2016년 5월 3일
노화와 관련된 눈렌즈 뻣뻣함의 증가는 노안과 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 렌즈의 강성을 측정하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 쥐 렌즈는 사람 렌즈와 마찬가지로 나이가 들면서 더 뻣뻣해집니다. 이 방법은 정확하며 더 큰 동물의 렌즈에 적용할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 간단하고 저렴한 접근 방식을 사용하여 mouse lens의 압축 강성과 기하학적 구조를 평가하는 것입니다. 이 방법은 렌즈 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 예를 들어, 다양한 유전적 및 실험적 섭동이 렌즈의 생체 역학적 특성에 어떻게 영향을 미치는지.
이 기술의 주요 장점은 정확하고 재현 가능하며 비싸거나 전문화된 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 이 방법은 마우스 렌즈의 특성에 대한 통찰력을 제공하며, 쥐와 토끼와 같은 더 큰 모델 유기체에 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각화는 렌즈 해부 및 커버슬립 적용 단계가 시연 없이는 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.
이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Catherine Cheng입니다. 안락사된 쥐의 눈 주위 조직을 눌러 안구부 집게를 사용하여 눈구멍에서 눈을 꺼내는 해부를 시작합니다. 그런 다음 눈을 제거하고 해부 현미경으로 신선한 PBS가 들어 있는 해부 접시에 넣습니다.
안구에 최대한 가까운 시신경을 잘라냅니다. 그리고 시신경이 장기의 뒤쪽으로 나가는 구멍을 통해 안구에 가늘고 곧은 핀셋을 부드럽고 조심스럽게 삽입합니다. 수정체가 손상되지 않도록 주의하면서 가위로 후방에서 각막 가장자리까지 조심스럽게 절개합니다.
각막과 공막 사이의 접합부를 따라 적어도 안구 주위의 절반 정도까지 절개를 계속합니다. 그리고 각막을 부드럽게 눌러 구멍을 통해 눈에서 수정체를 제거합니다. 그런 다음 끝이 가는 직선 집게를 사용하여 렌즈에 아직 부착되어 있는 큰 파편을 조심스럽게 제거합니다.
그리고 렌즈에 손상이 없는지 육안으로 확인합니다. 강성 측정을 시작하기 최소 2시간 전에 분석 저울을 사용하여 동일한 상자에서 최소 10개의 커버 슬립을 계량하십시오. 커버 슬립의 평균 무게를 결정하십시오.
그런 다음 실온 PBS에서 커버 슬립과 직각 거울을 미리 적십니다. 재료가 수화되는 동안 측정 챔버에 65-75ml의 PBS를 채웁니다. 그리고 챔버를 30X 배율로 설정된 해부 현미경 아래에 놓고 바닥에서 조명을 비추고 왼쪽과 오른쪽에 광섬유 광원을 놓습니다.
커버 슬립이 준비되면 렌즈를 고정하는 데 사용할 디봇에서 일정한 거리에 있는 챔버에 직각 거울을 놓습니다. 다음으로, 구부러진 집게를 사용하여 절개된 렌즈를 측정 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 전원 광학 전원 공급 장치를 최대 광 강도의 80%로 설정하고 필요에 따라 주변 조명, 사용자 선호도 및 화질에 따라 전원 공급 장치 출력을 조정합니다.
챔버의 바로 머리 위에서 로드되지 않은 렌즈의 탑 뷰 이미지를 얻습니다. 그런 다음 초점이 맞춰진 미러 가장자리의 사진을 찍은 다음 디봇 외부의 미러를 통해 로드되지 않은 렌즈의 측면 보기 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 렌즈를 디봇에 삽입하고 렌즈가 전방 또는 후방 극의 디봇 내에 안전하고 직선으로 안착되었는지 확인합니다.
거울에 비친 렌즈의 사진을 찍습니다. 그런 다음 커버 슬립을 렌즈에 부드럽게 끼웁니다. 2분 후 로드된 렌즈의 다른 측면 이미지를 촬영합니다.
커버 슬립을 계속 추가하고, 각 커버 슬립을 추가한 후 2분 후에 총 10개의 커버 슬립이 적용될 때까지 측면 이미지를 얻습니다. 그런 다음 모든 커버 슬립을 제거하고 마지막 2분을 기다린 다음 디봇 내부와 외부의 렌즈의 측면 이미지를 얻습니다. 및 디봇 외부의 렌즈의 평면도 이미지.
렌즈 핵 크기를 결정하려면 PBS로 채워진 깨끗한 페트리 접시에 렌즈를 넣고 가늘고 곧은 집게를 사용하여 렌즈의 캡슐화를 부드럽게 해제합니다. 피질 섬유 세포를 제거하려면 장갑을 낀 손가락 사이로 렌즈를 굴립니다. 다음으로, PBS에서 렌즈 핵을 부드럽게 헹구고 핵을 측정 챔버에 다시 놓습니다.
right angle mirror를 통해 수정체 핵의 이미지를 획득합니다. 마지막으로, 이미지를 분석하기 위해 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 loading 단계 전후에 렌즈의 적도 및 축 직경을 측정합니다. 각 수정체 핵의 직경도 측정합니다.
이 대표적인 실험에서는 2개월, 4개월, 8개월 된 마우스 렌즈의 강성과 치수를 측정하고 축 방향 및 적도 변형을 계산했습니다. 축 방향 변형률은 최대 적용 하중 하에서 축 방향 및 적도 변형률이 통계적으로 유의하게 연령에 따라 감소하는 적용된 하중의 로그 함수로, 마우스 렌즈가 나이가 들면서 뻣뻣해짐을 나타냅니다. 이 실험에서 수집된 이미지 데이터는 몇 가지 다른 렌즈 형태학적 특성을 결정하는 데에도 사용되었습니다.
예상했던 대로, 축지름과 적도의 지름, 그리고 렌즈의 부피는 나이가 들면서 증가했다. 종횡비는 렌즈가 축 지름보다 적도 지름이 약간 더 크다는 것을 나타냅니다. 그리고 이 매개변수는 나이에 따라 변경되지 않았습니다.
수정체 핵의 직경, 부피 및 분율은 나이가 들면서 증가하며, 이는 수정체핵이 수정체가 노화됨에 따라 상대적인 크기가 증가하도록 리모델링된다는 것을 시사합니다. 이 기술은 일단 숙달되면 적절하게 수행되면 렌즈 당 30-45분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 렌즈를 디봇 내부에 고르게 배치하고 각 추가 커버 슬립 사이에 2분 동안 렌즈가 스트레스 이완을 받을 수 있도록 하는 것이 중요합니다.
이 동영상을 시청한 후에는 cover slips를 순차적으로 적용하여 mouse lens의 compressive stiffness와 morphometrics를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 정밀하고 간단하며 저렴한 기술은 렌즈 연구자들이 생쥐의 유전자 돌연변이의 생체역학적 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.
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이 프로토콜은 나이가 들수록 인간 렌즈와 마찬가지로 강성이 증가하는 마우스 렌즈의 강성을 측정하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 기술은 정밀하며 더 큰 동물의 렌즈에 사용할 수 있도록 적응할 수 있습니다.
Quantitative assessment of lens compressive stiffness using sequential glass coverslips enables precise biomechanical characterization in genetically engineered mouse models. This reproducible, scalable method supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for ocular disease research. Its cost-effectiveness and adaptability position it as a reusable capability for preclinical R&D pipelines focused on lens pathologies and age-related biomechanical changes.
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for ocular research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational modeling.