이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 광시트 현미경에서 제브라피시 배아의 눈 발달을 이미지화하고 멀티뷰 재구성 애플리케이션 플러그인을 통해 Figi에서 획득한 멀티뷰 데이터 세트를 처리하는 것입니다. 이 방법은 동물 발달에서 형태 유전 학적 사건을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 높은 공간적, 시간적 해상도로 촉각 배아의 발달 과정에서 형태발생학적 사건을 관찰할 수 있다는 것입니다.

광시트 현미경 검사의 주요 장점은 이 방법의 낮은 광독성, 샘플을 이미지화할 수 있는 빠른 획득 타이밍, 다양한 각도에서 샘플을 이미지화할 수 있는 이른바 뷰입니다. 다른 보기에서 샘플을 캡처하면 신호와 설정된 축의 저하를 극복할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 다양한 이미지를 샘플 주변의 형광 마이크로스피어를 사용하여 사용하고 등록할 수 있습니다.

등방성 해상도에 도달하는 3차원 부피를 재구성할 수 있습니다. 우리는 제브라피시 눈 발달을 위한 광시트 형량 현미경의 사용을 시연하지만, 이 방법은 다양한 모델 유기체를 사용하여 발생 생물학 및 신경 과학의 다양한 질문에 답하는 데에도 사용할 수 있습니다. 시작하려면 조명 대물렌즈를 덮은 상태로 유지하면서 검출 대물렌즈를 현미경에 나사로 고정합니다.

그런 다음 대물렌즈의 뚜껑을 풀고 샘플 챔버를 현미경에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 나사를 조여 챔버를 고정합니다. 그런 다음 온도 프로브와 펠티에 블록을 현미경에 연결합니다.

펠티에 블록의 냉각액을 순환시키는 두 개의 튜브는 두 커넥터와 호환되며 두 방향 모두에서 작동할 수 있습니다. 다음으로, 주사기를 사용하여 주사기를 통해 용액을 챔버 창의 상단 가장자리까지 로드하고 누출 여부를 확인합니다. 이제 현미경, 컴퓨터 및 배양을 켭니다.

현미경 작동 소프트웨어를 시작하고 배양 온도를 섭씨 28.5도로 설정합니다. 온도가 한 시간 동안 변하는 동안 샘플을 준비합니다. 아가로스를 준비하는 것부터 시작합니다.

섭씨 70도에서 E 3 매체에 1 % 낮은 융점 아가로 오스의 1 밀리리터 분취액을 준비했다. 약 15분 후, 600마이크로리터의 용융 아가로스를 새로운 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 250마이크로리터의 E 3 매체, 50마이크로리터의 0.4%MS 222 및 25마이크로리터의 와류 형광 비드 스톡 용액을 추가합니다. 튜브를 약 섭씨 39도의 가열 블록에 넣어 아가로스가 겔화 지점에 도달하도록 합니다.

다음으로, 테프론 팁 플런저를 1mm 내경의 유리 모세관 바닥까지 밀어 넣습니다. 그중 다섯 가지를 준비한다. 이제 아가로스 혼합물을 잠시 와류로 만든 다음 최소한의 액체로 5개의 배아를 옮깁니다.

그런 다음 모세혈관을 삽입하고 먼저 배아 머리를 흡인합니다. 머리가 꼬리보다 먼저 들어가야 하며 기포가 없어야 합니다. 배아 위에 약 2cm의 아가로즈가 있고 그 아래에 1cm의 아가로스가 있도록 충분한 용액을 그립니다.

진행하기 전에 각 모세혈관에 하나의 배아를 뽑습니다. 이 단계를 마스터하려면 몇 가지 연습이 필요합니다. 가치가 없는 배아를 사용하여 준비하십시오.

아가로스가 완전히 응고되면 용액의 바닥 개구부가 있는 플라스틱이 있는 비커 벽에 모세혈관을 지지하여 샘플을 E 3 매체에 보관하십시오. 이제 샘플 홀더를 조립합니다. 먼저 올바른 크기의 플라스틱 슬리브 두 개를 스템에 서로 마주 대고 삽입합니다.

소매의 슬릿은 바깥쪽을 향해야 합니다. 다음으로 클램프 나사를 부착합니다. 그리고 반대쪽에 검은색 띠가 보일 때까지 홀더를 통해 모세관을 삽입합니다.

플런저를 만지지 마십시오. 그런 다음 클램프 나사를 조입니다. 다음으로, 모세 혈관에서 아가로스를 1cm 정도 밀어내고 잘라냅니다.

그런 다음 줄기를 샘플 홀더 디스크에 삽입합니다. s를 로드하기 전에ample 디스크, stage가 제어 소프트웨어의 가장 높은 위치에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 가이드 레일을 사용하여 홀더를 미끄러지듯 움직이고 샘플을 현미경으로 내려갑니다.

이제 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 선택한 샘플을 이미지화합니다. 데이터 처리는 Figi에서 수행됩니다. ImageJ의 분포입니다.

시작하기 전에 Figi를 업데이트해야 합니다. 획득한 이미지 데이터 세트를 단일 폴더에 저장합니다. 이미지 처리의 중간 파일은 동일한 폴더에 저장됩니다.

이제 멀티뷰 재구성 응용 프로그램을 시작합니다. 그런 다음 새 데이터 세트를 정의합니다. Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats 옵션을 선택하고 출력 데이터 파일의 이름을 만듭니다.

그런 다음 데이터 세트의 첫 번째 CZI 파일을 선택합니다. 메타 데이터가 자동으로 로드됩니다. 이미지 메타 데이터에서 각도의 수, 채널, 조명 및 복셀 크기가 모두 올바르게 설정되었는지 다시 확인하십시오.

확인을 누르면 로그 창, 보기 설정 탐색기 창 및 콘솔 창이 열립니다. 보기 설정 탐색기는 사용자 친화적인 인터페이스를 제공합니다. 처리해야 할 파일을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 누릅니다.

실행되는 다양한 처리 단계를 보여주는 새 창이 열립니다. 오른쪽 상단에는 정보 및 저장 버튼이 있습니다. Info는 저장된 데이터 파일의 내용에 대한 요약을 표시하고 저장을 누르면 처리 결과가 저장됩니다.

그렇지 않으면 프로그램은 처리 단계의 결과를 저장하지 않습니다. 전체 데이터 세트를 다시 저장하려면 먼저 Ctrl+A를 누르고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 모든 파일을 선택합니다. 그런 다음 데이터셋 재저장(Resave Dataset)과 HDF5로(As HDF5)를 선택합니다.

그런 다음 다시 저장 작업에 대한 확인을 선택해야 합니다. 몇 분 후 각 시점에 대해 프로그램은 다시 저장이 완료되면 표시합니다. 그런 다음 데이터에서 관심 지점 감지를 진행합니다.

Ctrl+A를 누르고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 모든 시점을 선택합니다. 선택하려면 관심 지점을 감지합니다. 옵션에서 difference-of-gaussian을 선택합니다.

그리고 세분화하기 전에 샘플 이미지를 선택합니다. 다음 창에서 검색 설정을 선택합니다. subpixel localization 옵션에서 3-dimensional quadratic fit을 선택합니다.

그런 다음 관심 지점 사양에서 interactive를 선택합니다. 다운 샘플 XY 옵션의 경우 Z 해상도 일치를 선택합니다. 다운 샘플 Z의 경우 1x를 선택합니다.

그런 다음, CPU Java 옵션에서 컴퓨팅을 선택하여 작업을 실행합니다. 팝업 창에서 매개 변수를 테스트하기 위해 하나의 보기를 선택합니다. 보기가 로드되면 키보드에서 Ctrl+Shift+C를 눌러 밝기와 대비를 조정합니다.

또한 비드 감지의 경우 look for maxima green 옵션을 토글합니다. 이제 감지된 항목 주위의 녹색 고리로 구분을 관찰합니다. sigma one 및 threshold 매개변수에 대한 가우시엔 값의 차이를 조정하여 최소한의 거짓 긍정으로 비드를 최적으로 분할합니다.

각 비드는 한 번만 검출해야 합니다. 최적의 매개변수를 결정한 후 완료를 누릅니다. 컴퓨터가 로드된 후, 시점의 각 개별 보기와 비드를 분할한 후, 프로그램은 보기당 감지된 구슬 수가 포함된 로그 파일을 출력합니다.

보기당 600개에서 수천 개의 구슬이 있어야 합니다. 그렇지 않으면 감지 매개변수를 조정해야 합니다. 이것은 까다로운 과정입니다.

감지 피라미드는 첫 번째 시도에서 거의 정확하지 않으며 재설정은 한 영화의 시점 간에 다를 수 있습니다. 신선한 것을 완화하면 모든 실제 구슬을 감지하고 더 많은 거짓 긍정을 허용하는 데 도움이 될 수 있습니다. 피라미드의 조합이 작동하지 않으면 다른 형광 구슬을 사용하는 새로운 데이터 세트를 획득해야 합니다.

이제 탐지를 등록하고 스택에서 다중 보기 디콘볼루션을 만드는 작업을 진행합니다. LSFM은 세포 간 구조에서 세포 및 전체 조직에 이르기까지 여러 규모의 발달 과정을 장기간 이미징하는 데 이상적인 방법입니다. 매우 빠른 세포 간 사건은 신경 전구 세포의 미세소관 성장과 같은 고해상도로 캡처할 수 있습니다.

단일 시점 동영상에서 미세소관 성장의 정량화가 가능합니다. 세포 내 구조는 망막 신경절 세포 내의 중심체와 같이 여러 시간에 걸쳐 추적할 수 있습니다. 단일 세포 거동은 망막을 가로지르는 신경절 세포의 트랜스 위치와 같은 전체 조직 이미지에서 추출할 수 있습니다.

다중 보기 디콘볼루션은 점 확산 기능을 사용하여 여러 다른 보기를 결합하여 하나의 등방성 Z 스택을 생성합니다. 이는 단일 보기 또는 가중 평균 융합에 비해 크게 개선된 이미지를 제공합니다. 예를 들어, 광학 소포가 광학 컵으로 변환되는 것은 표시된 데이터 세트를 통해 서로 다른 방향의 광학 슬라이스에서 연구할 수 있습니다.

또한, 배아 내부 깊숙한 곳에서도 전반적으로 좋은 이미지 품질이 분명합니다. 예를 들어 시신경 컵 형태 형성을 볼 때와 같습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 광시트 현미경에 이미지 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

그리고 Figi에서 다중 보기 데이터 세트를 처리하는 방법. 마스터하면 광시트 현미경에서 타임랩스 실험을 시작하는 데 약 2시간이 걸립니다. 후속 데이터 분석에는 훨씬 더 많은 시간이 소요됩니다.

이 작업을 위해 컴퓨터 클러스터를 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 보다 실용적인 팁, 문제 해결 조언 및 다른 리소스에 대한 링크는 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 실험에 앞서 충분한 저장 용량과 명확한 데이터 처리 파이프 계획을 사용할 수 있어야 합니다.

문제, 질문 또는 향후 요청이 있는 경우 해당 기능 웹 사이트 또는 해당 github 리포지토리의 파일 문제를 참조하세요.