 왁스를 채웁니다.파라핀 배스의 뚜껑을 열고 카세트를 하나씩 꺼냅니다. 샘플을 밸런싱 트레이에 담긴 56 °C의 액체 파라핀 왁스로 옮깁니다. 카세트를 취급하는 동안 샘플 주변의 왁스가 굳지 않도록 빠르게 진행하십시오.그 다음, 준비용 바늘을 사용하여 실험 설계에 따라 시료를 배치합니다. 모든 시료가 옮겨질 때까지 이 과정을 반복합니다. LAM을 위한 박절편을 준비하려면, 라이트 박스 위에서 플라스틱 트레이에 담긴 시료의 파라핀 왁스를 제거합니다.RNase-free 면도날을 사용하여 꽃눈이나 꽃과 같은 샘플이 포함된 왁스 블록을 절단하여 분리합니다. 그다음, 스패튤라 끝에 파라핀 왁스를 소량 녹입니다. 그리고 뜨거운 왁스를 사용하여 샘플이 내장된 블록을 지지대에 고정합니다.면도날을 사용하여 시료 주변의 불필요한 파라핀을 제거하고, 블록의 표면이 정사각형이며 모서리가 서로 평행한지 확인하십시오. 그다음, 가열판의 온도를 42°C로 설정하십시오. 시료를 마이크로톰에 안전하게 장착하십시오.Boechera 성숙 배우체 세포를 위해 7 µm 두께의 절편을 준비합니다. 그 후, 10~15 cm 길이의 파라핀 리본을 바닥에 검은색 판지가 깔린 플라스틱 상자로 옮긴 다음 LAM 슬라이드 위에 배치합니다. LAM용 슬라이드를 준비하려면, 금속 프레임 슬라이드 5~10개를 평평한 면이 위로 향하게 하여 가열판 위에 놓습니다.슬라이드의 플라스틱 부분에 RNase-free water 1~2 mL를 피펫으로 분주합니다. 면도날을 사용하여 파라핀 리본을 약 4~5 cm 길이의 짧은 조각으로 자릅니다. 이때 길이는 슬라이드의 플라스틱 윈도우를 가로지를 수 있을 정도여야 합니다.그 다음, 핀셋과 준비용 바늘을 사용하여 파라핀 스트립을 슬라이드의 플라스틱 윈도우 위에 서로 평행하게 배치합니다. 슬라이드의 한쪽 끝을 조심스럽게 들어 올려 물을 제거한 후 다시 내려놓습니다. 슬라이드에 닿지 않도록 플라스틱 덮개로 가열판을 덮되, 플라스틱 덮개를 통해 공기가 교환될 수 있도록 합니다.슬라이드를 42 °C에서 하룻밤 동안 건조합니다. 화학 흄후드 내에서 자일롤(xylol)을 사용하여 슬라이드의 왁스를 10분씩 두 번 제거합니다. 이때 슬라이드의 플라스틱 부분만 잠기게 하고, 나중에 꺼낼 수 있도록 각 슬라이드 금속 프레임의 넓은 끝부분은 건조한 상태로 유지하십시오.LAM을 수행하기 전, 화학 흄후드 내에서 슬라이드를 10분 동안 건조하십시오. 이 절차에서는 LAM을 위해 컴퓨터와 현미경의 전원을 켭니다. 그다음 현미경과 레이저를 제어하는 프로그램을 실행하십시오.레이저 제어 박스의 전원을 켜고 제어 박스에 있는 해당 버튼을 눌러 레이저를 켭니다. 그다음, 캡 홀더에 캡을 넣습니다. LAM 슬라이드를 현미경용 유리 슬라이드 위에 배치하고, 조직이 부착된 슬라이드의 평평한 면이 유리 슬라이드 쪽을 향하도록 합니다.그런 다음, 유리 슬라이드를 아래에 둔 상태로 슬라이드를 기기에 배치하십시오. 마지막으로, 캡이 끼워진 캡 홀더를 기기에 배치하십시오. 4x 대물렌즈를 선택하십시오.프로그램에서 캡을 위쪽 위치로 이동시킵니다. 그 후, 슬라이드를 스캔하십시오. 슬라이드를 탐색하여 관심 구조를 식별합니다.절단 단계에서 정확한 위치로 돌아올 수 있도록 슬라이드 상의 위치를 정확히 찾아 저장하십시오. 그런 다음 적절한 대물렌즈를 선택하십시오. 레이저 조사 버튼을 한 번 눌러 레이저 위치를 확인하십시오.이상적으로는 조직이 없는 막의 일부에서 수행합니다. 캡을 아래 방향으로 둔 상태에서, 핸드 펜 도구를 사용하여 관심 있는 세포 유형이나 조직의 경계를 표시합니다. 예를 들어, 난세포를 표시할 수 있습니다.Cut 버튼을 눌러 레이저로 절단하십시오. 개별 세포를 분리하기 위해서는 적절한 단면에서 세포를 명확하게 식별하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 세포 유형 특이적 전사 분석을 가능하게 하려면 세포의 직경이 최소 8 µm 이상이어야 합니다.세포 주변의 경계가 완전히 절단되지 않은 경우(일반적으로 화면에서 확인 가능) 섹셔닝을 반복해야 하므로 주의하시기 바랍니다. 이 경우, 표준 설정으로 소프트웨어가 해당 섹션을 자동으로 2회 반복 실행하도록 설정하는 것이 좋습니다. 그 후, 캡을 들어 올리고 관심 구조가 있는 다음 저장 위치로 이동하여, 한 슬라이드에서 원하는 모든 세포가 수집될 때까지 다음 세포 섹션을 절단하십시오.새로운 섹션이 캡의 빈 위치에 부착되도록 캡의 위치를 조정하십시오. 모든 슬라이드에서 관심 있는 세포 유형의 분리가 완료되면, 기기에서 슬라이드를 제거하십시오. 캡 홀더를 아래쪽 위치로 내리고 캡 표면을 육안으로 확인하십시오.4배 배율 대물렌즈를 사용하여 시료의 비특이적 오염 여부를 확인하고 제외하십시오. 그런 다음 캡을 닫으십시오. 이후 사용 시까지 동결 건조된 절편을 -80 °C에서 냉동 보관하십시오.성숙한 암배유의 모식도입니다. 이는 boechera divaricarpa의 암배유를 포함하는 배주를 얇게 절편한 것으로, 암배유의 특징적인 형태 덕분에 난세포를 명확하게 식별할 수 있습니다. 대조군으로서 동일한 슬라이드에서 채취한 더 넓은 조직 영역과 비교했을 때, 난세포 절편에서도 유사한 수준의 RNA 품질이 얻어졌습니다.확보된 RNA 품질은 세포 유형 특이적 RNA 시퀀싱에 적합하였으며, 이를 통해 무포자성 난세포에서는 발현되지만 무포자성 중앙세포, 조세포 또는 무포자성 초기 세포에서는 발현되지 않는 236개의 유전자를 식별하였습니다. 또한 arabidopsis thaliana의 성숙한 유성 배우체 세포에서도 발현되지 않았습니다. 발달 유전학의 추가적인 질문에 답하기 위해 다른 종의 다른 세포 및 조직 유형에 대해서도 프로파일링을 수행할 수 있습니다.식물 종자의 배유와 배에서 각인된 분자적 기초와 같은 연구가 이에 해당합니다. 이 기술의 발전으로 발달 유전학 및 식물 번식 분야의 연구자들은 Boechera 속의 무성생식에 대한 전사적 기초를 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 영상을 시청하고 나면 레이저 보조 미세 절단술(laser-assisted micro-dissection)을 이용하여 세포 유형 특이적 전사 분석을 위한 고품질의 RNA를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

laser-assisted-microdissection-lam-as-tool-for-transcriptional

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

레이저 microdissection은 현지화된 RNAi를 받게 Drosophila 날개 디스크의 특정 구획에있는 유전자 발현 프로 파일링을 분석에...

레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

우리는 정량 실시간 PCR 및 / 또는 전체를 게놈 microarrays를 사용하여 후속 유전자 발현 분석을위한 부상을 쥐의 뇌의 냉동 섹션에서 hippocampal 뉴런 또는 단일 뉴런의 풍부한 인구를 얻기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

개별 도파민 뉴런의 단리 또는 직접 또는 간접 면역과 복측 피개 영역은 레이저 미세 절제를 캡처하여 설명된다. 적외선 레이저를 이용하여 유리 슬라이드 조직으로부터 단리 및 적외선 및 자외선 레이저의 조합을 이용하여 막 slide에서 파라미터 논의된다.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

이 프로토콜의 목표는 다운스트림 RNA 분석을 위해 이질적인 전립선 조직에서 세포 유형의 순수한 집단을 분리하는 효과적인 방법으로 레이저 캡처 미세 해부를 사용하는 것입니다.

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

발달적으로 중요한 많은 유전자는 세포 또는 조직 특이적 발현 패턴을 가지고 있습니다. 본 논문은 야생형과 비교하여 옥수수잎-칼집 경계와 lg1-R 돌연변이에서 다르게 발현되는 유전자를 확인하기 위한 LM RNA-seq 실험에 대해 설명합니다. 여기에서 논의된 실험적 고려 사항은 다른 발달 현상의 전사체 분석에 적용됩니다.

레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

여기에 제시된 것은 식물 조직의 레이저 포획 미세 절(LCM)을 위한 프로토콜입니다. LCM은 오염없는 방식으로 조직의 영역을 격리하기위한 현미경 기술입니다. 절차는 조직 고정, 파라핀 포함, 단면, LCM 및 RNA 추출을 포함한다. RNA는 다운스트림 조직 특이적, 전사의 현세적으로 해결된 분석에서 사용된다.

레이저 캡처 미세 절 RNA-시퀀싱 용 공간 및 측두 조직 -특정 유전자 발현 분석

RNA 시퀀싱을 위해 개별 선충류 조직을 분리하기 위해 레이저 미세 해부를 사용하는 프로토콜이 기술되어 있습니다. 이 프로토콜은 종 특이적 유전자 툴킷을 필요로하지 않으므로 단일 조직 샘플 수준에서 다른 종간에 유전자 발현 프로필을 비교할 수 있습니다.

종에 구애받지 않는 단일 조직 응용 분야를 위한 레이저 미세 해부

구강 점막하 섬유증 조직의 레이저 캡처 미세해부를 통해 형태학적 및 공간 정보가 포함된 다중 오믹스 데이터를 분석하기 위해 조직학적 관심 영역에서 세포를 정밀하게 추출할 수 있습니다.

Laser Capture Microdissection에 의한 구강 점막하 섬유증 샘플에서 형태학적 및 공간적 정보가 있는 세포 분리

이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부를 사용하여 파라포름알데히드 고정 및 최적 절단 온도 화합물이 포함된 마우스 간 조직의 조직학적 영역에서 RNA를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 표적 하류 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

RNA 분석을 위한 파라포름알데히드 고정 마우스 간 조직의 레이저 캡처 미세 해부

배우세요 레이저 보조 미세절단(LAM)을 이용하여 Boechera 종의 난세포와 같은 특정 식물 세포를 분리하고 고품질 RNA를 추출하는 방법을. 이 기술은 식물 생식의 전사적 기전 연구에 활용됩니다.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

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