Name: 이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: 학습하세요 얼룩말고기 눈 발달을 가벼운 시트 형광 현미경으로 고해상도 실시간 관찰하는 방법을. 다중 시점 데이터 처리와 3D 재구성을 통해 형태발생 이벤트를 분석할 수 있습니다.

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강력한 오픈 소스 소프트웨어인 BigDataViewer를 제공해 준 Tobias Pietzsch에게 감사의 말을 전합니다. 막스 플랑크 분자 세포 생물학 및 유전학 연구소(MPI-CBG)의 광학 현미경 시설, 즉 기술 지원, 연구에 사용된 현미경의 완벽한 유지 관리, 원고에 대한 논평을 해준 Jan Peychl, Sebastian Bundschuh 및 Davide Accardi와 BigDataServer를 위한 H. Moon(MPI-CBG Scientific Computing Facility)에게 감사드립니다. 영화 1을 제작해 주신 율리아 아이히혼에게 감사드립니다. Norden 연구실 구성원과 Svea Grieb은 원고에 대해 많은 유용한 의견을 제공했습니다. 야로슬라프 이차(Jaroslav Icha), 크리스토퍼 슈미트(Christopher Schmied), 제이딥 시다예(Jaydeep Sidhaye)는 국제 막스 플랑크 세포, 발달 및 시스템 생물학 연구 학교의 회원이며 드레스덴 공과대학교에서 박사 과정을 밟고 있습니다. Pavel Tomancak은 ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development 및 Human Frontier Science Program Young Investigator 보조금 RGY0093/2012의 지원을 받고 있습니다. Caren Norden은 Human Frontier Science Program(CDA-00007/2011) 및 German Research Foundation(DFG)[SFB 655, A25]의 지원을 받고 있습니다.

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형태 형성은 배아 모양과 함께 성장 및 분화와 성숙 다세포 유기​​체로 수정란에서 개체 발생을 구동하는 과정입니다. 동물 개발하는 동안 형태 발생 과정은 그대로 살아있는 표본 1-3의 이미지로 최고의 분석 할 수 있습니다. 이러한 전 배아 촬상 이용시 시그널링 분자의 기울기, 세포 외 기질, 혈관, 신경 분포뿐만 아니라 주변 조직의 기계적 특성을 포함한 현상을 조절하는 모든 부품을 유지하기 때문이다. 형태 형성이 발생하는 비늘, 다리, 빠른 세포 내 사건은 시간 또는 며칠에 걸쳐 전체 조직의 발달의 맥락에서 미소 시간 스케일에 캡처되어야한다. 이러한 모든 요구 사항을 충족하기 위해 직교 평면 조명 현미경 (5)의 현대적인 구현 (4)는 개발되었다. 원래, 그것은 선택적 평면 조명 현미경 (SPI 지명되었다M) 4; 이제 모든 것을 포함하는 용어 가벼운 시트 형광 현미경 (LSFM)이 일반적으로 사용된다. 레이저 스캐닝 또는 회전하는 디스크 공 초점 현미경 6,7보다 광독성을 유도하면서 LSFM 높은 시간 해상도로 촬영을 할 수 있습니다. 요즘이 이미 기본적인 광 시트 조명의 원리의 많은 구현하고 그 이미지에 이전 연구자 8-11 액세스 시험편 및 프로세스의 많은 다양한 사용되었다. 우리는 먼저 기존의 공 초점 현미경 접근 방식을 통해 LSFM의 몇 가지 주요 장점을 강조하고 싶습니다 : 라이브 영상 현미경 실험에서 의미있는 결과를 얻기 위해서는, 관찰 만 최소 시료에 영향을 미치는 것이 중요하다. 그러나, 제브라 피쉬를 포함한 많은 생물은 광독성의 EF없이 높은 시간 해상도의 공 초점 현미경 이미지 그들에게이 도전하고, 레이저 광선에 매우 민감하다정체 또는 지연 개발 6,7 등 fects. LSFM 현재 샘플 7의 최소 분열 효과 형광 영상 법이다. 얇은 레이저 광 시트는 특정 시점에서 촬상 된 시험편의 일부만을 조명하므로, 광 시트 현미경은 매우 효율적으로 광자를 사용하고있다. 따라서, 낮은 조명 노출은 건강 시편의 이상 경과 관찰, 예를 들어 12 ~ 17 수 있습니다. 또한 LSFM의 최소 침습 덕분에, 획득 된 영상의 개수가 더이상 아니라 처리되고 저장 될 수있는 데이터의 양에 의해 시료가 견딜 수있는 빛의 양에 의해 결정되지 않는다. 근처 생리 학적 조건에서 시편을 유지하는 동일한 선에 따라서, LSFM 라이브 배아에 적합 다른 샘플 설치 전략이 함께 제공됩니다. LSFM 기술에서, 배아는 일반적으로 낮은 비율 아가로 오스의 얇은 칼럼에 포함된다. mountin동시에 여러 도면에서 (LSFM보기라고에서) 아가로 g 실린더는 회전 자유롭게 허용하므로 시료 완벽한 각도에서 관찰 될 수있다. 멀티 뷰 영상 및 후속 안식 융합 큰, 산란 표본에 특히 유용 높은 등방성 해상도로 캡처 할 수 있습니다. 다른 가능한 LSFM 설치 전략의 요약 E. 레이노의 실험실에 의해 작성된 샘플 준비의 장에서, 공식 현미경 운영 매뉴얼에서 찾을 수 있습니다. 그것은 여기에 설명 된 것보다 목표는 이미지를 다른 샘플에 특히 경우, 권장 읽기입니다. LSFM의 화상 취득은 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경 반대로, 넓은 시야, 카메라 계이다. 이것은 더 높은 신호 - 취득 이미지 잡음비 (SNR)를 초래하고 (초당 프레임 수십에서 수백)을 매우 빠르게 할 수있다. LSFM의 높은 민감도는 더 약하게 형광 SAMP의 영상을 가능하게레, 가까운 미래에 내인성 레벨 18에서 표현 된 전사 인자와 같은 내인성 단백질 / Cas9를 CRISPR를 사용하여 태그. 높은 SNR은 성공적인 하류 이미지 분석에 중요하다. 높은 속도가 빠른만큼 여러보기에서 전체 배아를뿐만 아니라 빠른 세포 내 프로세스를 캡처하는 데 필요한뿐만 아니라 이미지입니다. 관찰 된 현상은 별도의 뷰에서 오는 이러한 여러 Z 스택 획득 동안 변경하지 않는 경우 여러 뷰의 원활한 융합 만 달성 될 수있다. LSFM의 이점은 일반적으로 화질을 희생 오지 않는다. LSFM의 측면 해상도는 공 초점 현미경의 해상도보다 약간 더 나쁘다. LSFM에 사용되는 검출 목적이 하부 개구 표준 촛점 설정 물 또는 실리콘 침지 목표 1.2~1.3 비교 (보통 1.0 이하)을 가지고 있기 때문이다. 또한, 때문에 LSFM의 넓은 필드 검출 (에 absen핀홀 CE)은 공 초점 현미경에 비해 포커스 아웃 광있다. 포커스 아웃 광량은 광 시트의 두께에 의해 결정된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 단점은 LSFM에서 높은 SNR에 의해 보상된다. 실제로, 이것은 예컨대 디스크 촛점 취득 15 회전에 비해 유사한 이미지 품질을 초래한다. 따라서,이 세포 혈통이 15,19 추적을 위해, 세포막이나 핵, 예를 들어, 같은 기능의 신뢰성 추출 할 수 있습니다. LSFM의 축 해상도 광 판 두께에 의해, 검출 목적에 부가하여, 결정된다. 어떤 경우 LSFM 캔의 축 방향 해상도는 공 초점 현미경의 해상도를 넘어. 광 시트는 일반적으로 저배율 대물 이미지화 큰 시험편 발생하는 검출 목적의 축 해상도보다 얇은 경우에는 우선, 해상도의 향상이 온다. LSFM은 ACH 수있는 방법 두 번째 방법,더 축 해상도 ieve, 다른 관점에서 높은 XY 해상도 정보가 하나의 이미지 스택에 결합되는 안식 융합이다. 생성 된 병합 스택은 횡 방향 (20, 21)의 해상도 값에 접근 등방성 해상도를 갖는다. 이 문서에서 설명하는 서로 상에 여러 뷰를 등록하기위한 전략은 샘플 (20, 21)의 주위에 아가로 오스에 포함 된 신탁 마커로 형광 폴리스티렌 비즈를 사용하여 기반으로합니다. LSFM 상용화로 인해,이 기술은 과학 (22)의 넓은 지역에 사용할 수있다. 따라서,이 프로토콜을 작성하기위한 동기 부여는 LSFM에서 실무 경험이 부족한 발달 생물 학자들에이 기술이 액세스 할 수 있도록 이들 과학자들은 샘플이 기술을 사용하기 시작 얻는 것입니다. 우리의 프로토콜은 개념적으로 간단한 현미경 t를 구성하는 상업 빛 시트 현미경을 사용모자가 작동하기 쉽습니다. 우리는 또한 특정 질문에 23-25 ​​답변을 적합 할 수 있습니다 홈 내장 LSFM의 설정과 제브라 피쉬 이미징에 대한 최근의 다른 프로토콜을 언급하고 싶습니다. LSFM 또 다른 항목 옵션은 넓은 지역 사회에 빛 시트 현미경을 가지고 오픈 액세스 원리를 사용하는 오픈 플랫폼 (26, 27)이다. 하드웨어와 소프트웨어 측면 모두의 문서는 http://openspim.org 및 https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 LSFM과 발달 과정을 연구하는 모델 시스템으로 경골 제브라 피쉬를 사용합니다. 제브라 피쉬 눈의 형태 형성은 LSFM의 혜택을 많이 강조 예입니다. LSFM 이미 28 메다카 및 지브라 피쉬 29,30 안구 발달을 조사하기 위해 과거에 사용되었다. 시력 발달의 초기 단계는 종래의 현미경 정확하게 태아의 방향을 복잡부피가 큰 노른자로 배아가 눈 목표를 향하도록 측면에 거짓말을 할 수 없습니다. 그러나 LSFM는 아가 로스 칼럼에 장착하여, 샘플 재현성 위치 될 수있다. 또한, 광학 컵 무대에 광학 소포에서 전환하는 동안, 눈은 큰 Z 스택과보기의 큰 필드를 캡처 필요 성장과 함께 주요 형태 형성 재 배열을 겪는다. 또한 이러한 문제에 대한 LSFM은 기존의 공 초점 이미징 우수하다. 광섬유 컵 형성 과정은 따라서 이해할 한 시야에서 촬상 의해서만 시각화하기 어려운 입체이다. 이 등방성 해상도를 가진 멀티 뷰 영상이 유용합니다. 광학 컵 형성 한 후, 망막 레이저 노출에 더욱 민감하게된다. 따라서 LSFM와 연관된 낮은 광독성 장기 이미징 큰 장점이다. 여기에서 우리는 이전 제브라 피쉬는 배아 1 ~ 3 일의 촬영을 위해 최적화 된 프로토콜을 제시눈 개발에 초점을 맞춘 차 애벌레. 우리의 방법은 높은 공간 및 시간 해상도로 12 ~ 14 시간까지 취재 시간 경과 동영상 촬영을 할 수 있습니다. 이 기술은 변함없이 자주 테라 바이트 범위에서, 큰 데이터 세트를 생성으로 중요한 것은, 우리는 또한, LSFM에 필수적인 단계이다 데이터 처리를위한 파이프 라인을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 현미경</td><td>Carl Zeiss 현미경 저</td><td></td><td></td></tr><tr><td>융점 아가로스</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Sigma</td><td>A4018 또는 A9414</td><td></td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm 적색 형광 구슬 F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; 엘 (1&nbsp; mm 내경, 검정색으로 표시) capilllaries</td><td>브랜드</td><td>701904</td> 20&nbsp에 <td>대한 transferpettor</td></tr><tr><td>테플론 팁 플런저의 예비 부품으로 판매됩니다; &뮤; l 모세관</td><td>브랜드</td><td>701932</td><td>트랜스퍼페터</td></tr><tr><td>원형 유리 커버슬립 직경 18mm, 선택된 두께 0.17&nbsp; mm</td> 챔버 창문용 <td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>O-링 17&times; 1.5mm</td><td>Carl Zeiss 현미경 핀</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셋, 스타일 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50ml Luer-Lock 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock 주사기와 호환되는 주입용 150cm 연장 케이블</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>Links</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>링크 1 : 멀티뷰 재구성 응용 프로그램</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration</a> <a href="http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction">http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</a></td></tr><tr><td>링크 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer"> https://github.com/bigdataviewer< / a></td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td> <td><a href = "http://fiji.sc/BigDataViewer">http://fiji.sc/BigDataViewer< / a></td></tr><tr><td>Link 4 Multiview 재구성 응용 프로그램 - 문제</td><td></td><td></td> <td><a href = https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues< / a></td></tr><tr><td>링크 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues">https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues</a></td></tr><tr><td>링크 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataServer">http://fiji.sc/BigDataServer</a></td></tr></tbody></table>

이미지 zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

광시트 형광 현미경(LSFM)은 배아 발달을 이미지화하는 방법으로 점점 더 인기를 얻고 있습니다. 컨포칼 시스템과 비교했을 때 LSFM의 주요 장점은 낮은 광독성, 부드러운 장착 전략, 높은 신호 대 잡음비로 빠른 획득 및 장시간 동안 다양한 각도(보기)에서 샘플을 이미징할 수 있다는 것입니다. 여러 보기에서 이미징하면 LSFM의 잠재력을 최대한 발휘할 수 있지만 동시에 테라바이트 크기의 데이터 세트를 생성할 수 있습니다. 이러한 데이터 세트를 처리하는 것은 LSFM 사용의 가장 큰 과제입니다. 이 프로토콜에서는 이 문제에 대한 몇 가지 솔루션을 간략하게 설명합니다. 최근까지 LSFM은 대부분 자체 광시트 현미경을 제작하고 운영할 수 있는 전문 지식을 갖춘 실험실에서 수행되었습니다. 그러나 지난 3년 동안 LSFM의 여러 상업적 구현이 가능해졌는데, 이는 다목적이며 모든 발달 생물학자가 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 기사는 주로 LSFM 기술 개발자는 아니지만 특정 발생 생물학 질문에 답하기 위한 도구로 LSFM을 사용하고자 하는 연구자를 대상으로 합니다. 
여기에서는 제브라피시 눈 발달 이미징을 예로 들어 독자에게 LSFM 기술을 소개하고 여러 공간 및 시간 규모에 걸친 LSFM의 응용 프로그램을 시연합니다. 이 기사에서는 LSFM을 위한 제브라피시 배아 장착으로 시작하는 완전한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 그런 다음 시중에서 판매되는 광시트 현미경을 사용한 이미징 옵션을 간략하게 설명합니다. 중요한 것은 Fiji 플러그인으로 구현된 오픈 소스 솔루션을 사용하여 멀티뷰 데이터 세트의 후속 등록 및 융합을 위한 파이프라인도 설명한다는 것입니다. 이 프로토콜은 발달 중인 제브라피시 눈을 이미징하고 특정 이미징 설정의 데이터를 처리하는 데 중점을 두지만, 여기에 제시된 대부분의 통찰력 및 문제 해결 제안은 일반적으로 사용되며 이 프로토콜은 다양한 광시트 현미경 실험에 적용할 수 있습니다.

LSFM 비늘에 걸쳐 개발 프로세스를 이미징을위한 이상적인 방법입니다. 몇몇 애플리케이션은 세포 구조뿐만 아니라, 세포 및 조직 전체의 짧은 두 장기 영상을 도시 여기 컴파일된다. 이러한 예는 LSFM은 망막 신경에 광학 컵 형성에서 눈 개발의 여러 단계에서 유용한 도구가 있음을 보여줍니다. 영화 1은 처음에 그대로 배아의 축소보기를 보여주는, 일반 LSFM 방법의 예시로 제공 시야에서 아가로 오스 실린더를 삽입하고 나중에 형광 채널에서 망막의 상세도를 나타내는. <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> 영화 1 :. 제브라 피쉬 망막의 LSFM LSFM 접근 방식을 설명하기 위해,이 영화는 배아이 (가) 내부에 그대로 영상화 된 시야에서 처음으로 보여줍니다형광로 전환하기 전에 실린더를 garose. 나중에는보기의 큰 필드가 전체 망막의 관찰을 가능하게 것을 알 수있다. 다음으로, 영화는 좋은 세포 내 해상도를 강조하기 위해 망막의 확대 작은 영역을 보여줍니다. Ath5 : 갭 37 GFP 형질 전환 지브라 피쉬 배아 촬상을 위해 사용되었다. 이 유전자는 망막 (주로 신경절 세포 감광체 전구체)에서 다른 뉴런 라벨. 영화의 형광 부분은 5 분 간격으로 40 배 / 1.0 W 목표를 사용하여 이중 양면 조명으로 촬영 단일보기로 체포됐다. 30 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 투사가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 동영상이 매우 빠른 세포 내 이벤트를 높은 해상도로 캡처 할 수있는 방법을 보여줍니다; 미세 소관의 성장에서이 때그들의 플러스는 망막 신경 전구 세포에 끝납니다. 영화에 포함 된 정보는 미세 소관 플러스 엔드 성장의 추적 및 정량이 가능합니다. <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> 영화 2 :. 단일 셀의 미세 소관 역학이 영화는 플러스 팁 마커 단백질 EB3-GFP (38)에 의해 표시된 미세 소관의 플러스 팁을 성장 캡처. 단백질은 단일 망막 전구 세포에서 발현된다. 미세 소관이 기저에 혀끝에서 방향으로 주로 성장하고있다 (위에서 아래로). EB3 혜성의 평균 속도는 0.28 ± 0.05 μm의 / 초로 측정 하였다. 높은 미세 소관 핵 활성을 갖는 세포의 근단 측의 밝은 점은 중심체이다. 야생 형 배아는 HSP70로 주입 : EB3-GFP 플라스미드 DNA. 영화는 약 28 hrpost의 fertiliz에서 열 충격 (37 ° C에서 15 분) 후 4 시간을 인수 한ATION 63X / 1.0 W 객관적이고 1 초 시간 간격을 사용하여 단면 조명으로 촬영 단일보기로 (HPF). 단일 셀은 망막의 대부분을 덮는 시야에서 자른 하였다. 두 조각의 돌기가 표시되는 최대 강도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3은 어떻게 세포 내 구조물은 많은 시간에 걸쳐 올 수 있습니다. 여기에, 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)를 전좌 내 중심체가 캡처됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> 그림 3 :. 망막 신경절 세포의 전위 동안 중심체 현지화는 시간 경과 실험이 몽타주는 망막 신경절 세포 (RGC) 성숙에 걸쳐 중심체의 위치를 보여줍니다.신경 전구 세포의 중심체는 혀끝의 과정 (1시)의 매우 팁에서 지역화됩니다. 세포 분열 동안, 두 중심체는 유사 분열 스핀들 (2시 25분)에 대한 극 역할을합니다. 이 부서는 RGC와 시각 세포 전구체가되는 둘째 딸 세포로 분화 한 딸 셀에 발생합니다. 꼭대기 처리가 근단 측에 부착 한 채로 분할 후, RGC의 세포체는 망막의 기부 측으로으로 전위. RGC는 기저 측에 도달하면, 그 정점 처리는 분리와 중심체는 (6시 15분)로 이동한다. 서서히 혀끝의 과정 (6시 50분 7:20 8:10)과 함께 후퇴하는 동안 중심체가 올 수 있습니다. 중심체가 여전히 치근단 지역화 된 상태에서 마지막 프레임에서 (8:55) 신경절 세포는, 그 기저 측면에서 축삭을 성장하고있다. 모자이크 발현 한 세포 단계에서 야생형 수정란에 플라스미드 DNA 주입에 의해 달성 하였다. 세포는 Ath5 시각화되어 GFP-caax (녹색) CONST망막 신경절 세포와 다른 신경 세포 레이블 ruct. 중심체 (화살촉)는 Centrin-tdTomato 29 식 (마젠타)로 표시되어 있습니다. 망막의 정점면은 아래쪽의 화상의 상부 및 기부 쪽이다. 30 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 투영 도시된다. 이미지는 전체 망막을 다루는 영화에서 잘립니다했다. 영화는 약 34 시간 게시물 수정 (HPF)에서 시작한다. A에서 Z 스택은 40X / 1.0 W의 목적으로 매 5 분을 인수했다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 4에 표시하고, 이러한 영화 1과 전체 조직을 촬상 데이터로부터 추출 할 수있는 방법을 단일 셀 동작. RGC의 전좌 쉽게 추적 및 정점과 기저 처리 될 수있다ES는 다음에. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> 도 4.도 3에 기술 된 바와 같이 하나의 망막 신경절 세포의 전좌 망막의 기저 측으로 혀끝에서 RGC 전위 터미널 분열 후에 발생하는 RGC는 Ath5의 식으로 분류된다. 갭-GFP 37 유전자. 30 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 투영 도시된다. 이미지는 전체 망막을 다루는 영화에서 잘립니다했다. 영화는 약 34 HPF에서 시작한다. A에서 Z 스택은 40X / 1.0 W의 목적으로 매 5 분을 인수했다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 스케일 바 5 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 5는 조직 SC를 캡처 안식 LSFM의 능력을 입증광 소포는 눈 컵으로 변환하는 동안 광학 컵 형태 형성의 예에 휴대 해상도와 에일 형태 형성 과정. 화질이 크게 최종 화상 해상도 등방성 한 Z 스택에 (이 경우) (5) 다른 관점에서의 정보를 결합한다 다안 촬상에 의해 개선 될 수있다. 이 도면은 멀티 뷰 컨벌루션 후 가중 평균 융합 및 이미지 콘트라스트의 추가 이득 및 해상도 후의 화상 품질의 향상을 나타낸다. 그림은 데이터 세트를 통해 서로 다른 방향에서 두 개의 광학 조각을 보여줍니다. 또한, deconvolved 데이터 세트에서 몽타주는 시간이 지남에 따라 광 컵 형태 형성을 보여줍니다. 모든 시점이어서 영화 3에 나타낸다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> 그림 5 : 단일보기와 multiv의 두 가지 방법 사이의 화질 비교서평 융합. (A) 측면도 및 (B) 등의보기에서 표시 단일 뷰의 데이터를 하나의 광 조각. 스트라이프 유물과 샘플 내부의 깊은 신호의 저하는 분명하다. 또한, 데이터 융합 (CF)에서 보이는 이미지의 일부는 특정 뷰에서 포착되지 않았다. (C) 같은 광학 슬라이스, 다안 융합 데이터 측면도 및 (D) 등의보기에서 표시 해주기있다. 스트라이프 유물을 억제하고 샘플에 깊은 구조를 더 잘 해결되어 있습니다. (E) 같은 광학 슬라이스 이제 안식는 측면도 및 (F) 등의보기에서 표시된 데이터를 deconvolved있다. 개별 세포막과 핵 잘 구별 할 수 있도록 증가 대비 및 해상도를합니다. 해상도는 샘플 내부에 특히 깊은 저하되지 않습니다. 데이터 집합은 약 20도 떨어져 5보기에서 이중 양면 조명에 인수되었다. AB의 z 스택1.5 μm의 스텝 크기 100 ㎛의은 20X / 1.0 W 목적으로 10 시간 동안 10 분 간격으로 각 뷰에서 취득한 아웃. 안식 융합 디콘 볼 루션에 대한 입력 이미지는 아래의 화상 처리 속도를 2 × 샘플링 하였다. 안식 디컨 볼 루션의 15 반복 실행 하였다. (G) 몽타주는 광학 컵 무대에 광학 소포에서 일찍 눈 개발하는 동안 형태 발생 이벤트를 강조하는 deconvolved 데이터로부터 지느러미보기의 자른 영역을 보여줍니다. 초기 비슷한 원주 상피있는 광섬유 소포의 두 층은 별개의 세포 집단으로 분화. 표피에 가까운 말단 층은 망막 neuroepithelium (RN) 및 신경 튜브에 가까운 근위부 층은 망막 색소 상피 (RP)하게된다. 감소 임시 신장 및 invaginate의 셀은 광 컵 (5시에서 1시 40분까지)을 형성하는 단계; 동시에 RP 세포 평평. 표면 외배엽은 WH, 렌즈 (1:40)을 형성하도록 유도무형 문화 유산 invaginates 이상 (5시). 영화는 17 HPF에서 시작한다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 모든 세포막은 β - 굴지으로 표시되어 있습니다 : RAS-GFP의 유전자와 모든 핵은 HSP70에 의해 표시되어 있습니다 : H2B-RFP 형질 전환 유전자. 스케일 바는 30 μm의를 나타냅니다. FB의 전뇌, LE 렌즈, 영업 이익 후각 placode, RN 망막 neuroepithelium, RP 망막 색소 상피. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> 영화 3 : 광학 컵 형태 형성은 단일보기와 안식 융합의 두 가지 방법으로 표시된 시간 경과 영화는 광학 컵 무대에 광학 소포에서 광학 컵 형태 형성의 전체 프로세스를 보여줍니다.. 그것은 측면도 (위)와 지느러미보기에서 하나의 광학 슬라이스 (아래)에서 단일 광학 슬라이스를 보여줍니다. 현상 광섬유 소포 세포를 최종적으로 내부 및 외부 망막 neuroepithelium 망막 색소 상피 반구형 광섬유 컵을 형성하기 위해 복잡한 재 배열을 겪는다. 렌즈는 표면 외배엽 형성된다. 그것은 neuroepithelium와 함께 invaginates 및 광학 컵에 앉아있다. 모든 세포막은 β - 굴지의 식으로 표시됩니다 RAS-GFP (녹색) 유전자와 핵는 HSP70으로 표시됩니다 H2B-RFP (마젠타). 영화는 약 17 HPF에서 시작한다. 데이터 집합은 20X / 1.0 W의 목적으로 매 10 분을 취득한 약 20도 떨어져 5보기에서 이중 양면 조명으로 약 100 μm의 스택 AZ 인수되었다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 광시트 현미경에서 제브라피시 배아의 눈 발달을 이미지화하고 멀티뷰 재구성 애플리케이션 플러그인을 통해 Figi에서 획득한 멀티뷰 데이터 세트를 처리하는 것입니다. 이 방법은 동물 발달에서 형태 유전 학적 사건을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 높은 공간적, 시간적 해상도로 촉각 배아의 발달 과정에서 형태발생학적 사건을 관찰할 수 있다는 것입니다.광시트 현미경 검사의 주요 장점은 이 방법의 낮은 광독성, 샘플을 이미지화할 수 있는 빠른 획득 타이밍, 다양한 각도에서 샘플을 이미지화할 수 있는 이른바 뷰입니다. 다른 보기에서 샘플을 캡처하면 신호와 설정된 축의 저하를 극복할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 다양한 이미지를 샘플 주변의 형광 마이크로스피어를 사용하여 사용하고 등록할 수 있습니다.등방성 해상도에 도달하는 3차원 부피를 재구성할 수 있습니다. 우리는 제브라피시 눈 발달을 위한 광시트 형량 현미경의 사용을 시연하지만, 이 방법은 다양한 모델 유기체를 사용하여 발생 생물학 및 신경 과학의 다양한 질문에 답하는 데에도 사용할 수 있습니다. 시작하려면 조명 대물렌즈를 덮은 상태로 유지하면서 검출 대물렌즈를 현미경에 나사로 고정합니다.그런 다음 대물렌즈의 뚜껑을 풀고 샘플 챔버를 현미경에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 나사를 조여 챔버를 고정합니다. 그런 다음 온도 프로브와 펠티에 블록을 현미경에 연결합니다.펠티에 블록의 냉각액을 순환시키는 두 개의 튜브는 두 커넥터와 호환되며 두 방향 모두에서 작동할 수 있습니다. 다음으로, 주사기를 사용하여 주사기를 통해 용액을 챔버 창의 상단 가장자리까지 로드하고 누출 여부를 확인합니다. 이제 현미경, 컴퓨터 및 배양을 켭니다.현미경 작동 소프트웨어를 시작하고 배양 온도를 섭씨 28.5도로 설정합니다. 온도가 한 시간 동안 변하는 동안 샘플을 준비합니다. 아가로스를 준비하는 것부터 시작합니다.섭씨 70도에서 E 3 매체에 1 % 낮은 융점 아가로 오스의 1 밀리리터 분취액을 준비했다. 약 15분 후, 600마이크로리터의 용융 아가로스를 새로운 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 250마이크로리터의 E 3 매체, 50마이크로리터의 0.4%MS 222 및 25마이크로리터의 와류 형광 비드 스톡 용액을 추가합니다. 튜브를 약 섭씨 39도의 가열 블록에 넣어 아가로스가 겔화 지점에 도달하도록 합니다.다음으로, 테프론 팁 플런저를 1mm 내경의 유리 모세관 바닥까지 밀어 넣습니다. 그중 다섯 가지를 준비한다. 이제 아가로스 혼합물을 잠시 와류로 만든 다음 최소한의 액체로 5개의 배아를 옮깁니다.그런 다음 모세혈관을 삽입하고 먼저 배아 머리를 흡인합니다. 머리가 꼬리보다 먼저 들어가야 하며 기포가 없어야 합니다. 배아 위에 약 2cm의 아가로즈가 있고 그 아래에 1cm의 아가로스가 있도록 충분한 용액을 그립니다.진행하기 전에 각 모세혈관에 하나의 배아를 뽑습니다. 이 단계를 마스터하려면 몇 가지 연습이 필요합니다. 가치가 없는 배아를 사용하여 준비하십시오.아가로스가 완전히 응고되면 용액의 바닥 개구부가 있는 플라스틱이 있는 비커 벽에 모세혈관을 지지하여 샘플을 E 3 매체에 보관하십시오. 이제 샘플 홀더를 조립합니다. 먼저 올바른 크기의 플라스틱 슬리브 두 개를 스템에 서로 마주 대고 삽입합니다.소매의 슬릿은 바깥쪽을 향해야 합니다. 다음으로 클램프 나사를 부착합니다. 그리고 반대쪽에 검은색 띠가 보일 때까지 홀더를 통해 모세관을 삽입합니다.플런저를 만지지 마십시오. 그런 다음 클램프 나사를 조입니다. 다음으로, 모세 혈관에서 아가로스를 1cm 정도 밀어내고 잘라냅니다.그런 다음 줄기를 샘플 홀더 디스크에 삽입합니다. s를 로드하기 전에ample 디스크, stage가 제어 소프트웨어의 가장 높은 위치에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 가이드 레일을 사용하여 홀더를 미끄러지듯 움직이고 샘플을 현미경으로 내려갑니다.이제 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 선택한 샘플을 이미지화합니다. 데이터 처리는 Figi에서 수행됩니다. ImageJ의 분포입니다.시작하기 전에 Figi를 업데이트해야 합니다. 획득한 이미지 데이터 세트를 단일 폴더에 저장합니다. 이미지 처리의 중간 파일은 동일한 폴더에 저장됩니다.이제 멀티뷰 재구성 응용 프로그램을 시작합니다. 그런 다음 새 데이터 세트를 정의합니다. Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats 옵션을 선택하고 출력 데이터 파일의 이름을 만듭니다.그런 다음 데이터 세트의 첫 번째 CZI 파일을 선택합니다. 메타 데이터가 자동으로 로드됩니다. 이미지 메타 데이터에서 각도의 수, 채널, 조명 및 복셀 크기가 모두 올바르게 설정되었는지 다시 확인하십시오.확인을 누르면 로그 창, 보기 설정 탐색기 창 및 콘솔 창이 열립니다. 보기 설정 탐색기는 사용자 친화적인 인터페이스를 제공합니다. 처리해야 할 파일을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 누릅니다.실행되는 다양한 처리 단계를 보여주는 새 창이 열립니다. 오른쪽 상단에는 정보 및 저장 버튼이 있습니다. Info는 저장된 데이터 파일의 내용에 대한 요약을 표시하고 저장을 누르면 처리 결과가 저장됩니다.그렇지 않으면 프로그램은 처리 단계의 결과를 저장하지 않습니다. 전체 데이터 세트를 다시 저장하려면 먼저 Ctrl+A를 누르고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 모든 파일을 선택합니다. 그런 다음 데이터셋 재저장(Resave Dataset)과 HDF5로(As HDF5)를 선택합니다.그런 다음 다시 저장 작업에 대한 확인을 선택해야 합니다. 몇 분 후 각 시점에 대해 프로그램은 다시 저장이 완료되면 표시합니다. 그런 다음 데이터에서 관심 지점 감지를 진행합니다.Ctrl+A를 누르고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 모든 시점을 선택합니다. 선택하려면 관심 지점을 감지합니다. 옵션에서 difference-of-gaussian을 선택합니다.그리고 세분화하기 전에 샘플 이미지를 선택합니다. 다음 창에서 검색 설정을 선택합니다. subpixel localization 옵션에서 3-dimensional quadratic fit을 선택합니다.그런 다음 관심 지점 사양에서 interactive를 선택합니다. 다운 샘플 XY 옵션의 경우 Z 해상도 일치를 선택합니다. 다운 샘플 Z의 경우 1x를 선택합니다.그런 다음, CPU Java 옵션에서 컴퓨팅을 선택하여 작업을 실행합니다. 팝업 창에서 매개 변수를 테스트하기 위해 하나의 보기를 선택합니다. 보기가 로드되면 키보드에서 Ctrl+Shift+C를 눌러 밝기와 대비를 조정합니다.또한 비드 감지의 경우 look for maxima green 옵션을 토글합니다. 이제 감지된 항목 주위의 녹색 고리로 구분을 관찰합니다. sigma one 및 threshold 매개변수에 대한 가우시엔 값의 차이를 조정하여 최소한의 거짓 긍정으로 비드를 최적으로 분할합니다.각 비드는 한 번만 검출해야 합니다. 최적의 매개변수를 결정한 후 완료를 누릅니다. 컴퓨터가 로드된 후, 시점의 각 개별 보기와 비드를 분할한 후, 프로그램은 보기당 감지된 구슬 수가 포함된 로그 파일을 출력합니다.보기당 600개에서 수천 개의 구슬이 있어야 합니다. 그렇지 않으면 감지 매개변수를 조정해야 합니다. 이것은 까다로운 과정입니다.감지 피라미드는 첫 번째 시도에서 거의 정확하지 않으며 재설정은 한 영화의 시점 간에 다를 수 있습니다. 신선한 것을 완화하면 모든 실제 구슬을 감지하고 더 많은 거짓 긍정을 허용하는 데 도움이 될 수 있습니다. 피라미드의 조합이 작동하지 않으면 다른 형광 구슬을 사용하는 새로운 데이터 세트를 획득해야 합니다.이제 탐지를 등록하고 스택에서 다중 보기 디콘볼루션을 만드는 작업을 진행합니다. LSFM은 세포 간 구조에서 세포 및 전체 조직에 이르기까지 여러 규모의 발달 과정을 장기간 이미징하는 데 이상적인 방법입니다. 매우 빠른 세포 간 사건은 신경 전구 세포의 미세소관 성장과 같은 고해상도로 캡처할 수 있습니다.단일 시점 동영상에서 미세소관 성장의 정량화가 가능합니다. 세포 내 구조는 망막 신경절 세포 내의 중심체와 같이 여러 시간에 걸쳐 추적할 수 있습니다. 단일 세포 거동은 망막을 가로지르는 신경절 세포의 트랜스 위치와 같은 전체 조직 이미지에서 추출할 수 있습니다.다중 보기 디콘볼루션은 점 확산 기능을 사용하여 여러 다른 보기를 결합하여 하나의 등방성 Z 스택을 생성합니다. 이는 단일 보기 또는 가중 평균 융합에 비해 크게 개선된 이미지를 제공합니다. 예를 들어, 광학 소포가 광학 컵으로 변환되는 것은 표시된 데이터 세트를 통해 서로 다른 방향의 광학 슬라이스에서 연구할 수 있습니다.또한, 배아 내부 깊숙한 곳에서도 전반적으로 좋은 이미지 품질이 분명합니다. 예를 들어 시신경 컵 형태 형성을 볼 때와 같습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 광시트 현미경에 이미지 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.그리고 Figi에서 다중 보기 데이터 세트를 처리하는 방법. 마스터하면 광시트 현미경에서 타임랩스 실험을 시작하는 데 약 2시간이 걸립니다. 후속 데이터 분석에는 훨씬 더 많은 시간이 소요됩니다.이 작업을 위해 컴퓨터 클러스터를 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 보다 실용적인 팁, 문제 해결 조언 및 다른 리소스에 대한 링크는 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 실험에 앞서 충분한 저장 용량과 명확한 데이터 처리 파이프 계획을 사용할 수 있어야 합니다.문제, 질문 또는 향후 요청이 있는 경우 해당 기능 웹 사이트 또는 해당 github 리포지토리의 파일 문제를 참조하세요.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 기사는 광시트 형광 현미경 검사를 위한 시료 준비에 대해 설명합니다. 또한 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 보여주며, 이를 통해 거의 생리학적 조건에서 살아있는 배아의 긴 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다.

광시트 현미경 시료 전처리: 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 장착

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

여기, 선물이 시각화 4 차원 (4d)에서 zebrafish에 마음을 개발 하는 프로토콜. 빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)를 통해 4 차원 영상, 3 차원 (3 차원) 이미지 개발 마음을 재구성 하는 시간 걸립니다. 우리 그 전단 응력 활성화 endocardial 노치 신호 챔버 개발, 심장 trabeculation를 승진 시키는 동안 질적 및 양적 보여줍니다.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

우리는 빛 시트 형광 현미경 검사법과 생체 내 제브라피시 심장을 연구하는 최적화 된 도구를 설명합니다. 특히, 우리는 밝은 심장 형질 전환선을 제안하고 발달과 심장 결함을 피하는 새로운 부드러운 임베드 및 고정 기술을 제시합니다. 심장 이미징에 적응된 가능한 데이터 수집 및 분석 파이프라인도 제공됩니다.

얼룩말 물고기 배아에서 빠른 심장 역학의 빛 시트 현미경 검사

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

학습하세요 얼룩말고기 눈 발달을 가벼운 시트 형광 현미경으로 고해상도 실시간 관찰하는 방법을. 다중 시점 데이터 처리와 3D 재구성을 통해 형태발생 이벤트를 분석할 수 있습니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

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