유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분의 독성 효과를 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 분석 (HPHC)
2016년 5월 10일
이 연구의 목적은 임피던스 기반 실시간 세포 분석기와 체외 독성 평가를 위한 HCS(High-Content Screening) 기반 플랫폼의 조합을 사용하여 15가지 담배 연기 성분의 생물학적 영향을 평가하는 것이었습니다. 이 연구는 테스트된 화합물의 효과적인 용량, 독성 및 작용 모드에 대한 정보를 제공합니다.
임피던스 기반 실시간 세포 분석기와 High Content Screening 기반 플랫폼을 결합한 이 접근 방식의 전반적인 목표는 효과적인 용량, 독성 및 생물학적 영향에 대한 정보를 제공하여 테스트된 화합물의 Tox Profile을 얻는 것입니다. 이 접근 방식은 독성학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 세포독성(cytotoxiticity), 유전독성(genotoxicity) 및 세포 스트레스 반응(cellular stress response)을 다룹니다.
또한 여러 생화학적 및 형태학적 매개변수에 대한 정보를 동시에 제공할 뿐만 아니라 다양한 세포 유형 및 세포 배양 모델에도 적용할 수 있습니다. 관할권 및 제한으로 인해 전체 접근 방식은 짧은 화합물 조각만 평가하는 동안 수행됩니다. 같은 이유로, High Content Screening Assessment를 입증하기 위해 하나의 프로토콜만 표시됩니다.
이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Stefano Acali와 Alexander Laurent입니다. 정상적인 인간 기관지 상피 세포 또는 NHBE 세포를 보려면 임피던스 측정의 수와 지속 시간을 정의하도록 기기를 프로그래밍하십시오. 이 연구에서는 48시간 동안 15분마다 데이터가 기록됩니다.
50마이크로리터의 예열된 매체를 96웰 RTCA 플레이트의 각 웰에 피펫팅하여 플레이트 배경을 측정합니다. 이 단계는 기기가 셀 기반 계산의 기준 참조로 사용할 매체 전기 저항을 계산하기 위한 기술 요구 사항을 나타냅니다. 다음으로, 밀리리터당 144, 000 세포의 농도로 50마이크로리터의 세포 현탁액을 RTCA 플레이트의 각 웰에 이미 있는 배지에 추가합니다.
세포가 가열되면 세포가 부착되어 균일한 세포 분포를 얻을 수 있도록 플레이트를 실온에 40분 동안 두는 것이 매우 중요합니다. 인큐베이터의 크래들에서 RTCA 플레이트를 배양하고 투여 전 24시간 동안 2시간 동안 데이터를 기록하기 시작합니다. 양성 대조군의 경우, 10 밀리몰 스타우로스포린 스톡 용액을 DMSO에서 1 대 10으로 희석합니다.
195마이크로리터의 매체에 5마이크로리터의 희석액을 첨가하여 5배 작동하는 용액을 얻습니다. 유해하고 잠재적으로 유해한 성분의 경우 각 성분을 차량에 용해시켜 1몰 용액을 생성합니다. 그런 다음 각 테스트 물질 원액을 1에서 10까지 매체로 희석하여 100 밀리몰 용액을 생성합니다.
B에서 F에 우물에 있는 10%vehicle 플러스 매체를 첫째로 추가해서 합성 주된 판을 생성하고, 좋은 A.Perform에 있는 100 millimolar 해결책은 5x 작동 해결책을 얻기 위하여 5개 단계, 1개에서 10의 연속되는 희석을 생성한다. 투여를 위해 RTCA 기기를 일시 중지하고 크래들을 열어 노출 플레이트를 제거한 다음 임피던스 측정에 영향을 줄 수 있는 셀 냉각을 방지하기 위해 플레이트를 RTCA 온도 도구에 놓습니다. Compound Master plate에서 25μl의 5x 용액을 Compound Master Plate와 동일한 투여 순서를 유지하면서 세포에 3회 첨가합니다.
기존 세포 배양 배지를 제거하지 마십시오. 그런 다음 기존 배양 배지를 제거하지 않고 하단 행의 오른쪽 절반에 있는 세포에 25마이크로리터의 5x Positive control 용액을 추가합니다. 마찬가지로, 25마이크로리터의 매체를 맨 아래 행의 왼쪽 절반에 있는 셀에 추가합니다.
플레이트 실러로 플레이트를 밀봉한 후 플레이트를 RTCA 크래들에 다시 놓고 잠급니다. 원하는 노출 시간 동안 데이터 기록을 다시 시작합니다. 데이터 기록 후 RTCA 세포 생존도 데이터를 분석하여 HCS 분석에 사용할 시험 물질을 결정합니다.
이 실험에서는 HCS 분석을 위해 1-아미노나프탈렌, 비소, 크롬 및 크로톤알데히드를 선택합니다. NHBE 세포를 보려면 120, 밀리리터당 000개의 세포에서 100마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 블랙 플레이트의 각 웰에 추가합니다. HCS 플레이트를 실온에서 30분 동안 방치한 후 세포가 웰에 부착될 수 있도록 투여 전에 섭씨 37도, 5%CO2에서 24시간 동안 배양합니다.
양성 대조군의 경우, 2열에 있는 각 양성 대조군의 원액 40마이크로리터를 분배합니다. 그런 다음 3열과 5열에 차량 20마이크로리터를 분배합니다. 및 40 마이크로 리터의 차량 4 열.
2열의 우물에서 12마이크로리터를 빼내고 3열의 우물에 분배하고 혼합합니다. 각 양성 대조군 화합물에 대한 3회 투여량과 비히클을 포함한 최종 연속 희석이 얻어질 때까지 계속합니다. 양성 대조 플레이트를 생성하려면 3 회 용량 및 차량의 매체에 1-40 희석
액을 준비하십시오.복합 마스터 플레이트를 만들려면 각 테스트 물질 원액을 100 밀리몰 농도에 대해 매체에서 1-10 개로 다시 현탁시키고 희석합니다. 각 테스트 물질에 대해 선택한 5배 용량을 얻기 위해 10% 차량과 함께 매체를 사용하여 희석을 수행합니다. 이제 positive control과 compound plate 모두 노출 플레이트에 투여할 준비가 되었습니다.
다음으로, Compound master plate에서 25μl의 5x 용액을 Compound master plate와 동일한 투여 순서를 유지하면서 세포에 3회 추가합니다. 기존 세포 배양 배지를 제거하지 마십시오. 그런 다음 Positive control plate에서 25μl의 5x 용액을 Positive control plate와 동일한 투여 순서를 유지하면서 맨 아래 줄의 셀에 추가합니다.
text protocol에 설명된 대로 충분한 양의 live-cell staining solution을 준비합니다. 그런 다음 공급업체의 지침에 따라 미토콘드리아 염료와 멤브레인 투과성 염료를 모두 라이브 셀 염색 용액에 희석합니다. 50마이크로리터의 살아있는 세포 염색 용액을 세포 독성 분석으로 지정된 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
세포 배양 배지를 제거하지 말고 섭씨 37도, 5%CO2에서 30분 동안 배양합니다. 배지와 염색 용액을 부드럽게 흡인하고 각 웰에 100마이크로리터의 고정 용액을 추가합니다. 그런 다음 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.
배양 후 고정 용액을 부드럽게 흡인하고 세척 버퍼 웰당 100마이크로리터로 한 번 세척합니다. 세척 버퍼를 제거하고 각 웰에 1x 투과 완충액 100마이크로리터를 추가한 후 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 투과 완충액을 흡입하고 웰당 100마이크로리터의 세척 완충액으로 플레이트를 두 번 세척합니다.
그런 다음 세척 버퍼를 흡입하고 각 웰에 100마이크로리터의 1x 블로킹 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. 항 사이토크롬 C 항체를 1-250으로 1차 항체 용액에 희석합니다.
다음으로, 차단 완충액을 흡입하고 각 웰에 웰당 50마이크로리터의 Primary Antibody Solution을 첨가한 후 어두운 곳에서 실온에서 60분 동안 배양합니다. anti-mouse 항체를 1에서 500까지 2차 항체와 핵 용액에 희석합니다. 또한 핵염료를 1 내지 1, 000으로 Secondary Antibody and Nuclear Solution에 희석한다.
Primary Antibody Solution을 흡입한 후 플레이트 세척기를 사용하여 웰당 100마이크로리터의 세척 버퍼로 플레이트를 3회 세척합니다. 세척 버퍼를 흡입하고 플레이트의 각 웰에 웰당 50마이크로리터의 2차 항체 및 핵 용액을 추가합니다. 이제 어두운 곳에서 실온에서 60분 동안 플레이트를 배양합니다.
Secondary Antibody and Nuclear Solution을 흡인한 후 플레이트 세척기를 사용하여 웰당 100마이크로리터의 세척 버퍼로 플레이트를 세 번 세척합니다. 그런 다음 웰당 100마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 이제 플레이트를 HCS 기기에서 평가할 준비가 되었으며 수집이 시작됩니다.
시험물질 처리의 대표적인 RTCA cell viability 결과를 보여줍니다. 독성 용량 의존적 효과는 1-아미노나프탈렌, 비소, 크롬 및 크로톤알데히드에 대해서만 24시간 동안 노출되면 얻어지며, 모두 20밀리몰 미만의 계산된 LD50을 표시했습니다. 다른 화합물에는 독성 효과가 나타나지 않았습니다.
여기에 보이는 것은 1-아미노나프탈렌 치료에 대한 대표적인 HCS 결과입니다. 1-아미노나프탈렌의 독성 효과는 세포막에 심각한 손상을 유발하여 노출 4시간 후 용량 의존적 방식으로 세포막 투과성을 증가시킵니다. 이 화합물은 또한 미토콘드리아에 영향을 미쳐 노출 4시간 후 질량 증가를 유도하고 시토크롬 C의 방출과 함께 노출 4시간 및 24시간 후에 핵에서 검출될 수 있습니다.
이 기술은 일단 숙달되면 2-3일 이내에 실행할 수 있으며, 대부분의 경우 설정 및 투여에 하루에 약 한 시간의 실습 시간이 필요하기 때문입니다. 선택한 프로토콜에 따라 High Content Screening은 전체 염색 절차를 실행하는 데 최대 3시간 및 1/2시간이 소요됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 더 넓은 범위의 끝점을 선택하면 워크플로가 복잡해지지만 시간이 크게 증가하지는 않는다는 점에 유의해야 합니다.
최적의 작업 흐름을 통해 실제로 여러 플레이트를 동시에 평가할 수 있습니다. 완전 자동화된 세포 설정, 화합물 희석, 투여 및 염색, 새로운 종말점 추가를 포함한 High Content Screening Platform의 지속적인 개발은 독성 프로파일링을 위한 강력한 도구로서 High Content Screening Platform의 기능을 더욱 확장할 것입니다. 또한, 이러한 높은 처리량에서 여러 단일 독성 종말점의 조합은 동물 실험을 줄이기 위한 우리의 노력에서 한 걸음 더 나아갈 것입니다.
개요
본 연구는 임피던스 기반 실시간 세포 분석기와 고함량 스크리닝 플랫폼을 사용하여 15가지 담배 연기 성분의 생물학적 영향을 조사합니다. 이 연구는 이러한 화합물의 유효 용량, 독성 및 작용 방식에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목적으로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 독성학
- 세포 생물학
- 환경 건강
배경
- 담배 연기에는 수많은 유해 성분이 포함되어 있습니다.
- 이러한 화합물의 영향을 이해하는 것은 공중 보건에 매우 중요합니다.
- 임피던스 기반 분석은 세포 반응의 실시간 모니터링을 가능하게 합니다.
- 고함량 스크리닝은 세포 효과에 대한 상세한 통찰력을 제공합니다.
연구 목적
- 담배 연기 성분의 독성을 평가합니다.
- 유효 용량 및 작용 방식을 결정합니다.
- 화합물의 종합적인 독성학적 프로파일을 개발합니다.
사용된 방법
- 세포독성 평가를 위한 임피던스 기반 실시간 세포 분석.
- 세포 반응 평가를 위한 고함량 스크리닝.
- 실험을 위한 정상 인간 기관지 상피 세포의 사용.
- 48시간 동안 15분마다 데이터 기록.
주요 결과
- 몇 가지 유해 성분에 대한 유효 용량을 식별했습니다.
- 세포독성 및 세포 스트레스 반응을 관찰했습니다.
- 추가 고함량 스크리닝 분석을 위해 화합물을 선택했습니다.
- 여러 생화학적 매개변수를 평가하기 위한 프레임워크를 제공했습니다.
결론
- 결합된 접근 방식은 담배 연기 성분의 독성을 효과적으로 평가합니다.
- 결과는 이러한 화합물의 생물학적 영향을 이해하는 데 기여합니다.
- 연구 결과는 규제 결정 및 공중 보건 정책에 정보를 제공할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Assessing the toxicological profiles of individual cigarette smoke constituents enables mechanistic de-risking in early discovery by clarifying pathway-specific effects. This approach supports predictive confidence in target validation by linking compound exposure to defined cellular outcomes such as mitochondrial dysfunction, genotoxicity, oxidative stress, and kinase activation. The integration of impedance-based and high-content screening provides a scalable, reproducible workflow for prioritizing harmful constituents in tobacco product evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking constituent exposure to specific mechanisms like mitochondrial damage and histone H2AX phosphorylation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative LD50 determination and real-time viability tracking.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying constituents with computable toxicity profiles for further mechanistic study.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, multiparametric readouts including cell index, mitochondrial mass, cytochrome C release, and membrane permeability.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via standardized staining protocols and automated imaging on HCS platforms.
- Scalability: Enables parallel processing of multiple plates, supporting medium-throughput screening of toxicant libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Uses disease-relevant normal human bronchial epithelial cells to model respiratory toxicity.
- Mechanistic Continuity: Links early cytotoxicity signals to downstream genotoxic and stress pathway activations for risk-adjusted decision-making.
- Predictive De-risking: Identifies constituent-specific biomarkers such as phosphorylated H2AX and cytochrome C translocation for mechanistic profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges discovery biology and lead identification by providing quantitative toxicity data and mechanistic insights that inform compound selection and optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via real-time impedance measurements and endpoint-specific HCS readouts to clarify mechanisms of action.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized protocols with quantitative outputs for compound comparison and hit confirmation.
- Analytics: Provides LD50 calculation, dose-response curves, and multiparametric imaging data to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro findings to respiratory disease models through use of NHBE cells and pathway-specific biomarker detection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable toxicology profiling platform applicable to diverse compound libraries beyond tobacco constituents.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through multiparametric toxicity profiling.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via defined staining, fixation, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering early, mechanism-based toxicity data to reduce late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated toxicological mechanisms and effective doses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, impedance-based analysis, and high-content screening instrumentation.
- Dependent on access to RTCA and HCS platforms, live-cell dyes, fixation reagents, and automated washers.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, dosing procedures, and image analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or complex mixtures beyond single HPHCs.
- Limited by the need for compound solubility in vehicle and cytotoxicity thresholds that permit LD50 computation (<20 mM).
