Name: 유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분의 독성 효과를 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 분석 (HPHC) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 배우세요 담배 연기 성분의 독성 평가를 위해 임피던스 기반 실시간 세포 분석과 고내용 스크리닝 플랫폼을 사용하는 방법입니다. 이 기법은 사람 기관지 상피 세포에서 세포독성과 생화학적 변화를 동시에 측정하여 효과적인 독성 프로파일을 제공합니다.

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저자는 원고의 자신의 검토를 위해 Karsta Luettich과 그레고리 Vuillaume에게 감사의 말씀을 전합니다.

<ol><li>Rodgman, A., Perfetti, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodgman%2C+A+%22The+chemical+components+of+tobacco+and+tobacco+smoke%22">The chemical components of tobacco and tobacco smoke</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , Methuen, London. (1959).</li>
<li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research+combinatorial+chemistry+%26+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).</li>
<li>US Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Harmful+and+potentially+harmful+constituents+in+tobacco+products+and+tobacco+smoke%3B+established+list%2C+federal+register%22">Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register</a>. , 20034-20037 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Suarez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Biology+Approach+for+Evaluating+the+Biological+Impact+of+Environmental+Toxicants+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro.</a> Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).</li>
<li>Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+alterations+in+mitochondrial+mass+and+function+characterize+different+models+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis.</a> Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+and+dATP-dependent+formation+of+Apaf-1%2Fcaspase-9+complex+initiates+and+apoptotic+protease+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade.</a> Cell. 91 (4), 479-489 (1997).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+%CE%B1+stimulates+AP-1+activity+through+prolonged+activation+of+the+c-jun+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase.</a> J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).</li>
<li>Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+in+rat+hippocampal+neurons%3A+selective+imaging+with+hydroethidine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine.</a> J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).</li>
<li>Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+glutathione+in+anchored+cells+with+monochlorobimane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane.</a> J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).</li>
<li>Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pardaxin+an+antimicrobial+peptide%2C+triggers+caspase-dependent+and+ROS-mediated+apoptosis+in+HT-1080+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells.</a> Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).</li>
<li>Bao, S., Knoell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+modulates+cytokine-induced+lung+epithelial+cell+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+Cytotoxicity+Profiling+Using+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening.</a> Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).</li>
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모든 저자 필립 모리스 인터내셔널의 직원입니다. 필립 모리스 인터내셔널은이 프로젝트의 자금 조달과 스폰서의 유일한 근원이다.

동물 실험의 대안에 대한 새로운 높은 처리량 테스트 방법에 대한 요구가 널리 지난 몇 년 동안 논의되어왔다. 이 밀접하게 표적 조직의 생리를 모방 세포 분석을 이용하여 표준 독성 시험에 대한 대체 방법을 조사하기 위해 과학자들과 규제 당국을 주도하고있다. 본 연구는 인간의 폐 상피 세포의 단일 CS 성분에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해 고 함량의 스크리닝 (HCS) 플랫폼 실시간 세포 분석기 (RTCA)를 조합의 적용을 설명했다. 이 설정은 유사 각종 공기 오염, 부유 입자 및 나노 입자에 의해 유도 된 세포 독성을 평가하기 위해 적용될 수있다. 또한, 얻어진 결과는 인과 생물학적 네트워크에 기초하여 전체 게놈 transcriptomics 및 계산 방법의 것과 일치 할 수있다. 이전에보고 된 바와 같이,이 방법은 분자 경로에 대한 데이터를 확증하기 위해 우리를 허용HCS 엔드 포인트와 CS 노출 5시 섭동, 또한 표현형이 경로의 교란을 해결. 흐름도 분석으로 실시간 세포 분석 량과 노출 시점 하류 분석 (14)에 대한 바람직한 수있다 나은 의사 결정을 할 수있는 투여 량 및 시간 의존적 해상도에서 세포 생존과 관련된 정보를 제공한다. 분석기의 원리들은 금 미세 덮여 배양 웰의 표면 상에 부착 확산으로 세포에 의해 생성 된 온 저항의 변화에​​ 의존한다. 임피던스 궁극적 형태 및 세포 생존, 확산, 세포 접착 성을 모니터링하는 데 사용할 수있는 셀 인덱스라는 무 차원 파라미터로 변환된다. 이 기술은 세포 독성 기전에 대한 정보를 제공하지 않지만, 감도에도 HCS 유익하지 않은 아주 낮은 용량에서 세포 형태의 변화를 검출 가능하게 (데이터는 보이지 않음). previ을 바탕으로OU를 실험, 우리는 RTCA 방법은 HCS 엔드 포인트에 비해 낮은 용량에서 형태 학적 변화를 감지 할 수 있다고 지적했다. 실시간 세포 분석기 초기 스크리닝 다음하는 HCS 플랫폼은 각 HPHC 의해 유도 독성의 종류에 대한보다 상세한 정보를 얻기 위해 사용되었다. 세포 구획에 미치는 잠재적 인 영향으로 HPHCs을 프로파일 허용 HCS 분석 패널 / 세포 기관뿐만 아니라 유전 독성 또는 산화 스트레스를 유도 사람들을 식별하는. 분석은 선택 HPHCs가 NHBE 세포에서 세포 독성을 유도함으로써 서로 다른 프로파일을 밝혔다. 일반적으로, 모든 화합물은 페놀을 제외하고 가장 높은 시험 용량으로 괴사를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 잠재적 인 유전 독성에 대한 마커로 H2AX의 암 발생 1 aminonaphtalene에 의한 인산화의 역할, 그러나 미토콘드리아 독성 판독이 HPHC의도 폭로 활동 HCS 패널 (질량 증가 시토크롬 C의 relea과 일치SE) 및 산화 스트레스 (GSH 고갈). 전술 한 바와 마찬가지로, 페놀 미토콘드리아의 기능 장애를 유발하고, DNA 손상과 GSH의 고갈을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 크롬 (VI), 그룹 I 발암 물질로 분류되는 화합물 중 하나, 및 크로톤은 모두 특히 크롬 (VI) 또한, 세포 사멸을 유도 (카스파 제 캐스케이드의 활성화) 및 크로톤에서 ROS 생성을 증가 야기 같은 유전 독성을 확인 하였다. 마지막으로 비소 (V)은, 스트레스 키나아제 경로의 활성화 마커 cJun 인산화를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 본 연구는 시험관 내에서 상피 세포 폐암 모델로 NHBE 세포를 이용했다. HCS 설정에서이 세포를 사용하는 것은 전례가 및 유전 독성 및 산화 스트레스 마커를 포함하는 엔드 포인트의 넓은 범위의 조사를 활성화. 생균 고정 세포 염색 방법 모두 전반적인 기술의 유연성을 보여 우리 프로토콜에서 설명 하였다. F에서행위는, 아주 동일한 프로토콜은 형광 염료 또는 항체의 사용에 의해 해결 될 수있는 대상의 넓은 범위에 적용될 수있다. 라이브 염색 프로토콜을 성공적으로 실행하기 위해, 상기 염료 중 일부가 한정된 반감기와 화상 획득이 완료되기 전에 감소 할 수 형광 신호를 같이 배양 시간을 존중하는 것이 중요하다. 이는 다른 세포 유형이 사용되면, 모든 염색 조건에 최적의 염료 농도, 재평가되어야하며 배양 시간은 상이 할 수 있음을 고려하는 것도 중요하다. 현재 논문에서는 다섯 화합물은 HCS 방법으로 상영 시나리오를 설명했다. 전술 플레이트 배치를 고려하면, 그들은 이에 이상의 화합물 또는 동시 스크리닝 수 24 판 (6 세이 2 시간 점) 판 국지적 수는 증가 될 수있는 총 2 개 이상의 서로 다른 플레이트 세트를 투여했다 inves의이상의 엔드 포인트의 tigation. 그렇게하기에 앞서 하나의 특정 종점 (GSH 및 ROS)이 즉시 획득을 필요로하는 것이 고려되어야하고, 그 결과, 판의 투여 이전 판의 획득을 허용하는 지그재그 방식으로 수행되어야한다. 플레이트는 이후 단계에서 염색 절차를 완료하기 위해, 정착 후의 어떤 단계에서 프로토콜을 방해하는, 적층 될 수있는 반면에, 고정 된 세포 염색 프로토콜을 사용하는 장점을 나타낸다. 이러한 접근법은, 예를 들면, 데이터의 품질을 손상시키지 않고 모든 생균 착색 판을 작성하는 시간과 운전자에게 제공한다. 상기 판의 수를 감소시킴으로써 흐름을 최적화하기 위해, 또한 서로 이상의 엔드 포인트를 다중화하는 것이 가능하다. 이 상황에 맞는 DNA 손상과 스트레스의 예를 들어 키나제 다른 C에서 방출 형광 색소로 간단하게이 차 항체를 사용하여 함께 조사 할 수있다hannels. 연속 전자동 셀 시드 화합물 희석 투여 및 염색 포함하는 HCS 플랫폼의 개발뿐만 아니라, 새로운 엔드 포인트의 첨가는 또한 상피에 HPHCs 및 다른 유형의 세포에 대한 강력한 프로파일 링 툴로서 HCS 플랫폼의 기능을 확장 할 .

독성 위험 평가는 역사적 생명 과학에 기초하지만, 또한 인간과 고비용으로 일관 번역 가능성 단점으로 연결되며, 동물 모델의 사용에 의존 하였다. 또한,는 &quot;3RS&quot;이 (대체, 감소 및 정제)의 정신에서 동물 실험의 대안을 찾을 수 증가 노력이 있었다. 이러한 노력은 지난 몇 년 동안 가속화되었다뿐만 아니라 때문에 특히 유럽 연합 (EU)의 높은 처리량 기술과뿐만 아니라, 때문에 동물 실험의 사용을 제한하는 법률의 시스템 생물학 접근 방식으로 최근의 진보,의. 욕설 독성에 대한 반응을 조절 세포 신호 전달 경로의 복잡성은 하나의 독성 엔드 포인트를 사용하여 특정 화합물의 독성 학적 근거를 설명하는 데 충분하지 않을 것이라는 것이 명백한다. 이를 위해 상호 P 수백 상호생물학적 네트워크에 기여 roteins도 고려 될 필요가있다. 이러한 네트워크에서 독성 물질의 효과를 연구하기 위해, 표현형 중간 및 높은 처리량 스크리닝 분석과 결합 시스템 독성 접근 역가를 추정 함과 동시에 각각의 독성 물질의 작용 기전에 대한 추가 정보를 제공하는 것이 유용하다. 본 연구에서는 취득 처리 및 특정 형광 기반 세포 분석으로부터 유도 된 화상 데이터를 분석 할 수있는 자동화 현미경 및 생물학적 소프트웨어 애플리케이션 구성되어 강력한 선별 도구으로 HCS를 사용. 이 단일 세포 또는 세포 내 수준에서 정량 셀 내의 시각적 인 변화를 허용하고, 다수의 파라미터가 동시에 분석한다. (3) 예를 들어, DNA 이중 가닥 나누기 히스톤 H2AX 인산화의 항체 - 기반 식별자를 사용하여 평가하고, 반응성 산소 종 (ROS)은 셀 파마하여 정량화eable 슈퍼 옥사이드 민감한 염료. 폐 상피 세포가 담배 연기를 포함하여 흡입 독성 물질,에 대해 첫 번째 생물학적 장벽을 나타 내기 때문에, 우리는 미국 식품의 약국 (FDA)에 의해 출판 HPHCs의 효과를 프로파일 체외 모델 1 차 기관지 상피 세포를 이용했다. 4이 원고의 후속이다 우리가 HPHCs의 다른 부분 집합의 생물학적 영향을 평가하는 이전의 연구 5 - 최대. 체외에서 세포 독성을 평가하는 워크 플로우의 일환으로, 우리는 처음에 우리가 다음 HCS에 적합한 용량 범위를 설정할 수 (RTCA) 시스템 임피던스 기반의 실시간 세포 분석을 사용하여, 15 HPHC의의 선택의 효능을 평가 분석 (그림 1). 다음 세포 독성 구 파라 메트릭 다중 엔드 포인트를 이용하여 수행 하였다 HCS 독성 평가는, 각각 두 개의 시점 (4 및 24 시간)에서 모니터. 표 1에 기재된 바와 같이 7 활성, 시토크롬 C 분리와 세포막 투과성 - 사용 된 마커는 미토콘드리아 독성, DNA 손상, 스트레스 키나아제 활성 산소 종 (ROS), 글루타치온 (GSH) 함량, 카스파 제 3 지시 하였다. 우리의 접근 가능 식별 및 투여 량 및 시간 의존적 샘플링 통해 담배 연기 성분의 효과의 특성화. 궁극적으로, 이것은 각 HPHC 대한 시험 관내 독성 프로파일을 만들었다. 멀티 오 믹스 방식은 상기 HCS 분석을 보완 할 수있다. 이것은 결국에는 세포 신호 및 / 또는 전사 수준에서의 효과의 깊은 이해를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS 리더</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td></td><td></td></tr> 05331625001 <tr><td>스크리너(HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY 카운터 TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plate VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA 프레임 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA 심장 온도 도구</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 씰러 호흡기</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>비흡연 60세 백인 남성 기증자&nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>웜 37 &deg; C 사용 전</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture 시약 키트</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>37°C에서 따뜻함; C 사용 전</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask 필터 캡 75&nbsp; cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 어세이 플레이트&nbsp; 블랙&nbsp;</td><td>코닝</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (원적외선 핵 염색용)</td><td>미</td><td></td>토콘드리아 염료DR50200 <td></td>생물학적 상태</tr><tr><td>: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>미토콘드리아 염료: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS 염료: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS 염료: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS 염료: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH 염료: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>독성</td></tr><tr><td>GSH 염료: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>독성</td></tr><tr><td>막 투과성 염료: YO-PRO-1&nbsp;</td><td>생활 기술</td><td>Y3603</td><td>짜증나는&nbsp;</td></tr><tr><td>막 투과성 염료: TO-PRO-1&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>T3602</td><td>짜증나는&nbsp;</td></tr><tr><td>막 투과성 염료: TOTO-1&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>T3600</td><td>짜증나는&nbsp;</td></tr><tr><td>카스파제 염료: Cellevent 카스파스 3/7 그린</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>C10423</td><td>자극성&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrome C 항체 (마우스)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-c-Jun 항체 (마우스)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-H2AX 항체 (마우스)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 650&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x 투과화 완충액</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% 포름알데히드 용액</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>독성</td></tr><tr><td>10x 차단 완충액</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>시그마</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>행크스 밸런스드 솔트 솔루션</td><td>시그마</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>스타우로스포린</td><td>시그마</td><td>S4400</td><td>독성</td></tr><tr><td>발리노마이신</td><td>시그마</td><td>V0627</td><td></td></tr><tr><td>독성 파라콰트</td><td>시그마</td><td>36541</td><td>독성</td></tr><tr><td>아니소마이신</td><td>시그마</td><td>A9789</td><td>독성</td></tr><tr><td>에타아크릴산</td><td>시그마</td><td>E4754</td><td>독성</td></tr><tr><td>1-아미노나프탈렌</td><td>시그마</td><td>34390</td><td>독성</td></tr><tr><td>2-니트로프로판</td><td>시그마</td><td>130265</td><td>독성</td></tr><tr><td>아세트아미드</td><td>시그마</td><td>695122</td><td>독성</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마</td><td>650501</td><td>독성</td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>시그마</td><td>A9099</td><td>독성</td></tr><tr><td>비소(V)</td><td>시그마</td><td>A6756</td><td>유독</td></tr><tr><td>벤젠</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>독성</td></tr><tr><td>크롬 (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>독성</td></tr><tr><td>크로톤알데히드</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>독성</td></tr><tr><td>메틸 에틸 케톤</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>독성</td></tr><tr><td>니켈&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>독성</td></tr><tr><td>니트로벤젠</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>독성</td></tr><tr><td>페놀</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>독성</td></tr><tr><td>퀴놀린</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>독성</td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>독성</td></tr></tbody></table>

유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분의 독성 효과를 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 분석 (hphc)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

담배 연기 (CS)은 심혈관 및 폐 질환의 주요 위험 인자이다. CS는 전반적인 독성 개별 구성 요소의 기여를 평가하기 위해 도전 1 7,000 개 이상의 화학 물질을 포함하는 복잡한 에어로졸이기 때문이다. 미국 식품의 약국에 의해 정의 된 개별 구성 요소뿐만 아니라 혼합물의 독성 프로파일 그러나, 관통 넣어 담배 연기의 유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분 (HPHCs)의 프로파일 링을 가능하게 선별 도구, 높은 적용하여, 시험관 내에서 설정 될 수있다 청 (FDA). (2) 초기 평가, 임피던스 기반 장비가 화합물의 독성을 실시간으로, 라벨없는 평가에 사용 하였다. 기기의 판독은 모두 함께 세포 상태의 개요를 제공하는 세포 접착, 생존 및 형태에 의존합니다. 셀 인덱스라는 차원 매개 변수는, 정량에 사용됩니다. DIF의 집합ferent 염색 프로토콜은 형광 이미징 기반 조사 개발 및 HCS 플랫폼은 각 HPHC 의해 유도 독성의 종류에 대한보다 상세한 정보를 얻기 위해 사용되었다. 그들은 계산 가능한 LD 50 (&lt;20 mm)를 등록 된 시험 15 성분 중 다섯은 HCS 기반 분석을 위해 선정되었다. 이들은 1 aminonaphtalene, 비소 (V), 크롬 (VI), 크로톤 알데히드 및​​ 페놀을 포함했다. HCS에 미치는 영향에 기초하여, 1 aminonaphtalene 페놀이 증가 히스톤 H2AX 인산화에 기초 유전 독성과 같은 크롬 (VI)와 함께, 미토콘드리아의 기능 장애를 유도하는 것으로 확인 될 수있다. 크로톤은 스트레스 키나아제 경로 활성제로서 산화 스트레스 유발 비소로 확인되었다. 본 연구는 임피던스 기반 HCS 기술의 조합 CS 성분의 시험 관내 평가를위한 강력한 수단을 제공한다는 것을 보여준다.

RTCA 독성 효과가 감지되지 않을 때 HCS 엔드 포인트가 유익하지 않기 때문에, 표시되지 화합물은 HCS (그림 3b, C, D, G, K, L, m에 의해 테스트되지 않은 RCTA에서 가장 높은 농도로 세포 생존 능력의 최대 감소 쪽). 화합물 보여주는 만 높은 농도에서 세포 생존 능력을 감소 (그림 3E는 오)도 HCS에 대한 선택이 취소됩니다. 마지막으로, 계산 가능한 LD 50 (&lt;20 mM)을 가진 성분 만 더 HCS 분석 (도 3a, F, H, J, N)에 대해 선택된다. 위의 기준을 충족 HPHCs은 다음과 같습니다 : 1 aminonaphtalene, 비소 (V), 크롬 (VI), 크로톤 알데히드와 페놀. HCS 품질 검사 (QC)으로, 양성 대조군은 파이입니다RST 정확하게 수행되는 오염 절차를 보장하기 위해 분석 하였다. 양성 대조군 처리 된 세포의 대표적인 이미지가도 6에 도시한다. 데이터 값은 상술 한 바와 같이 차량에 대해 정규화된다. 어떤 용량 - 반응 곡선은 세 가지 용량이 테스트로 그려되지 않고 모든 세 가지 용량마다 시간이 시점에서 고려하지. 적절한 반응은 4 시간에서 24 시간 모두에서 각 포인트에 대해 관찰되도록 양성 대조군 용량이 선택 (이전 실험에 기초하여, 데이터는 도시하지 않음). 특정 투여 량으로도 1 및도 2는 용량 (2, 3)은 24 시간의 효과를 평가하기 위해 사용되는 동안 4 시간의 효과를 평가하기 위해 사용된다. 응답이 양성 대조군 투약 관찰되지 않으면 플레이트는 파기된다. 미토콘드리아 막 전위 및 GSH 함량​​을 제외한 모든 엔드 포인트에 대한 신호 강도의 증대가 예상되고 있습니다. 페놀을 제외한 모든 화합물은,하는 괴사 pheno을 유도<html> 유형 증가 세포막 투과성 (도 7a, F, H, L)에 기초하여. 1 aminonaphtalene, 크롬 (VI)을, 크로톤 알데히드 및 페놀 증가 히스톤 H2AX의 인산화 (도 7E, J, N, P)에 기초하여 유전 독성 인 것으로 확인되었다. 페놀과 1 aminonaphtalene은 심각한 미토콘드리아 기능 장애 1 aminonaphtalene으로 증가 시토크롬 C 릴리스 (그림 7C)되었다 (도 7b, 오)를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 증가 카스파 3/7 활동의 검출은 크롬 노출시 세포 사멸 사건의 증거를 제공했다. 산화 스트레스 유도 (ROS 또는 GSH)도 1 aminonaphtalene, 크로톤 알데히드와 페놀 (그림 7D, m, Q) 치료에 검출되었다. 전사 인자 cJun (도 7g)의 인산화 증가에 의해 입증 된 바와 같이 마지막으로, 비소 세포 스트레스를 유발한다. 로드 / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. 화합물 독극물-프로파일 러는 워크 플로우.가) 워크 플로우의 도식은이 연구에서 따랐다. 우선, 용량 범위 연구 결과는 후속 HCS는 화합물 특이 적 독성 프로파일. b) 연구 실험 설계를 특성화하기위한 적절한 투여 량을 선택 RTCA 플랫폼을 이용하여 수행 하였다. HCS 엔드 포인트는 4 조사하고 24 시간 투여 후. 한 반면, 24 시간 시딩 후, 세포를 투여하고, 임피던스 값은 계속해서 다음 24 시간 동안 모니터링 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> 도 2 RTCA 노출 접시. 화합물 마스터 플레이트는 제 5 단계 1시 10분 일련의 희석을 수행하여 생성된다. 각 화합물,(용량 0) 차량 제어를 포함하는 다음 컨트롤과 같은 매체 및 스타 우로 스포린과 함께 노광 판 중으로 첨가 하였다. 차량 컨트롤이 행 번호 7에있는 동안 순서가 전송에 유지되는 용량은 최고 용량은 행 번호 1 참고 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> 도 3 주제 RTCA 세포 생존 결과. a) -1- aminonaphtalene, b) -2- 니트로 프로판, C) 아세트 아미드, d) 아세톤, E) 아크릴 아미드, F) 비소 (V), g) 벤젠, h)에 크롬 (VI) , j)의 크로톤 알데히드, k)를 메틸 에틸 케톤, L) NickeL (II), m) 니트로 벤젠, N) 페놀, O) 퀴놀린, P)을 톨루엔. 24 시간 후 투여에서, 곡선 (AUC) 아래의 면적은 0 내지 0의 활성을 반영 -100 % 활성 (Y 축)에 대한 범위 및 정규화 (양성 대조군 및 비히클 포함) 각 용량에 대해 계산 된 비히클 및 양성 대조군의 -100. 값들은 플롯하고 4- 파라미터 힐 방정식 가능한, LD (50)는 계산을 이용하여 부착 하였다. 농도를 로그 스케일 (x 축)에 표현된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> 그림 4. HCS 분석 실험에 대한 긍정적 인 제어 화합물에 대한 희석 계획. 긍정적 인 컨트롤) 추가 및했습니다시리얼 희석 판. b)는 양성 대조군 용액을 희석. c) 200X 양성 대조군 투약. DE) 배지 (1시 40분의 200X 양성 대조군 량의 희석)에 hicle는 5 배 용량을 포함하는 양성 대조군 플레이트를 생성한다. ) 각각의 투여가 노출 판의 최종 레이아웃을 반영하기 위해 삼중에 희석되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> 도 5 HCS 노출 접시. 화합물 마스터 플레이트는 제 5 단계 희석을 행함으로써 생성된다. 차량 제어 각각 포함하는 화합물 (복용량 0) 후 양성 대조군과 함께 노광 판 중으로 첨가 하였다. , 복용량의 주문이 전달에 유지합니다차량 컨트롤이 행 번호 7에있는 동안 가장 높은 용량은 행 번호 1에있는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> 항체 또는 염료 염색 된 세포의 그림 6. 대표 형광 사진 A) 핵 매개 변수 - 핵 염료 :. 라이브 또는 고정 세포에서 DNA에 결합하는 투과 염료. 이 얼룩 핵 영역 라벨링 개별 셀을 식별하기 위해 사용된다 b) 괴사 - 세포막 투과성 염료 :. 세포막 무결성 염료 계 검출. 시약 세포막에 본질적으로 불 투과성이다. 괴사 동안, 멤브레인은 투과되고 염료 셀 들어가 강한 형광의 제조 DNA 결합. ignal C) 세포 사멸 - 사이토 크롬 C : 시토크롬 C의 출시 초기 세포 사멸의 잘 알려진 특징의 항체 기반의 탐지. 세포 사멸의 유도에 따라, 시토크롬 C는 미토콘드리아에서 해제되고 핵 D) DNA 손상에 확산 - pH2AX :.. 히스톤 H2AX의 인산화의 항체 기반의 탐지, 이중 가닥 DNA 나누기의 잘 알려진 특징 전자) 스트레스 키나제 - cJun :. 빼앗아-73 cJun의 세포 스트레스의 잘 알려진 특징에서 인산화의 항체 기반 탐지 f)의 산화 적 스트레스 - DHE : 슈퍼 옥사이드 라디칼의 염료 기반 탐지. . 무료 GSH 분자의 염료 기반 감지 : mBcl - 산화 된 형태의 에티 디움은 DNA 인터 g에 따라 빨간색 형광 동안 Dihydroethidium 자체는 GSH) 세포질에서 파란색 형광. mBcl는에 GSH와 반응. 카스파 제 3/7 활동의 염료 기반 감지 : 카스파 3/7 활성화 - 높은 형광 제품 시간) 세포 사멸을 생성합니다. 시약은 DNA 결합을 저해하는 네 개의 아미노산 펩티드와 비 형광등이다. 카스파 7분의 3 활성화되면, 펩티드는 DNA에 결합하여 밝은 형광 반응을 생성하기 위해 염료를 분해 가능하게되어있다. 패널은 긍정적 인 제어 처리 된 세포를 표시 BH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> 그림 7. 대표 HCS 결과. 1 aminonaphtalene (AE), 비소 (V)의 (f 및 g), 크롬 (VI) (홍콩), 크로톤 알데히드 (LN) 및 페놀 (OQ). 4 시간 (파란 선)과24 시간 (오렌지 라인)의 신호는 각각의 용량에 대해 계산 된 차량 활동 (0 %)로 정규화 하였다. 커브 피팅 계산에 포함되지 않은 값은 회색으로 표시됩니다. 농도를 로그 스케일 (x 축)에 표현된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시험 </td><td> 엔드 포인트 # </td><td> 생물 엔드 포인트 </td><td> 셀룰러 구획 </td><td> 출력 기능 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 세포 독성 </td><td> 1 </td><td> 미토콘드리아 질량 (6) </td><td> 세포질 </td><td> 스팟 평균 면적 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 미토콘드리아 막 전위 (6) </td><td> 세포질 </td><td> 스팟 평균 강도 </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> 사이토 크롬 C 출시 <sup&gt; 7 </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 세포막 투과성 8 </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> DNA 손상 </td><td> (5) </td><td> 포스 H2AX 9 </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> 스트레스 키나제 </td><td> 6 </td><td> 포스 cJun (10) </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> (7) </td><td> ROS (11) </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> GSH 콘텐츠 </td><td> 8 </td><td> GSH (12) </td><td> 세포질 </td><td> 스팟 평균 강도 </td></tr><tr><td> 세포 사멸 </td><td> 9 </td><td> 카스파 제 3 (13) </td><td> 세포질 </td><td> 스팟 평균 강도 </td></tr></tbody></table> HCS (a)의 표 1. 목록ssays 및 엔드 포인트. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> 차량 </td><td colspan="6" rowspan="2"> RTCA 량 (μM) </td><td rowspan="2"> LD (50) </td><td colspan="5"> HCS 량 </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> 세포 생존 선택 (μM) </td><td> 3R4F (㎚) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1 Aminonaphtalene </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 280 μM </td><td> 2,000 </td><td> (500) </td><td> (200) </td><td> (150) </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2- 니트로 프로판 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 아세트 아미드 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 아세톤 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 아크릴 아미드 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 비소 (V) </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 160 μM </td><td> (200) </td><td> (100) </td><td> (50) </td><td> (25) </td> &lt;TD&gt; 0.17 </td></tr><tr><td colspan="2"> 벤젠 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 크롬 (VI) </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 20 μM </td><td> (100) </td><td> (50) </td><td> (20) </td><td> (10) </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td colspan="2"> 크로톤 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 200 μM </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 2,000 </td></tr><tr><td colspan="2"> 메틸 에틸 케톤 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt;20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 니켈 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 니트로 벤젠 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 페놀 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 2300 μM </td><td> 5,000 </td><td> 2,000 </td><td> 1,000 </td><td> (500) </td><td> (240) </td></tr><tr><td colspan="2"> 퀴놀린 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td&gt; <td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 톨루엔 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. 치료의 24 시간에서 상대 LD (50) 테스트 HPHC 화합물의 목록입니다. HCS 분석을 위해 선택된 화합물은 주황색으로 강조하고 테스트 용량도 제공됩니다. 3R4F 용량은 기준 담배 3R4F에서 한 스틱의 연기 성분의 양은 동일합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시험 </td><td> 화합물 </td><td> 원액 </td><td> 용제 </td&gt; <td colspan="3"> 투여 량 (들) (μM) </td></tr><tr><td> 세포 생존 </td><td> 스타 우로 스포린 </td><td> 10 mM의 </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> (50) </td></tr><tr><td> 세포 독성 </td><td> 발리 노마 이신 (Valinomycin) </td><td> 10 mM의 </td><td> DMSO </td><td> (50) </td><td> (20) </td><td> (5) </td></tr><tr><td> DNA 손상 </td><td> 파라콰트 </td><td> 100 밀리미터 </td><td> DMSO </td><td> (500) </td><td> (200) </td><td> (50) </td></tr><tr><td> 스트레스 키나제 </td><td> 소마 이신 </td><td> 2 밀리미터 </td><td> DMSO </td><td> (10) </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 로테 </td><td> 200 밀리미터 </td><td> DMSO </td><td> 1,000 </td><td> (400) </td><td> (100) </td></tr><tr><td> GSH 콘텐츠 </td><td> 에타 크린 산 </td><td> 200 밀리미터 </td><td> DMSO </td><td> 1,000 </td><td> (400) </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 세포 사멸 </td><td> 스타 우로 스포린 </td><td> 40 mM의 </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ TD&gt; <td> (50) </td><td> (20) </td></tr></tbody></table> 각 분석에 사용 긍정적 인 통제와 농도 표 3. 목록.

이 연구의 목적은 임피던스 기반 실시간 세포 분석기와 체외 독성 평가를 위한 HCS(High-Content Screening) 기반 플랫폼의 조합을 사용하여 15가지 담배 연기 성분의 생물학적 영향을 평가하는 것이었습니다. 이 연구는 테스트된 화합물의 효과적인 용량, 독성 및 작용 모드에 대한 정보를 제공합니다.

유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분의 독성 효과를 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 분석 (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

임피던스 기반 실시간 세포 분석기와 High Content Screening 기반 플랫폼을 결합한 이 접근 방식의 전반적인 목표는 효과적인 용량, 독성 및 생물학적 영향에 대한 정보를 제공하여 테스트된 화합물의 Tox Profile을 얻는 것입니다. 이 접근 방식은 독성학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 세포독성(cytotoxiticity), 유전독성(genotoxicity) 및 세포 스트레스 반응(cellular stress response)을 다룹니다.또한 여러 생화학적 및 형태학적 매개변수에 대한 정보를 동시에 제공할 뿐만 아니라 다양한 세포 유형 및 세포 배양 모델에도 적용할 수 있습니다. 관할권 및 제한으로 인해 전체 접근 방식은 짧은 화합물 조각만 평가하는 동안 수행됩니다. 같은 이유로, High Content Screening Assessment를 입증하기 위해 하나의 프로토콜만 표시됩니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Stefano Acali와 Alexander Laurent입니다. 정상적인 인간 기관지 상피 세포 또는 NHBE 세포를 보려면 임피던스 측정의 수와 지속 시간을 정의하도록 기기를 프로그래밍하십시오. 이 연구에서는 48시간 동안 15분마다 데이터가 기록됩니다.50마이크로리터의 예열된 매체를 96웰 RTCA 플레이트의 각 웰에 피펫팅하여 플레이트 배경을 측정합니다. 이 단계는 기기가 셀 기반 계산의 기준 참조로 사용할 매체 전기 저항을 계산하기 위한 기술 요구 사항을 나타냅니다. 다음으로, 밀리리터당 144, 000 세포의 농도로 50마이크로리터의 세포 현탁액을 RTCA 플레이트의 각 웰에 이미 있는 배지에 추가합니다.세포가 가열되면 세포가 부착되어 균일한 세포 분포를 얻을 수 있도록 플레이트를 실온에 40분 동안 두는 것이 매우 중요합니다. 인큐베이터의 크래들에서 RTCA 플레이트를 배양하고 투여 전 24시간 동안 2시간 동안 데이터를 기록하기 시작합니다. 양성 대조군의 경우, 10 밀리몰 스타우로스포린 스톡 용액을 DMSO에서 1 대 10으로 희석합니다.195마이크로리터의 매체에 5마이크로리터의 희석액을 첨가하여 5배 작동하는 용액을 얻습니다. 유해하고 잠재적으로 유해한 성분의 경우 각 성분을 차량에 용해시켜 1몰 용액을 생성합니다. 그런 다음 각 테스트 물질 원액을 1에서 10까지 매체로 희석하여 100 밀리몰 용액을 생성합니다.B에서 F에 우물에 있는 10%vehicle 플러스 매체를 첫째로 추가해서 합성 주된 판을 생성하고, 좋은 A.Perform에 있는 100 millimolar 해결책은 5x 작동 해결책을 얻기 위하여 5개 단계, 1개에서 10의 연속되는 희석을 생성한다. 투여를 위해 RTCA 기기를 일시 중지하고 크래들을 열어 노출 플레이트를 제거한 다음 임피던스 측정에 영향을 줄 수 있는 셀 냉각을 방지하기 위해 플레이트를 RTCA 온도 도구에 놓습니다. Compound Master plate에서 25μl의 5x 용액을 Compound Master Plate와 동일한 투여 순서를 유지하면서 세포에 3회 첨가합니다.기존 세포 배양 배지를 제거하지 마십시오. 그런 다음 기존 배양 배지를 제거하지 않고 하단 행의 오른쪽 절반에 있는 세포에 25마이크로리터의 5x Positive control 용액을 추가합니다. 마찬가지로, 25마이크로리터의 매체를 맨 아래 행의 왼쪽 절반에 있는 셀에 추가합니다.플레이트 실러로 플레이트를 밀봉한 후 플레이트를 RTCA 크래들에 다시 놓고 잠급니다. 원하는 노출 시간 동안 데이터 기록을 다시 시작합니다. 데이터 기록 후 RTCA 세포 생존도 데이터를 분석하여 HCS 분석에 사용할 시험 물질을 결정합니다.이 실험에서는 HCS 분석을 위해 1-아미노나프탈렌, 비소, 크롬 및 크로톤알데히드를 선택합니다. NHBE 세포를 보려면 120, 밀리리터당 000개의 세포에서 100마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 블랙 플레이트의 각 웰에 추가합니다. HCS 플레이트를 실온에서 30분 동안 방치한 후 세포가 웰에 부착될 수 있도록 투여 전에 섭씨 37도, 5%CO2에서 24시간 동안 배양합니다.양성 대조군의 경우, 2열에 있는 각 양성 대조군의 원액 40마이크로리터를 분배합니다. 그런 다음 3열과 5열에 차량 20마이크로리터를 분배합니다. 및 40 마이크로 리터의 차량 4 열.2열의 우물에서 12마이크로리터를 빼내고 3열의 우물에 분배하고 혼합합니다. 각 양성 대조군 화합물에 대한 3회 투여량과 비히클을 포함한 최종 연속 희석이 얻어질 때까지 계속합니다. 양성 대조 플레이트를 생성하려면 3 회 용량 및 차량의 매체에 1-40 희석액을 준비하십시오.복합 마스터 플레이트를 만들려면 각 테스트 물질 원액을 100 밀리몰 농도에 대해 매체에서 1-10 개로 다시 현탁시키고 희석합니다. 각 테스트 물질에 대해 선택한 5배 용량을 얻기 위해 10% 차량과 함께 매체를 사용하여 희석을 수행합니다. 이제 positive control과 compound plate 모두 노출 플레이트에 투여할 준비가 되었습니다.다음으로, Compound master plate에서 25μl의 5x 용액을 Compound master plate와 동일한 투여 순서를 유지하면서 세포에 3회 추가합니다. 기존 세포 배양 배지를 제거하지 마십시오. 그런 다음 Positive control plate에서 25μl의 5x 용액을 Positive control plate와 동일한 투여 순서를 유지하면서 맨 아래 줄의 셀에 추가합니다.text protocol에 설명된 대로 충분한 양의 live-cell staining solution을 준비합니다. 그런 다음 공급업체의 지침에 따라 미토콘드리아 염료와 멤브레인 투과성 염료를 모두 라이브 셀 염색 용액에 희석합니다. 50마이크로리터의 살아있는 세포 염색 용액을 세포 독성 분석으로 지정된 플레이트의 각 웰에 추가합니다.세포 배양 배지를 제거하지 말고 섭씨 37도, 5%CO2에서 30분 동안 배양합니다. 배지와 염색 용액을 부드럽게 흡인하고 각 웰에 100마이크로리터의 고정 용액을 추가합니다. 그런 다음 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.배양 후 고정 용액을 부드럽게 흡인하고 세척 버퍼 웰당 100마이크로리터로 한 번 세척합니다. 세척 버퍼를 제거하고 각 웰에 1x 투과 완충액 100마이크로리터를 추가한 후 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 투과 완충액을 흡입하고 웰당 100마이크로리터의 세척 완충액으로 플레이트를 두 번 세척합니다.그런 다음 세척 버퍼를 흡입하고 각 웰에 100마이크로리터의 1x 블로킹 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. 항 사이토크롬 C 항체를 1-250으로 1차 항체 용액에 희석합니다.다음으로, 차단 완충액을 흡입하고 각 웰에 웰당 50마이크로리터의 Primary Antibody Solution을 첨가한 후 어두운 곳에서 실온에서 60분 동안 배양합니다. anti-mouse 항체를 1에서 500까지 2차 항체와 핵 용액에 희석합니다. 또한 핵염료를 1 내지 1, 000으로 Secondary Antibody and Nuclear Solution에 희석한다.Primary Antibody Solution을 흡입한 후 플레이트 세척기를 사용하여 웰당 100마이크로리터의 세척 버퍼로 플레이트를 3회 세척합니다. 세척 버퍼를 흡입하고 플레이트의 각 웰에 웰당 50마이크로리터의 2차 항체 및 핵 용액을 추가합니다. 이제 어두운 곳에서 실온에서 60분 동안 플레이트를 배양합니다.Secondary Antibody and Nuclear Solution을 흡인한 후 플레이트 세척기를 사용하여 웰당 100마이크로리터의 세척 버퍼로 플레이트를 세 번 세척합니다. 그런 다음 웰당 100마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 이제 플레이트를 HCS 기기에서 평가할 준비가 되었으며 수집이 시작됩니다.시험물질 처리의 대표적인 RTCA cell viability 결과를 보여줍니다. 독성 용량 의존적 효과는 1-아미노나프탈렌, 비소, 크롬 및 크로톤알데히드에 대해서만 24시간 동안 노출되면 얻어지며, 모두 20밀리몰 미만의 계산된 LD50을 표시했습니다. 다른 화합물에는 독성 효과가 나타나지 않았습니다.여기에 보이는 것은 1-아미노나프탈렌 치료에 대한 대표적인 HCS 결과입니다. 1-아미노나프탈렌의 독성 효과는 세포막에 심각한 손상을 유발하여 노출 4시간 후 용량 의존적 방식으로 세포막 투과성을 증가시킵니다. 이 화합물은 또한 미토콘드리아에 영향을 미쳐 노출 4시간 후 질량 증가를 유도하고 시토크롬 C의 방출과 함께 노출 4시간 및 24시간 후에 핵에서 검출될 수 있습니다.이 기술은 일단 숙달되면 2-3일 이내에 실행할 수 있으며, 대부분의 경우 설정 및 투여에 하루에 약 한 시간의 실습 시간이 필요하기 때문입니다. 선택한 프로토콜에 따라 High Content Screening은 전체 염색 절차를 실행하는 데 최대 3시간 및 1/2시간이 소요됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 더 넓은 범위의 끝점을 선택하면 워크플로가 복잡해지지만 시간이 크게 증가하지는 않는다는 점에 유의해야 합니다.최적의 작업 흐름을 통해 실제로 여러 플레이트를 동시에 평가할 수 있습니다. 완전 자동화된 세포 설정, 화합물 희석, 투여 및 염색, 새로운 종말점 추가를 포함한 High Content Screening Platform의 지속적인 개발은 독성 프로파일링을 위한 강력한 도구로서 High Content Screening Platform의 기능을 더욱 확장할 것입니다. 또한, 이러한 높은 처리량에서 여러 단일 독성 종말점의 조합은 동물 실험을 줄이기 위한 우리의 노력에서 한 걸음 더 나아갈 것입니다.

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생물학

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