Name: 공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 교아모세포종 세포가 대식세포 및 미세아교 세포와 상호작용하며 침략하는 과정을 체외 시험으로 모델링하는 방법을. 이 기법은 종양 미세환경 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 연구를 위해 쥐 미세아교세포를 제공해 주신 Konstantin Dobrenis 박사님께 감사드립니다.

세포의 1. 형광 표식 참고 : 형광 염료 9 레이블 아교 모세포종 세포주 및 미세 아교 세포. 대안 적으로, 14에서 설명한 바와 같이 이러한 구조적 GFP / RFP 형광 단백질을 발현 세포주를 생성한다. <ol><li> 염색의 날에 80 % 합류 - 6 웰 플레이트에 플레이트 세포는 70이 될 것이다하도록. 뮤린 아교 모세포종 세포주 GL261 인간 아교 모세포종 세포주 U87, 플레이트 1 × 106 1.5 × 106 세포에 각각 염색 전에 6cm 접시에 24 시간. </li><li> , DMSO에 형광 세포 염색 염료 솔루션을 준비하고 미디어에 5 μm의 염료를 추가하거나 로즈웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 또는 대 식세포 무 혈청 배지 (MSFM), 잘 소용돌이. </li><li> 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2의 염료로 세포를 인큐베이션. </li><li> 염료 포함 된 용지를 제거하고 세포에 신선한 미디어 (RPMI 또는 MSFM)를 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 세포를 품어. 참고 : 세포는 지금염색 준비가 실험에 사용된다. </li></ol> 2. 사전 코팅 매트릭스 상공 회의소 공동 배양 침략 분석 <ol><li> 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) (15)를 사용하여 THP-1 세포 분화. <ol><li> 접시 2 - 6 웰 배양 접시에 RPMI / 10 % FBS, 1.5 ml의 3 × 105 THP-1 세포. 즉시 도금 후 100 나노 PMA를 추가하고 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 부화. 참고 : 48 시간 후, 성공적으로 차별화를받은 THP-1 세포가 부착되며 잘 둥근 형태에 복용의 바닥에 퍼졌다. </li><li> 1X PBS로 한번 세척하여 PMA를 제거하고 신선한 RPMI / 10 % FBS로 교체합니다. 세포 분석에 사용할 준비가 될 때까지 또 다른 48 시간을 기다립니다. </li></ol></li><li> 잘 형 미디어 500 μl를 포함하는 (아무 혈청)에 배치하고 상단 형 미디어의 500 μl를 추가하여 매트릭스 사전 코팅 챔버 평형. 37 ° C에서 2 시간 5 % CO 2 챔버를 품어. <br/&gt; 참고 : 사전 코팅 챔버 제조 업체에서 구입 한; 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. </li><li> 부드럽게 세포 (형광 표지 된 아교 모세포종 세포 라인과 미세 아교 세포 / 대 식세포)를 분리하려면, 흡인 세포에서 용지를 제거합니다. 2 mM의 EDTA / PBS와 함께 접시에 세포를 씻으십시오. 2 mM의 EDTA / PBS 500 μl를 추가하고 5 품어 - 37 ° C에서 세포 배양기에서 10 분 5 % CO 2. </li><li> 0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유 배지 5ml에 재현 탁 된 세포. </li><li> 120 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> MSFM / 0.3 % BSA 배지에서 기음 뜨는 재현 탁 펠렛 또는 (U87 및 THP-1 세포) RPMI / 0.3 % BSA (GL261 세포 및 미세 아교 세포의 경우) 세포의 농도가 1 × 106 세포 / ml로 동일 같은 것을 . 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다. </li><li> 24 웰 플레이트의 웰 당 500 ㎕의 미디어 / 0.3 % BSA를 추가합니다. </li><li> 적어도 2 시간 (단계 2.2)에 대한 평형 된 챔버에서 용지를 제거합니다. 장소 chambe잘 500 μL 미디어 / 0.3 % BSA (단계 2.7)를 포함에서 RS. </li><li> 억제제는 마크로파지에 미치는 효과를 연구하기 위해 사용되는 경우 / 미세 아교 세포는 하부 챔버의 상부 부분 모두에 적절한 농도를 추가 교종 침윤 자극. 주 : CSF-1R의 농도 GL261 아교 모세포종의 침윤이 기준 9에서 발견 될 수 자극 완전히 미세 아교 세포를 억제하는 데 억제제. </li><li> 마우스 아교 모세포종 (2.10.1) 인간 아교 모세포종 (2.10.2)에 사용되는 세포주에 따라 다음의 두 단계로 설명 된 바와 같이 상부 챔버에 셀을 추가한다. <ol><li> 1.5 × 10 5 GL261 (아교 모세포종) 세포 (150 μL), 5 × 10 4 마우스 미세 아교 세포 (50 μl를) (미디어 자세한 내용은 단계 2.6 참조) 섞는다. 300 μL MSFM / 0.3 % BSA를 추가하여 500 μL에 볼륨을 가져와. 상단 챔버에 세포 혼합물을 추가하고 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 부화. 참고 : 나는 설명 된대로 쥐 미세 아교 세포는 신생아 쥐에서 분리되어n은 1 6. </li></ol></li></ol> 7.5 × 10 4 U87 (아교 모세포종) 세포 (75 μL) 2.5 × 10 4 THP1 (대 식세포) 세포 (25 μL)을 섞는다. 400 μl의 RPMI / 0.3 % BSA를 추가하여 500 μL에 볼륨을 가져와. 상단 챔버에 세포 혼합물을 추가합니다. 24 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 품어. <ol><li> 배양 후, 부드러운 흡인 챔버의 상단에서 세포를 제거하고 PBS에서 3.7 %의 포름 알데히드에 배치하여 실을 수정합니다. 챔버는 실온에서 15 분 (또는 밤새 4 ° C)에 대한 정착에 남아있을 수 있습니다. 부드러운 흡인 정착액을 제거하고 PBS 1 배 500 μL로 교체합니다. 이미지 분석을위한 섹션 4로 넘어갑니다. 참고 : 실험이 순간에 일시 정지와 1X PBS에서 영상 저장할 수 있습니다. 형광 염료의 신호가 고정 후까지 2 주간 검출 할 수있다. </li></ol> 매트릭스에서 신경 교종 및 대 식세포 / 미세 아교 세포를 -embedding 3. 침략 분석 &quot;3D&quot; <ol><li>밤새 4 ° C에서 해동 매트릭스 믹스. 후드에서 얼음에 매트릭스를 사용하여 모든 추가 조작을 수행합니다. </li><li> 얼음에 0.3 % BSA와 미디어 매트릭스의 10 ㎎ / ㎖ 농도 (MSFM 또는 RPMI)를 준비합니다. 참고 : 행렬의 재고 농도는 일반적으로 약 15 ㎎ / ㎖이다. </li><li> 매트릭스 서스펜션 (1 단계에서 표시) 세포를 준비하려면, 흡인 세포에서 용지를 제거합니다. 2 mM의 EDTA / PBS와 함께 접시에 세포를 씻으십시오. 셀에 2 mM의 EDTA / PBS 500 μl를 추가하고 5 품어 - 37 ° C에서 인큐베이터에서 10 분 5 % CO 2. </li><li> 0.3 % BSA를 함유 배지 5ml에 재현 탁 된 세포. </li><li> 120 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 펠렛에서 대기음 뜨는. 세포의 농도가 1 × 106 세포 / ml로 동일하도록 미디어 / 0.3 % BSA에 재현 탁 펠릿. 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다. </li><li> 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 + 5 × 10 4 미세 아교 세포 (50 μL에서) (150 μL)에 1.5 × 10 5 GL261 세포를 추가합니다.별도의 1.5 ML의의 microfuge 튜브에 2 × 10 5 GL261 세포 (200 μL)를 추가합니다. 참고 형 미세 아교없이 GL261 세포는 대조군으로 작용한다. </li><li> 120 X g에서 5 분의 microfuge에 스핀 세포. </li><li> 얼음에 200 μl의 차가운 매트릭스를 Resuspend 세포. </li><li> 8 μM 공경 챔버 인서트의 상부 구획의 중앙 판 (50) 상 μL (50,000 세포). </li><li> 중합이 발생하여 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 하부 웰에 상부 챔버 700 ㎕의 혈청을 포함하는 세포 증식 배지에 200 μL의 혈청 배지를 추가한다. </li><li> 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 품어. </li><li> 배양 후, 부드러운 흡인 챔버의 상단에서 세포를 제거하고 PBS에서 3.7 %의 포름 알데히드에 배치하여 실을 수정합니다. 챔버는 실온에서 15 분 (또는 밤새 4 ° C)에 대한 정착에 남아있을 수 있습니다. 부드러운 흡인 정착액을 제거하고 PBS 1 배 500 μL로 교체합니다. (4) FO로 진행R 영상 분석. </li></ol> 4. 영상 분석 실험 <ol><li> 3.7 %의 포름 알데히드에서 챔버를 제거하고 PBS 1 배 신선한 500 μl를 포함하는 잘 씻는다. 참고 : 챔버 건조하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 목화 팁 어플리케이터를 사용하여 부드럽게 필터 표면을 긁어 필터의 상단부 (측 챔버의 내부를 향하는)에서 비파괴 세포를 세척. 부드럽게 시작하고 점차적으로 압력을 증가. 챔버 당이 적어도 3 회를 수행합니다. </li><li> 중 유리 바닥 접시에 실을 놓거나 24 웰 플레이트에 둡니다. </li><li> 카메라와 이미지 캡처 소프트웨어 (9, 10)가 장착 된 epifluorescent 또는 레이저 공 초점 형광 현미경의 무대에서 샘플을 놓습니다. </li><li> 대표적인 필드의 몇 배 또는 20 배의 이미지를 가져 가라. </li><li> 이러한 ImageJ에 같은 영상 분석 소프트웨어를 사용하여, 하부 9,10-에 필터를 넘었다 아교 모세포종 세포의 수를 계산. </li><li> 은 &quot;3D 이미징 경우. 4.6 전술 - &quot;침략 분석 (3 절에 기재된), 형광 레이저 공 초점 현미경 5-6를 사용하여 Z 스택 시리즈를 생성하는 이미지에 필터의 하부에 침입 세포 집단을, 프로토콜을 따라 4.2 단계를 반복합니다. </li></ol>

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높은 등급의 성상 세포종과 교 모세포종의 매우 침습적 인 특성은 이러한 뇌 암은 매우 치명적인합니다. 그것은 아교 모세포종 침공의 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것이 가장 중요하다. 많은 아교 모세포종 침공 이미 17의 과정에 대해 알게되었습니다. 10 배 -이 문서에 설명 된 분석 형식을 사용하여, 우리 연구실은 종양 관련된 대 식세포는 5 신경 교종 세포 침공을 자극 할 수있는 모두 마우스와 인간의 모델에 보여 주었다. 이 공 배양 모델에 충실 잠재적 간의 쌍방향 통신에 참여 (예 : 노치 델타 Ephrin-Ephs로서 리간드 - 수용체 시스템을 통해) 분비 및 juxtacrine 상호 작용 허용 물리적 식세포 / 미세 아교 세포와 상호 작용하는 아교 모세포종 세포의 기능을 복제 종양 세포와 대 식세포. 신경 교종 세포 침윤에 대한 대 식세포의 효과를 발견하고자 다른 분석 포맷은 일반적으로 셀을대 식세포는 웰의 바닥면에 도금 및 아교 모세포종 세포 챔버 3,4에있는 바와 같이 물리...

아교 모세포종의 홍반 진단 1, 2의 시간에서 약 12 개월 평균 생존과 적극적인 인간의 뇌 암이다. 교 모세포종은 표준 화학 요법과 수술 적 절제에 난치성 인으로 가장 치명적인 임상 도전 암 중 하나입니다. 아교 모세포종의 확산 특성은 수술로 완전히 절제에 고급 종양이 사실상 불가능하게 정상 뇌 전체에 확산 종양 세포 수 있습니다. 이 매우 침습적 인 측면은 교 모세포종 및 기타 고급 성상 세포종의 특징 특징이다. 따라서, 많은 연구의 초점은 아교 모세포종 세포 침윤의 분자 메커니즘왔다. 아교 모세포종 종양 미세 환경은 악성 종양 3-6 확립에 중요한 역할을한다. 종양 관련된 대 식세포는 / 미세 아교 세포는 아교 모세포종 침공 7,8 홍보에 대한 책임 것으로 나타났다. 이러한 연구의 대부분은 사용하지만 식세포 / 미세 아교 세포의 효과를 측정물리적으로 아교 모세포종 세포에서 구분 분석. 우리의 실험은 우리가 아교 모세포종 침공이 공 배양에서 대 식세포 / 미세 아교 세포에 의존하는 방법을 연구하고 침략하는 동안 이미지에 그들 사이의 물리적 상호 작용을 우리를 활성화 할 수 있도록 개선 된 분석을 생성하기 위해 밖으로 설정하고있다. 클래식 분석은 세포 침공은 &quot;표준&quot;보이든 챔버 화성과 chemoinvasion 형식을 포함 측정합니다. 공부하는 여기에 세포를 지정된 크기 (직경 일반적으로 사이 0.4 및 8 μM)의 구멍이 하단에 폴리 카보네이트 필터가 포함 된 플라스틱 챔버에서 도금. 세포 침윤의 방법은 일반적으로 세포 외 매트릭스 단백질로 이루어진 물리적 배리어를 포함한다. chemoinvasion 분석에서 사용 된 바람직한 행렬은 마트 리겔 (이하, &quot;매트릭스&quot;라 함), Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS)에 의해 분비 된 세포 외 매트릭스 단백질의 혼합물을 마우스 육종 세포이며 크게 COL 이루어져lagen 유형 IV 및 라미닌. 챔버 후 또는 침윤을 촉진하는 것으로 의심되는 성장 인자없이 세포 배양액을 포함하는 조직 배양 웰에 배치된다. 더 높은 주파수에서 세포 외 기질 코팅 된 필터를 통해 침투하고, 필터의 하측에 부착하는 높은 침윤성 용량 셀. 우리는 아교 모세포종 세포 침윤에 미세 아교 세포 및 종양 연관된 대 식세포의 역할을 평가하기 위해이 시험을 수정했다. 10 배 9,10 - 우리는 미세 아교 세포는 5 개의 아교 모세포종 세포 라인의 침공을 자극 할 수있는이 문서에서 설명 공 배양 분석을 사용하여 확인 할 수 있었다. 이 아교 모세포종의 동물 모델에서 관찰되는 것을 반영한다. 더욱이, 우리는 아교 모세포종 세포와 대 식세포 간의 상호 작용 / 미세 아교 세포가보다 직접적으로 검토 할 수있는 입체 침윤 분석을 개발 하였다. macropha에 의해 자극 아교 모세포종 세포 침윤의 정도3 차원 분석에서 GES / 미세 아교 매트릭스 코팅 챔버 방식을 사용하여 본 것과 대등하다. 비슷한 분석은 이전에 침공 11 ~ 13시 대 식세포와 유방암의 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었다. 이 문서에 설명 된 두 가지 방법은 아교 모세포종 세포의 식세포 / 미세 아교 세포 자극 침공의 분자 메커니즘 (들)을 해부 할 수있는 능력에 도움이됩니다.

<table><tbody><tr><td>Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: BD Matrigel Matrix 포함</td><td>Corning/Fisher Scientific</td><td>Cat: 354481</td><td></td></tr><tr><td>대식세포 무혈청 배지(MSFM) (500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX Dye</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>GL261 세포주</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87 세포주</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 세포주</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (500 ml)</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 폴리카보네이트 막 세포 배양 삽입물(8 &micro; M 기공) 팩당 48개.</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3-D 배양 매트릭스 감소 성장 인자 기저막 추출물, PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>Cat: 10500064</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 분획 V, 열 충격 처리</td><td>Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

아교 모세포종의 홍반 (등급 IV 신경 교종)은 1 년 후 진단의 평균 생존에 매우 적극적인 인간의 암이다. 아교 모세포종을 야기 분자 사건의 증가 이해에도 불구하고,이 암은 여전히 ​​기존의 치료에 매우 내화 남아있다. 고급 뇌 종양의 수술 적 절제로 인해 아교 모세포종 세포의 높은 침윤성 특성으로 거의 완료되었습니다. 아교 모세포종 세포 침공을 약화 치료 방법 따라서 매력적인 선택이 될 것입니다. 우리의 실험실과 다른 사람은 종양 관련된 대 식세포와 미세 아교 세포 (상주 뇌 식세포) 강하게 아교 모세포종의 침략을 자극을 보여 주었다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 체외 배양 분석을 사용하여 아교 모세포종 - 대 식세포 / 미세 아교 세포의 상호 작용을 모델링하는 데 사용됩니다. 이러한 접근 방식은 크게이 악성 behav 가능 식세포와의 통신을 방해 약물의 개발 및 / 또는 검색을 용이하게 할 수있다IOR. 10 배 - 우리는 미세 아교 세포 / 대 식세포는 5 신경 교종 세포 침공을 자극하는 두 가지 강력한 공 배양 침공 분석을 설립했다. 형광 마커 또는 구조적 형광 단백질을 발현 표지 아교 모세포종 세포 기질 코팅 폴리 실에 삽입하지 않고 식세포 / 미세 아교 도금 또는 입체 매트릭스에 포함된다. 세포 침윤은 필터의 하부에만 침입 세포 이미지를 형광 현미경을 사용하여 카운트에 의해 평가된다. 이러한 분석을 사용하여 여러 가지 약리 억제제 (JNJ-28312141는 PLX3397, 피티 니브 및 Semapimod) 대 식세포를 차단, 확인 된이 / 미세 아교 세포는 아교 모세포종의 침략을 자극.

여기에 설명 된 방법을 사용하여, 우리는 미세 아교 세포와 대 식세포가 실질적으로 아교 모세포종 세포 침공을 자극 할 수 있음을 보여 주었다. 두 개의 다른 침윤 분석이 이용되고도 1에 도시된다.도 2에서, 구조적 형광 단백질을 발현 mCherry GL261 세포와 48 시간 동안 미세 아교없이 프리 코팅 챔버에서 배양 하였다. 미세 아교 세포로 침입 용량이 약 10 배 증가하지만 때 배양 GL261 세포는 자신에 대한 최소 침습했다. 우리는 인간 세포주를 사용하여 유사한 효과를 관찰한다. 차별화 된 THP-1 세포와 공 배양 할 때 그림 3에서 (5 chloromethylfluorescein 디 아세테이트 (CMFDA) 녹색으로 염색) U87 세포는 5 ~ 6 배 높은...

암의 악성 행동을 이해하려면 종양 세포가 대식세포와 같은 종양 미세환경의 구성 요소와 어떻게 상호 작용하는지에 대한 정확한 모델을 만들어야 합니다. 여기에서는 교모세포종 세포와 종양 관련 대식세포 및 교모세포종 침입에 대한 영향을 평가하는 미세아교세포와의 상호 작용을 연구하는 두 가지 방법을 설명합니다.

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

이 실험의 전반적인 목표는 인비트로(in vitro) 분석법을 통해 침습 과정 중 교모세포종 세포와 미세아교세포 및 대식세포 간의 상호작용을 모델링하는 것입니다. 따라서 이 방법은 악성 종양으로 진행되는 과정 중 미세환경의 세포 유형인 대식세포와 암세포의 상호작용을 방해할 수 있는 화합물이나 치료법이 무엇인지와 같은 종양 미세환경 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점 중 하나는 수행 방법이 비교적 간단하고 적절한 시간 내에 완료할 수 있으며, 생체 내(in vivo) 교모세포종 침습을 정확하게 모델링하는 것으로 보인다는 점입니다.먼저 다음과 같이 phorbol myristate acetate를 사용하여 관심 있는 세포주를 분화시킵니다. 우선 6-well 배양 플레이트의 1.5 mL 배지에 2~3×10⁵개의 THP-1 세포를 분주합니다. 분주 직후 100 nM의 PMA를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양합니다.48시간 후, 배지를 흡입하여 PMA를 제거하고 1X PBS로 한 번 세척한 다음 신선한 배지를 추가합니다. 세포를 분석에 사용할 수 있을 때까지 다시 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 매트릭스가 사전 코팅된 챔버를 무혈청 배지 500 µL가 담긴 웰에 넣고, 상단에 무혈청 배지 500 µL를 추가하여 평형화합니다.챔버를 37°C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 형광 표지된 교모세포종 세포주와 미세아교세포 및 대식세포가 포함된 배양 용기에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 2mM EDTA 및 PBS 500µL를 첨가하고 조직 배양 인큐베이터에서 5~10분 동안 배양합니다.0.3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)이 포함된 배지 5 mL에 세포를 수집하고 120 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠렛을 적절한 배지에 재부유시켜 1 × 10⁶ cells/mL 농도로 조절합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 0.3% BSA가 포함된 적절한 배지 500 µL를 24-웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다.그 다음 평형화된 챔버에서 배지를 제거하고 24-well 플레이트의 웰에 챔버를 배치합니다. 대식세포 또는 미세아교세포가 자극한 교종 침습에 미치는 영향을 연구하기 위해 억제제를 사용하는 경우, 챔버의 하단과 상단 모두에 적절한 농도의 억제제를 첨가합니다. 사용하는 세포주에 따라, 프로토콜의 서면 부분에 기재된 세부 사항에 맞게 교종세포와 마우스 미세아교세포 또는 교종세포와 대식세포를 혼합합니다.세포 혼합물을 상단 챔버에 넣고 세포 유형에 따라 24~48시간 동안 배양합니다. 배양 후, 부드럽게 흡입하여 챔버 상단에서 세포를 제거합니다. 그런 다음 챔버를 PBS에 희석된 3.7% formaldehyde에 넣어 고정합니다.챔버를 실온에서 15분 동안 고정액에 그대로 둡니다. 마지막으로, 고정액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 500 µL의 1X PBS로 교체합니다. 먼저, 매트릭스 믹스를 4 °C에서 하룻밤 동안 해동합니다.다음으로, 적절한 배지 내에서 10 mg/mL 농도의 매트릭스를 얼음 위에서 준비합니다. 그런 다음, 이전에 설명한 대로 매트릭스 내 현탁을 위해 표지된 세포를 수확합니다. 이어서 1.5 × 10⁵개의 GL261 세포를 150 µL 부피에, 5 × 10⁴개의 미세아교세포를 50 µL에 넣어 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다.별도의 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 200 µL 부피의 GL261 세포 2 × 10⁵개를 넣습니다. 마이크로 원심분리기를 사용하여 120 ×g에서 5분 동안 세포를 원심 분리합니다. 그런 다음, 얼음 위에서 200 µL의 차가운 매트릭스에 세포를 재현탁합니다. 이 단계에서는 성숙한 겔이 조기에 중합되는 것을 방지하기 위해 후드 내에 아이스 트레이를 준비하고, 튜브를 얼음 위에 유지하며, 팁을 냉장고에 보관하는 등 모든 구성 요소가 냉각된 상태여야 합니다.재현탁 후, 8 $\mu$m 공극 크기의 챔버 인서트 상단 구획 중앙에 50 $\mu$L 부피로 50,000개의 세포를 도말합니다. 그 후 중합 반응이 일어나도록 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 상단 챔버에 200 $\mu$L의 무혈청 배지를 추가하고 하단 웰에 700 $\mu$L의 혈청 함유 세포 성장 배지를 추가합니다.48시간 동안 배양한 후, 부드럽게 흡입하여 챔버 상단에서 세포를 제거합니다. 이전과 동일하게 챔버를 고정하고, 세포를 이미징하기 전에 고정액을 500 µL의 1X PBS로 교체합니다. 이 대표 이미지는 미세아교세포가 없을 때 침습하는 mCherry 발현 GL261 세포를 보여줍니다.세포를 매트릭스로 코팅된 챔버에 도말하고 48시간 동안 배양하였습니다. 이미지는 10X 대물렌즈를 사용하여 촬영하였으며, 스케일 바는 400 microns를 나타냅니다. 여기에서는 GL261 세포를 미세아교세포와 함께 배양하였습니다.필터를 통과한 GL261 침습 세포의 수를 정량화하였습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 마우스 교모세포종 세포주 GL261을 미세아교세포와 공배양하면 2D 분석에서 침습 능력이 최대 10배까지 향상됩니다. 이 이미지는 DMSO 대조군과 비교하여 약물 억제제가 미세아교세포에 의해 자극된 GL261의 침습에 미치는 영향을 보여줍니다.제시된 데이터는 6회의 독립적인 실험 결과입니다. 이 분석법은 인간 세포주를 사용하여 성공적으로 적용되었습니다. 매트릭스로 코팅된 챔버에 플레이팅하고 CMFDA green으로 염색한 U87 세포를 24시간 배양한 후의 모습이 나타나 있습니다.여기서는 U87 세포를 분화된 THP1 대식세포와 함께 플레이팅하였습니다. 이 이미지는 침습된 U87 세포만을 계수한 분석 결과의 정량화를 보여줍니다. 인간 대식세포 세포주 THP1은 U87 교모세포종 세포의 침습을 촉진하였습니다.제시된 데이터는 10회의 독립적인 실험에서 얻은 평균값입니다. GL261 및 미세아교세포(microglia) 공배양의 3D 침윤 분석 이미지인 이 사진은 Z-시리즈 이미지의 합성물이며, 매트릭스에 단독으로 임베딩된 CMFDA green으로 염색된 GL261 세포를 보여줍니다. 여기에서 GL261 세포는 CMPTX red로 표지된 마우스 미세아교세포와 공배양되었습니다.여기 필터 아래쪽으로 이동하여 침습적이라고 판단된 GL261 세포들이 나타나 있습니다. 침습한 GL261 세포의 총 수를 측정하고 이를 단독 배양된 GL261 세포의 수로 표준화하였습니다. 제시된 데이터는 두 번씩 반복 수행한 세 차례의 독립적인 실험의 평균값을 나타냅니다.따라서 이 기술을 숙달하면 처음부터 끝까지 약 2시간 만에 완료할 수 있습니다. 실험의 최종 결과는 48시간 후에 얻을 수 있습니다. 그러므로 이 기술을 수행하는 동안 튜브와 피펫을 포함한 모든 기구를 4°C로 냉각 상태로 유지하는 것이 매우 중요합니다.이 영상을 시청하신 후, 대식세포-미세아교세포 공동 배양 침습 분석법에서 교모세포종을 확립하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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연구

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암 연구

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이 비디오에서는 교모세포종과 미세아교세포를 고분자 매트릭스 용액과 혼합하여 다공성 챔버 삽입물로 옮겨 겔이 형성되어 세포를 포매합니다. 미세아교세포는 다공성 삽입물을 통한 교모세포종 세포의 이동을 자극하여 종양 세포가 주변 조직으로의 침입을 모방하고, 세포를 고정하고 추가 분석을 위해 준비합니다.

Microglia Glioblastoma Co-Culture를 사용한 매트릭스 기반 종양 침입 모델

암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

본 문서는 대식세포를 유치하기 위해 종양 세포로부터 조절된 배지의 능력을 평가하는 유용한 시험관내 분석방법을 나타낸다.

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여기서, 우리는 종양 세포가 면역 반응을 억제하기 위해 사용하는 비접촉 파라크린 신호의 연구를 용이하게 하기 위해 투과막 지지대를 사용하는 방법을 제시한다. 시스템은 대식세포 활성화를 약화시키는 종양 분비 인자의 역할을 연구할 수 있습니다.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

여기에서는 3차원(3D) 콜라겐 I 매트릭스에서 1차 인간 단핵구 유래 대식세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 조사하기 위한 프로토콜을 제시하며, 미세환경의 용해성 및 물리적 특성이 세포 침입에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

배우세요 교아모세포종 세포가 대식세포 및 미세아교 세포와 상호작용하며 침략하는 과정을 체외 시험으로 모델링하는 방법을. 이 기법은 종양 미세환경 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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