단백질 분해에서의 사이클로 헥시 미드 체이스 분석

본 실험 절차의 전반적인 목적은 Saccharomyces cerevisiae에서 특정 단백질의 정상 상태(steady state) 집단의 분해를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 관심 단백질의 분해에 필요한 유전적 요건과 환경적 영향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 분해 시각화에 함께 사용되는 펄스-체이스(pulse-chase) 기법과 달리, 방사성 동위원소나 시간이 오래 걸리는 면역침강 단계가 필요하지 않다는 점입니다.

이 절차는 내인성 효모 단백질 또는 플라스미드에서 발현된 단백질을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 후자의 경우, 표준 효모 형질전환 프로토콜에 따라 관심 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 효모 균주에 형질전환합니다. 적절한 배지 5 mL에 효모를 접종하십시오.

회전시키며 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 각 하룻밤 배양액의 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)를 측정합니다. 배양액을 15 mL의 신선한 배지에서 OD600이 0.2가 되도록 희석합니다.

세포가 대수 성장 중간 단계(mid-logarithmic growth phase)에 도달할 때까지 30 °C에서 진탕 배양합니다. 효모 세포가 성장하는 동안 cycloheximide chase 실험 절차를 준비합니다. 15 mL 원추형 튜브를 수용할 수 있는 히팅 블록을 30 °C로 설정하여, cycloheximide 존재 하에 세포를 배양할 준비를 합니다.

배양물에 열이 효율적으로 전달되도록, 15 milliliter 원심분리관을 넣었을 때 수위가 웰의 가장자리까지 차오르되 넘치지는 않을 정도로 각 웰에 물을 채웁니다. 세포 용해 후 단백질 변성을 위해 1.5 milliliter 마이크로 원심분리관을 수용할 수 있는 두 번째 히팅 블록을 95 degrees Celsius로 설정합니다. 신선한 성장 배지를 30 degrees Celsius로 미리 데워 둡니다.

분석 대상 배양물당 각 시점별로 1.1 milliliters의 배지가 필요합니다. 미리 라벨을 붙인 마이크로원심분리 튜브에 20x Stop Mix 50 microliters를 첨가합니다. 분석 대상 배양물당 시점별로 튜브 하나씩을 준비합니다.

튜브를 얼음 위에 둡니다. 효모 세포가 대수 성장 중간 단계(mid-logarithmic growth)에 도달하면, 분석할 각 시점당 2.5 OD600 단위의 배양액을 수집합니다. 1 OD600 단위는 OD600 수치가 1.0일 때 배양액 1mL에 존재하는 효모의 양과 같습니다.

수집한 세포를 15 milliliter 원추형 튜브에 넣고 실온에서 3,000 ×g로 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 세포 2.5 OD600 단위당 30 °C의 신선한 배양액 1 milliliter를 사용하여 각 세포 펠렛을 재현탁합니다.

사이클로헥시미드 체이스(cycloheximide chase)를 시작하기 전에, 효모 세포 현탁액을 30 °C 히팅 블록에서 5분 동안 배양하여 평형 상태로 만듭니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 각 샘플에 대한 사이클로헥시미드 첨가 및 세포 수집의 타이밍을 맞추는 것입니다. 저희는 사이클로헥시미드 첨가와 세포 수집을 위한 시간표를 수립하고 이를 엄격히 준수함으로써 실험의 성공을 보장합니다.

cycloheximide chase를 시작하려면 타이머의 "Start" 버튼을 누르십시오. 첫 번째 효모 세포 현탁액에 cycloheximide를 최종 농도 250 µg/mL가 되도록 신속하고 주의 깊게 첨가한 후, 짧게 vortexing하여 혼합합니다. cycloheximide가 첨가된 효모 세포 현탁액 950 µL(약 2.4 OD600 unit)를 즉시 50 µL의 ice-cold 20x Stop Mix가 들어 있는 라벨이 부착된 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.

마이크로원심분리관을 볼텍싱하고 모든 샘플이 수집될 때까지 얼음에 보관하십시오. 나머지 효모 세포 현탁액 각각에 대해 정해진 시간 간격으로 시연된 바와 같이 사이클로헥시마이드 체이스(cycloheximide chase)를 시작하십시오. 이후 각 시간 지점마다 효모 세포 현탁액을 볼텍싱하고, 50 $\mu$L의 사전 냉각된 20x Stop Mix가 들어 있는 라벨이 부착된 마이크로원심분리관에 950 $\mu$L를 옮기십시오.

볼텍싱한 후 수집된 세포를 얼음에 둡니다. 효모 세포가 가라앉는 것을 방지하기 위해, 체이스 과정 동안 15 milliliter 원추형 튜브에 담긴 세포 현탁액을 약 5분마다 한 번씩 볼텍싱합니다. 모든 샘플이 수집되면, 상온에서 6,500 ×g로 30초 동안 원심분리하여 수집된 세포를 펠렛화합니다.

피펫팅 또는 흡입으로 상청액을 제거합니다. 이제 세포를 알칼리 용해(alkaline lysis)할 준비가 되었습니다. 각 세포 펠렛에 3증류수 100 µL를 첨가하고, 피펫팅으로 상하로 섞어 재현탁함으로써 알칼리 용해를 위한 준비를 합니다.

각 시료에 0.2 M 수산화나트륨 100 µL를 첨가합니다. 볼텍싱하여 혼합합니다. 세포를 상온에서 5분 동안 배양합니다.

이 단계에서 효모 세포는 아직 용해되지 않았으며, 단백질도 방출되지 않은 상태입니다. 다음으로, 상온에서 18,000 ×g로 30초 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 피펫팅 또는 흡입을 통해 상층액을 제거합니다.

세포를 용해하려면, 각 세포 펠렛에 Laemmli Sample Buffer 100 µL를 첨가합니다. 피펫팅을 통해 재부유시킵니다. 단백질을 완전히 변성시키기 위해 95 °C에서 5분 동안 배양합니다.

불용성 물질을 침전시키기 위해 용해물을 18,000 ×g, 상온에서 1분간 원심분리합니다. 가용화된 추출 단백질인 상층액은 SDS PAGE 분리 및 이후의 Western blot 분석에 사용할 수 있습니다. 또는, 용해물을 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

모델 효모 소포체 관련 분해(ERAD) 기질인 Deg1-Sec62의 안정성을 cycloheximide chase 방법으로 분석하였습니다. Deg1-Sec62 단백질은 SDS PAGE 상에서 여러 종으로 이동하며, 야생형 세포 내에서 쉽게 분해됩니다. Pgk1은 분석 조건에서 그 양이 변하지 않는 로딩 컨트롤입니다.

ER 상주 유비퀴틴 리가아제 hrd1 또는 유비퀴틴 결합 효소 ubc7 중 어느 하나가 결손되면 Deg1-Sec62 단백질이 상당히 안정화되었으며, 이는 Deg1-Sec62 분해에서 이들 단백질의 기존에 관찰된 역할을 확인시켜 줍니다. Cue1은 ubc7을 ER 막에 고정시키고 해당 효소를 활성화하는 막관통 단백질이지만, Deg1-Sec62 분해에서 cue1의 필요성은 직접적으로 조사된 바 없습니다. 본 연구에서 cue1이 없을 때 Deg1-Sec62가 안정화되었다는 관찰 결과는 Deg1-Sec62의 ER 연관 분해(ERAD)에서 cue1의 역할을 확인해주었습니다.

Western blot 결과는 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화하였습니다. 샘플 간의 Deg1-Sec62 단백질 풍부도를 비교하기 위해, 각 샘플에 대해 Pgk1 대비 Deg1-Sec62의 보정된 신호 강도 비율을 결정하였습니다. 이 절차는 표적 단백질의 정상 상태 집단에 대한 분해 역학을 가장 직접적으로 나타낸다는 점을 유의하는 것이 중요합니다.

관심 단백질의 신생 집단 분해를 시각화하기 위해 펄스-체이스(pulse-chase) 실험과 같은 다른 기술을 사용할 수 있습니다. 사이클로헥시미드(cycloheximide)와 아지드화 나트륨(sodium azide)은 매우 독성이 강하므로, 이 실험 절차를 수행하는 동안 해당 화학 물질과 직접 접촉하지 않도록 주의해야 함을 잊지 마십시오.