공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

이 실험의 전반적인 목표는 in vitro assay에서 침입 중 교모세포종 세포와 미세아교세포 및 대식세포의 상호 작용을 모델링하는 것입니다. 따라서 이 방법은 종양 미세환경 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 어떤 화합물 또는 치료법이 악성 종양으로 진행되는 동안 미세환경의 세포 유형인 대식세포와의 암 상호 작용을 방해할 수 있는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점 중 하나는 비교적 수행하기 쉽고 합리적인 시간에 완료할 수 있으며 생체 내 교모세포종 침습을 정확하게 모델링하는 것 같다는 것입니다.

다음과 같이 phorbol myristate acetate를 사용하여 관심 세포주를 구별하는 것으로 시작합니다. 먼저, 6웰 배양 플레이트에서 1.5 밀리리터의 배지에 있는 10 내지 5번째 THP-1 세포를 2-3배 플레이트합니다. 도금 직후 PMA 100나노몰을 첨가하고 섭씨 37도, 5%CO2에서 48시간 동안 배양합니다.

48시간 후 미디어를 흡인하여 PMA를 제거하고 one-X PBS로 한 번 세척한 다음 새 미디어를 추가합니다. 세포가 분석에 사용할 준비가 될 때까지 48시간 더 배양합니다. 그런 다음 혈청이 없는 500마이크로리터의 배지가 들어 있는 웰에 매트릭스 사전 코팅된 챔버를 배치한 다음 500마이크로리터의 무혈청 배지를 상단에 추가하여 평형을 이룹니다.

챔버를 섭씨 37도, CO2 5%에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 형광 표지된 교모세포종 세포주와 미세아교세포 및 대식세포를 포함하는 배양 용기에서 배지를 부드럽게 흡인합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 2밀리몰 EDTA 및 PBS를 추가하고 조직 배양 인큐베이터에서 5-10분 동안 배양합니다.

0.3%bovine 혈청 알부민을 포함하는 매체의 5 밀리리터에 있는 세포를 모으고 120배 G.Following 원심분리에 5 분 동안 상등액을 흡인하고 1 시간 10에서 밀리리터 당 여섯 번째 세포의 농도에 적합한 매체에 있는 세포 펠릿을 refuse. 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 다음으로, 0.3%BSA를 함유한 적절한 매체 500마이크로리터를 24웰 플레이트의 웰에 추가합니다.

그런 다음 평형 챔버에서 매체를 제거하고 챔버를 24웰 플레이트의 웰에 놓습니다. 억제제를 사용하여 대식세포 또는 미세아교세포 자극 신경교종 침입에 대한 효과를 연구하는 경우 챔버의 하단 및 상단 부분 모두에 적절한 농도를 추가합니다. 사용된 세포주에 따라 교모세포종 세포와 마우스 미세아교세포 또는 신경교종 세포, 대식세포 세포를 프로토콜의 서면 부분에 있는 세부 사항에 따라 혼합합니다.

세포 혼합물을 상단 챔버에 추가하고 세포 유형에 따라 24-48시간 동안 배양합니다. 배양 후, 부드러운 흡인으로 챔버 상단에서 세포를 제거합니다. 그런 다음 PBS의 3.7% 포름알데히드에 챔버를 배치하여 고정합니다.

챔버를 실온에서 15분 동안 고착 상태로 두십시오. 마지막으로, 부드러운 흡인으로 고정액을 제거하고 500마이크로리터의 one-X PBS로 교체합니다. 먼저 매트릭스 혼합물을 섭씨 4도에서 밤새 해동합니다.

다음으로, 얼음 위의 적절한 매체에 10밀리리터당 10밀리그램 농도의 매트릭스를 준비합니다. 그런 다음, 이전에 표시된 것처럼 매트릭스에서 현탁액을 위해 라벨링된 세포를 수확합니다. 그런 다음 150 마이크로리터 부피의 다섯 번째 GL261 셀에 1.5배 10배, 50 마이크로리터의 네 번째 마이크로아교세포에 5배 10배를 1.5 밀리리터 마이크로분리 튜브에 피펫팅합니다.

200 마이크로리터 부피의 다섯 번째 GL261 셀에 10의 두 배를 별도의 1.5 ml 마이크로분리 튜브에 추가합니다. 120 회 G.에서 5 분 동안 마이크로 fuge에서 세포를 회전 한 다음 얼음 위의 200 마이크로 리터의 차가운 매트릭스에 세포를 재현탁시킵니다. 이 단계에서는 후드에 얼음 트레이를 준비하고, 튜브를 얼음 위에 두고, 팁을 냉장고에 보관하고, 성숙한 젤의 조기에 중합을 방지하기 위해 모든 것이 냉각되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

재현탁 후, 50 마이크로리터 부피의 50, 000 세포를 8 미크론 공극 크기 챔버 인서트의 상단 구획 중앙에 플레이트합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 중합이 일어날 수 있도록 합니다. 30분 후, 200마이크로리터의 무혈청 배지를 상부 챔버에 첨가하고 700마이크로리터의 혈청 함유 세포 성장 배지를 하부 웰에 추가합니다.

48시간 동안 배양한 후 부드러운 흡인으로 챔버 상단 부분에서 세포를 제거합니다. 이전과 같이 챔버를 고정하고 세포를 이미징하기 전에 고정액을 500마이크로리터의 one-X PBS로 교체합니다. 이 대표적인 이미지는 미세아교세포가 없는 상태에서 GL261 세포를 발현하는 mCherry의 침입을 보여줍니다.

세포를 매트릭스 코팅된 챔버에 도금하고 48시간 동안 배양했습니다. 이미지는 10X 대물렌즈를 사용하여 촬영되었으며 눈금 막대는 400미크론을 나타냅니다. 여기서 GL261 세포는 미세아교세포와 결합되었습니다.

필터를 통과하는 GL261 침입 세포의 수를 정량화했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 마우스 교모세포종 세포주 GL261을 미세아교세포와 공동 배양하면 2D 분석에서 침입이 최대 10배까지 향상됩니다. 이 이미지는 DMSO 대조군과 비교하여 미세아교세포 자극 GL261 침습에 대한 약리학적 억제제의 효과를 보여줍니다.

표시된 데이터는 6개의 독립적인 실험에서 얻은 것입니다. 이 분석법은 인간 세포주를 사용하여 성공적으로 사용되었습니다. 매트릭스 코팅 챔버에 도금되고 CMFDA 녹색으로 염색된 U87 세포는 24시간 배양 후 표시됩니다.

여기서 U87 세포는 분화된 THP1 대식세포로 도말하였다. 이 이미지는 침습성 U87 세포만 계수하는 분석의 정량화를 보여줍니다. 인간 대식세포 세포주 THP1은 U87 교모세포종 세포 침입을 자극했습니다.

표시된 데이터는 10개의 독립적인 실험에서 얻은 평균값입니다. GL261 및 미세아교세포 공동 배양의 3D 침습 분석에서 얻은 이 이미지는 Z 시리즈 이미지의 합성물이며 매트릭스에만 CMFDA 녹색으로 염색된 GL261 세포를 보여줍니다. 여기서 GL261 세포는 CMPTX red로 표지된 쥐 미세아교세포와 공동 배양되었습니다.

여기에는 침습성으로 결정된 필터 아래쪽의 GL261 세포가 표시됩니다. 침입하는 GL261 세포의 총 수를 측정하고 단일배양에서 GL261 세포의 수로 정규화했습니다. 표시된 데이터는 중복으로 수행된 3개의 독립적인 실험의 평균을 나타냅니다.

따라서 일단 숙달되면 이 기술은 처음부터 끝까지 두 시간 정도면 완료할 수 있습니다. 그리고 실험의 최종 결과는 48시간 후에 얻을 수 있습니다. 따라서 이 기술을 수행하는 동안 튜브와 피펫을 포함하여 모든 것을 냉각하고 4도에서 유지하는 것이 매우 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 대식세포 미세아교세포(microglia coculture invasion) 분석에서 교모세포종을 확립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.