Name: 유리를 통해 보면 : 시간 경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 학습하세요 시간 경과 현미경을 이용한 단일 세포 추적 기법으로 항암 치료 반응을 관찰하는 방법을. HT1080 및 HeLa 세포주를 사용하여 실시간으로 세포 운명과 치료 효능을 분석할 수 있습니다.

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기술 지원을 해주신 Joshua Marcus님과 기술적 조언을 해 주신 Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility의 이사인 Jolien Tyler 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 University of Colorado Boulder와 University of Colorado Boulder Graduate School의 자금으로 지원되었으며, J.D.O. R.T.B.는 NIH의 박사 전 교육 보조금(T32 GM008759)으로 부분적으로 지원됩니다. 셀리넥소(selinexor)를 투여한 Karyopharm Therapeutics, Inc.와 키네신-5 억제제를 투여한 머크 세로노(Merck Serano)에 감사를 표합니다. FUCCI 플라스미드는 MTA를 통해 Atsushi Miyawaki(RIKEN, 일본)에서 제공합니다. mCherry-BP1-2는 Addgene에서 가져왔습니다. H2b-mCherry 및 β-tubulin-EGFP를 발현하는 HeLa는 Daniel Gerlich(IMBA, 오스트리아 과학원, 오스트리아)에서 발췌한 것입니다.

다음 프로토콜은 그림 4와 6에 대한 인수 설정 및 실험 조건에서 실험에 의해 정의 된 매개 변수를 사용합니다. 이러한 파라미터의 많은 다른 실험에 맞게 수정 될 수있다 (즉, 노출 시간, 비닝 형광 채널, 등.). 모든 절차가 제도적 지침 및 규정을 준수해야하고 제도적 바이오 안전성위원회의 승인을 받아야. 현미경 제조 업체 웹 사이트 라이브 세포 이미징을위한 훌륭한 정보가 포함되어 있습니다. 1. 현미경 및 이미징 소프트웨어 <ol><li> 거꾸로 현미경의 다양한 라이브 세포 이미징을 수행합니다. 가장 일반적인 현미경 표면 형광 및 회전 디스크 공 촛점을 위드 있습니다. 여기서, 200w 메탈 할라이드 광원과 자동화되고 동력 위드의 표면 형광 현미경을 사용한다. </li><li> 무대 정상을 얻거나 환경 챔버를 현미경. 여기에서, 무대 t을 사용영업 환경 챔버. </li><li> 시간 경과 현미경을 실행하는 유틸리티 현미경을 운영하는 상용 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 이미지 분석을위한 상용 소프트웨어 또는 ImageJ에 사용합니다. 많은 분석 도구는 상업적으로 입수 가능하고, (8, 18)를 발표되었다하는 여러 맞춤형 프로그램이있다. </li></ol> 2. 세포 프로세스 및 표현형 응답을 시각화 <ol><li> 시야 현미경으로 세포를 시각화합니다. 단독 차동 간섭 콘트라스트 및 위상 콘트라스트 항암 약물 반응에 대한 반응을 연구하는 것은 매우 유익 할 수있다. 이러한 프로세스는 유사 분열, 세포 운동성 및 세포 사멸을 포함 할 수있다. </li><li> 형광 바이오 센서와 세포 구조, 세포 기관 및 프로세스를 시각화합니다. 형광 프로브는 특정 세포 내 프로세스를 추적하는 정보입니다. 이러한 미세 소관 역학, 미토콘드리아와 소포체 역학, 단백질 축적과 현지화 등을 포함 할 수있다분자 신호 (예., 인산화 칼슘). </li></ol> 샘플 3. 준비 <ol><li> 표준 세포 배양 접시에 세포 인증을 성장 습한 세포 배양기 (예, 37 입출력 C, 5 % CO 2, 80 % 상대 습도). <ol><li> EBSS와 MEM에 HT1080 세포를 성장. 10 %의 v / V의 FBS, 1 % V / V 펜 / 스트렙토 1 % V / V 피루브산 나트륨, 1 % V / V 비 필수 아미노산과 미디어를 보완. </li></ol></li><li> 영상에 이틀 전에, 공인 된 멸균 층류 흐름 후드에 12 잘 # 1.5 유리 바닥 접시의 3 우물에 판 50,000 HT1080 FUCCI 세포. 실험의 시작 ~ 60 % 합류점을 달성하기 위해 도금 된 세포의 수를 조정한다. 세포주 실험 세포 밀도의 특성에 따라 덜 수있다. 주 : 세포 밀도가 세포주의 성장 및 실험 결과에 지대한 영향을 미칠 수있다. 최소화하기 위해 세포를 계산 실험 - 투 - 실험 variabilit밀도로 인해 Y. <ol><li> 환경 챔버와 실험에 필요한 조건, 하나의 잘 요리의 플레이트 세포 (일반적으로 35- 또는 60-mm), 4도 35 mm 요리, 6, 12, 24 웰 세포 배양 접시, 또는에 따라 다양한 형식의 슬라이드 커버 슬립. 세포 배양 플라스틱을 통해 # 1.5 대부분의 대물 렌즈는 유리의이 두께에 최적화 된 바와 같이 유리, 및 이미징 유리 바닥 판을 사용하는 것은 매우 좋지 않습니다. 참고 : 일부 세포주의 성장과 유리에 생존하지 않습니다. 이러한 경우, 유리 (예. 폴리 라이신이나 콜라겐) 세포 접착 성을 향상시키기 위해 코팅 될 수있다. 이 실행 가능한 옵션의 경우 일부 기업은, 그것은 경험적으로 결정해야 광학 세포 배양 플라스틱을 생산하고 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 환경 상공 회의소 셋업 <ol><li> 모든 실험 이전에, 설정 환경 챔버 37 O C를이 습도 80 % ~에서 동작 등 샘플 위치에서의 온도가되도록. 대부분의 세포 배양 인해 배지 중탄산 나트륨 완충액 5 % CO 2 / 밸런스 공기 분위기에서 성장한다. 셋업에 따라, 중 5 % CO 2 환경 컨트롤러를 설정하고 공기와 함께 100 %의 CO 2를 혼합, 또는 5 % CO 2 / 밸런스 공기 가스 인증, 미리 혼합 사용합니다. 가스 흐름 속도에 대한 제조 업체의 지시 사항을 따르십시오. 참고 : 일부 세포주는 CO이없이 유지 될 수있는 경우에 CO 2 -independent 배지에서 자란다. 특별히 설계된 영상 미디어 autofluorescent 화합물의 첨가를 제한하는도 사용할 수 있습니다. 목적하는 세포 유형에 대한 논문 매체에서 성장 미리 실험적으로 결정되어야한다. </li><li> 촬영에 앞서, 물이 저수지는 멸균 증류수로 (제조업체의 지침에 따라) 충전되어 있는지 확인합니다. 원하는 온도 설정으로 환경 챔버를 켜고 현미경 무대 삽입에 배치합니다. 가스를 저장하려면,이 시점에서 흐름을 시작하지 마십시오. 참고 : 단계 탑 챔버와 무대 삽입 및 / 또는 실험에 모션 아티팩트를 도입 할 수 챔버에 연결 코드에 어떤 긴장 사이에 여유 공간이있는 경우. <ol><li> 무대에 커플로에 실을 실을 삽입하기 전에 단계 삽입 구멍의 가장자리 위에 파라핀 필름의 조각을 놓고, 어떤 연결이 실을 당겨되지 않았는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 챔버 (37) 오 C.에 평형을 허용 세포 생리학에 영향을 드리프트를 도입 할 수 촬상시의 온도의 변동을 방지하기 위해 안정적인 온도를 유지한다. 도달 온도 평형은 일반적으로 환경에 따라 1 시간 30 분을 필요로한다. <ol><li> 승온하면서 챔버로 우물에서 물 &#39;더미&#39;요리를 삽입합니다. 챔버을 위해 도움을 물을 모방하여 샘플을 가득 이미징 요리, 충분히 예열 및 안정화된다. 예열 멸균 수와 실 충진온도 안정에 필요한 시간을 감소시키고, 시험 물질의 첨가시의 온도 저하를 최소화한다. </li></ol></li></ol> 5. 현미경 셋업 <ol><li> 현미경, 관련 컴퓨터 및 필요한 주변 장치의 전원을 켭니다. <ol><li> 광원에 따라 필요할 때까지 전원을 켜 기다릴 (예., LED). </li></ol></li><li> 낮은 위치에 대물 터릿으로 사용될 20X 0.7 NA 대물 렌즈를 선택한다. </li><li> 대물 위에 시료를 놓고 -이 샘플 챔버 내에있을 때 쉽게 셀을 찾을 수 있도록한다. </li><li> 이들은 이전 실험으로부터 공지되어있는 경우,이 시점에서 촬상 파라미터를 정의한다. </li></ol> 6. 현미경 챔버에 세포를 운반 <ol><li> 운송 세포 환경 챔버로 인큐베이터에서 이미지화한다. 이 비교적 낮은 CO 2의 효과를 제한하기 위해 신속하게 수행되었는지 확인 </서브&gt; 분위기는 세포에 온도를 감소. 샘플 운송 및 유출의 경우 청소에 대한 모든 제도적 바이오 안전성 가이드 라인을 따르십시오. <ol><li> 큰 환경 변화를 방지하기 위해 밀봉 된 스티로폼 용기 또는 절연 가방에 세포를 놓습니다. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 챔버에 샘플 영상 접시를 삽입합니다. </li><li> 세포는 환경 챔버 내에 확보 한 후, 안정된 환경을 유지하고 즉시 분위기 가스의 소스 (S)에 설정하는 챔버를 밀봉. <ol><li> 일부 환경 챔버 타이트한 밀봉 덮개를 사용하지 않기 때문에, 성장 배지 위에 증착 멸균 층, 배아 인증 미네랄 오일을 지연한다. 유리 이미징 영역을 방해하지 않도록주의 샘플 접시의 경계-가장자리 주위 가스 투과 파라핀 필름 랩. 지역화 보조 가습 수단을 이용할 수있다. perfor을 감소 할 수있는 샘플 접시의 뚜껑에 응축명 시야 현미경 mance. </li></ol></li><li> 초기 실험 기간 동안 열 드리프트의 영향을 최소화하기 위해, 시간 경과를 시작하기 전에 30 분 동안 기다린다. 필요한 시간은 영상 접시 크기 및 기타 요인에 따라 달라집니다. 경험적으로 결정합니다. </li></ol> 7. 이미지 설정 <ol><li> 최선의 데이터를 나타냅니다 선택 이미징 조건. , 노출 시간을 제한 낮은 강도의 빛을 이용하여 빛의 긴 파장에 의해 여기되는 프로브를 선택하여 광독성을 방지하기 위해 조치를 취하십시오. </li><li> 각 위치에 대하여 X, Y 및 Z 평면 원하는 파장 (들)을 정의하는 묘화한다. 시간 해상도 위치와 파장의 개수에 의해 제한된다. 대부분의 세포 과정의 장기간의 시간 경과의 경우, 하나의 화상마다 취득 10 - 20 분; 높은 시간 해상도 (짧은 간격, 예. 1 분) 이상의 데이터 포인트 때문에보다 강력한 세포 추적을 제공 할뿐만 아니라 더 통합 결과빛 노출과 큰 데이터 세트. <ol><li> - 50 밀리 초, 텍사스 레드 / TRITC - 40 밀리 초, 브라이트 - 20 밀리 초 FITC / GFP : HT1080 FUCCI 동적 녹색과 적색 형광 단백질을 가지고 (대표 결과를 참조), 다음 노출 시간을 사용합니다. 2 × 2 빈을 사용합니다. </li></ol></li><li> 고급 설정에서 기본 매개 변수를 사용하여 소프트웨어 제어 자동 초점을 사용합니다. 권장 스텝 크기 10 μm의의 자동 초점 범위를 정의합니다. 시간 경과를 시작하기 전에이 작업을 수행해야합니다. 시야 이미지 자동 초점 결코 형광 광독성 및 광표백을 줄일 수 있습니다. <ol><li> 전동 무대와 모든 현미경에 소프트웨어 제어 자동 초점 시스템을 사용하여, 직접 샘플에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, 실험의 인수 속도를 제한 할 수있다. 연속 초점 시스템이 더 위치를 허용, 시간 경과 현미경 잘 작동 속도를 향상 제어 하드웨어 이미징 또는 취득의 높은 비율합니다. 그러나공기 유리 인터페이스의 검출에 의존 우물에서 유리 두께의 변화와 샘플의 초점을 잃을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 미디어 O 37 ℃로 가온 한 원하는 약물 농도를 함유하는 매체의 절반을 교체 일부 미디어 교체 열 드리프트를 줄일 수 있습니다. 이 실험의 조건은 차량 (DMSO), 1 μM의 selinexor 10 μM PD0332991이다. 참고 :이 단계는 또한 일시 중지 및 실험을 다시 시작하여 인수를 시작한 후 수행 할 수 있습니다. 이 단일 세포의 사전 및 사후 약물 반응의 종 추적 할 수 있습니다. 약물의 안정성이나 신진 대사하다면 일시 중지하고 미디어가 동일한 방법으로 수행 할 수 있습니다 대체 관심사입니다. 약물 분해 또는 신진 대사를 테스트하기 위해, 처리 된 세포의 미디어는 약물 작용을 테스트하는 순진 세포에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 시간 경과를 시작합니다. </li><li> 시간 경과가 실행됨에 따라 이미징 필드가 초점과 chambe에 남아 있는지 확인r은 습기 (37) 오 C.을 유지 <ol><li> 시점 사이의 시간 간격 동안 획득을 일시 중지하여 필요에 따라 포커스를 조정한다. </li></ol></li><li> 필요한 경우, 더 이상 실험 동안 챔버에 물을 추가 할 수 있습니다. O 37 ℃에서 미리 가온 멸균 증류수를 첨가하여 냉각 실 피 </li></ol> 8. 시간 경과 종료 <ol><li> 실험이 실행을 완료하면이 자동으로 중지로 설정되지 않은 경우, 인수를 중지합니다. </li><li> 제대로 데이터가 손실 될 수 있습니다 완료되지 않은 경우 대부분의 소프트웨어 패키지를 자동으로 수집하는 동안 저장되지만 시간 경과가 하드 드라이브에 제대로 저장되었는지 확인하십시오. </li><li> 현미경에서 챔버를 제거하고 승인 기관 바이오 안전성 절차에 따라 생물학적 위험 폐기물로 세포를 폐기하십시오. </li></ol> 9. 종 추적 및 분석 시간 경과 데이터의 <ol><li> 인 분석을위한 방법론을 선택관심있는 생물학적 과정에 적합합니다. 많은 ImageJ에 대한 플러그인, 매트랩을 사용하는 프로그램 및 사용자 지정 플랫폼은 특정 애플리케이션을 위해 제작되었습니다. 도 4 및도 5에 설명 된대로 다음 방법은 핵 핵 형광 프로브의 분석의 추적을 포함한다. </li><li> ImageJ에의 활용 채널에 대한이 .tif 이미지 스택을 엽니 다. 또는, Bioformats 플러그인을 사용하여 직접 ImageJ에의 수집 프로그램에서 열려있는 기본 파일입니다. </li><li> 시야 이미지 또는 (사용 된 경우) 핵 라벨 채널을 사용하여 하나의 세포의 핵 내에서 ROI (region of interest)를 치고, ROI 관리자에 추가. 주 : 묘화 세포 핵 라벨이있는 경우 (예를 들어, 히스톤 H2B-EGFP.) 다음, 자동 세포 추적 시간을 통해 관심 (로아) 각각의 핵을 표현 영역을 만드는 데 사용될 수있다. </li><li> 다음에, 시점을 진행하고 동일한 nucleu 내에서 ROI의 위치를에스. 투자 수익 (ROI) 관리자에게 투자 수익 (ROI)을 추가합니다. </li><li> 추적 셀룰러 이벤트 (분열, 세포 사멸, 등.) 또는 셀이 더 이상 추적 될 수 없다있을 때까지 개별 셀 로아을 계속 (즉., 프레임 밖으로 이동하거나 실험이 종료 됨). </li><li> 로아 그들이 필드에있는 시간을 통해 세포 확립되었을 때, 관심있는 형광체에 채널을 중첩. 각 시점에 대한 각 채널의 평균 형광 강도를 측정한다. 나중에 사용하기 위해 ROI 목록을 저장합니다. <ol><li> 각종 측정은 다른 실험에서 애플리케이션에 대한 ROI 내에서 이루어질 수있다. (예. 투자 수익 (ROI), 통합 강도 등 내 강도를 의미한다.) 분석 방법을 선택하는 메뉴가 나타납니다 ... 분석 → 설정 측정을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 추적하는 동안 각각의 세포에 대한 세포의 운명 (예., 세포 사멸, 분할, 생존을) 참고. 이것은 생존 곡선과 furthe의 생성을 허용R 인구 분석. </li><li> 두 채널에 대한 평균 강도, 치료제 (그림 5B, C)에 반응하여 세포주기 역학을 표시하는 산점도를 만들 수 있습니다. 주 : 플롯 시간 동안 각 셀에 대해 생성되거나 추적 세포 집단을 통해 평균화 될 수있다. 양적 이미징은 암 치료법에 응답하여 복잡한 세포 반응 관계를 구축 중요 할 수있다. 장기간 경과 현미경 길이 추적 및 데이터 분석 현미경 및 분석 도구의 유형을위한 많은 옵션, 다단계 공정이며,도 1에 제공된 일반적인 개요를 따른다. </li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

시간 경과 현미경 및 종 추적의 장점 이 연구자들은 각 셀 그들의 운명뿐만 아니라 전체 모집단을 추적 할 수 있도록, 상기 현미경은 약물 반응 종의 연구를위한 이상적인 도구이다. 세포 집단 내에서 약물 반응의 다양성은 항암 치료 설계를위한 중요한 문제입니다. 단일 세포의 종 추적 수사관이 변화를 관찰하고 세포 인구에 관한로서 기본 메커니즘과 결과를 이해하기 시작 할 수 있습니다. 형광 프로브의 다양한 활용하여 관찰하고 일반적인 희귀 응답 표현형 모두를 이해하는 방법의 군중을 제공한다. 인구 응답 타이밍과 다른 세포 운명의 기여는, 치료시 세포주 또는 국가 간의 응답의 특정 표현형과 운명, 그리고 차이 사이의 관계를 배울 수있는 예입니다. 많은 암 관련 프로세스를 연구 할 수있다. 이 문서에서 강조되지 않은 일부는 세포 사멸, 자식 작용과 세포 사멸 및 괴사 기자 39-42, 세포 침공 43, 44, 및 세포...

라이브 세포 현미경 단셀 길이 추적 새로운 기술이 아니다. 최초의 현미경에서 매니아와 과학자들은 하나의 세포와 생물, 자신의 행동, 개발 1-3을 관찰하고 연구 하였다. 1950 년대에 밴더빌트 대학에서 후반 데이비드 로저스에서 유명한 예는 황색 포도상 구균 박테리아와 식균 작용 (4) 결국 프로세스를 쫓는 혈액 도말 검사에서 인간의 호중구를 보여줍니다. 이 라이브 셀 영화는 하나의 실험에서 관찰하고 상관 관계를 할 수있는 방법을 여러 프로세스의 우수한 그림이다 : 화학 그라데이션, 역학 및 세포 운동의 속도를 감지, 세포 역학, 접착 및 병원체의 식균 작용을 형성한다. 완전 자동화 현미경 고감도 디지털 카메라들의 출현은 세포 생물학 F까지의 기본적인 질문을 현미경을 사용하여 연구자의 수가 증가 가져왔다세포가 5,6를 이동하고 역학 및 멤브레인 인신 매매 9-11 소기관에 7,8를 분할하는 방법 롬. 비 형광, 1953 년 프리츠 제르 니커의 노벨상을 얻고 위상차 (PC), 미분 간섭 대비를 포함하여 시야 현미경 (DIC) 미세 소관 번들을 포함한 세포와​​ 핵뿐만 아니라 하위 세포 구조의 관찰을 허용 , 염색체, 핵소체, 세포 기관 역학, 두꺼운 액틴 섬유 (12). 유전자 형광 단백질을 인코딩 및 세포 소기관에 대한 형광 염료의 개발은 극적으로 시간 경과 현미경 13-15 영향을하고있다. 이 기사의 초점이 아니라 동안, 세포 타원체와 현장 (생체 내에 현미경) 공 초점 및 광자 현미경을 사용하여 이미징은 접근의 또 다른 확장을 나타내고, 사용하고 이러한 방법 16-19을 논의 뛰어난 기사가있다. 안티 canc에 대한 세포의 반응어 약물이나 천연 제품은 분자 및 세포 규모에 따라 결정됩니다. 이해 세포 반응과 운명 다음 치료는 종종 단일 세포 측정 인구 평균 분석 (예., 면역, 전체 잘 측정), 또는 면역 형광 검출에 고정 된 시간 지점 및 유동 세포 계측법을 포함한다. 집단 내의 약물 단일 세포 반응의 이질성은 종양, 특히 포화에서 동일한 약제로 처리 된 세포주와 종양을 본 반응 다양성의 일부를 설명 할 수있다. 주어진 단일 셀 또는 셀의 인구를 따르지 세로 방법 장기 분자 반응 경로의 직접적인 연구 할 수있는 덜 일반적인하지만 매우 강력한 방법입니다, 서로 다른 표현형 (예., 세포 사멸 또는 세포 분열), 관찰 세포 간 집단 내의 변화 방법 및 이러한 요소 인구 응답 20-22 역학에 기여한다. 낙관적, 수있는관찰과 약물들이 종종 실패하는 이유, 작동, 및 최선의 방법을 사용하는 방법에 대한 우리의 이해를 개선하는 데 도움이됩니다 단일 세포 반응을 정량화한다. 장기적으로 시간 경과 현미경, 종 추적 및 약물 반응의 분석 기술은 많은 연구자에 사용할 수 있으며 표현형 응답 (20, 21)을 관찰하기 만 투과광을 이용하여 간단 할 수있다. 접근법의 주요 구성 요소는 : 관심있는 세포의 적당한 제제 환경 챔버와 자동화 현미경, 카메라가 획득 및 시간 경과를 검토 할 이미지를 저장하고, 소프트웨어를 측정하고, 세포를 분석하는 컴퓨터로 통합 및 형광 바이오 센서. 우리는 시야 및 / 또는 위드 epifluorescent 현미경을 사용하여만큼 몇 일 동안 배양 된 세포의 시간 경과 현미경을 수행하기위한 많은 조언과 자세한 프로토콜을 제공합니다. 배양에서 성장 될 수있는 임의의 세포주를 사용할 수있다이 프로토콜항암 치료에 대한 자신의 반응을 연구합니다. 우리는 수집 된 데이터의 예를 제공하며, 간단하게 다른 프로브 타입의 장점과 장기간 경과 및 종 추적 단점 논의 상이한 유전자 부호화 형광 바이오 센서 및 위상차 현미경의 일례를 분석하여, 어떤 일 수 비 - 직접 접근, 우리가 접근 방식을 사용하여 고려하지 않은 경험이 연구자들에게 관심과 가치가있을 것입니다 희망 약간의 변화에​​서 이해하기 어려운, 경험이 풍부한 연구자하다이 방법에 대해 배웠습니다.

<table><tbody><tr><td>탁솔 (파클리탁셀)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>미세소관 안정화 약물</td></tr><tr><td>에토포시드</td><td>셀렉켐</td><td>S1225</td><td>토포이소머라제 II 억제제</td></tr><tr><td>셀리넥서 또는</td><td>카리오팜 치료제</td><td></td><td>(XPO1/CRM1 억제제),</td></tr><tr><td>키네신-5 억제제</td><td>머크 세로노</td><td>또는</td><td>선물, American Custom Chemicals Corporation에서도 구할 수 있습니다. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>세포 성장 매체</td><td>HyClone (Fisher) 또는 Mediatech</td><td></td><td>많은 회사 사용 가능</td></tr><tr><td>5 % CO2 / 균형 공기, 인증</td><td>된 Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35mm 접시, 20mm 유리 바닥</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>많은 회사 사용</td></tr><tr><td>가능 35mm 4 웰 접시, 20mm 유리 바닥</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>많은 회사 사용 가능</td></tr><tr><td>35mm 접시, 격자 유리 바닥</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>많은 회사 사용 가능</td></tr><tr><td>멀티 웰, 유리 바닥</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>많은 회사 사용</td></tr><tr><td>가능 Olympus IX81 도립 형광 현미경</td><td>올림푸스 올림푸</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스 IX2-UCB 컨트롤러</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III 전동 스테이지</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV 챔버</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>환경 컨트롤러 유닛</td><td>Invivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD 컨트롤러</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 발사</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA 라이트 엔진</td><td>루멘 콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT 클럽 화 챔버</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

유리를 통해 보면 : 시간 ​​경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

항암제에 대한 단 전지의 반응은 모집단 응답을 결정하는데 크게 기여하고, 따라서 전체 결과에서 중요한 요인이다. 면역은 유동 세포 계측법 고정 세포 실험은 종종 세포가 항암제에 반응하는 방법을 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 방법은 중요하지만, 몇 가지 단점이 있습니다. 암과 정상 세포간에, 다른 암 유래의 세포 및 과도 희귀 응답 사이의 약물 반응의 다양성 인구 평균 어 세이를 이용하여 직접 추적 종을 분석 할 수없이 이해하기 어렵다. 현미경은 특히 이미지 살아있는 세포에 적합합니다. 기술의 발전뿐만 아니라 세포 추적뿐만 아니라, 세포 반응의 다양한 관찰을 가능하게하는 해상도에서 일상적으로 이미지 세포에 우리를 가능하게한다. 우리의 연속적인 시간 경과 이미징을 허용 자세히 접근 방식을 설명기본적으로 한 일반적으로 96 시간까지 원하는대로에 대한 약물 반응 동안 세포. 접근 방법의 변형을 사용하여, 세포 주에 대해 모니터링 될 수있다. 유전자 인코딩 된 형광 바이오 센서 수많은 프로세스, 경로 및 응답의 고용으로 이어 할 수 있습니다. 우리는 추적 및 세포 성장 및 세포주기 진행 염색체 역학, DNA 손상의 정량화 및 세포 사멸 등을 실시 예를 나타낸다. 우리는 또한 기술과 유연성의 변화를 토론하고 몇 가지 일반적인 함정을 강조 표시합니다.

장기 시간 경과 현미경과 직접 종 추적은 약물 반응 중 많은 항암 효과를 연구 할 수 있습니다. 도 1의 일반 개요에 따라, 세포의 여러 실시 예는 추적 항암 약물로 치료하는 것이 유효 형광 리포터 발현 도시 한 다른 방법을 이용하여 분석한다. 혼자 위상차 현미경은 매우 유익하고 견고 유사 분열, 유사 분열의 기간과 체포, 비정상적인 세포 분열 및 세포 사멸 21,23,24 대 간기에보고합니다. 세포 분열을 대상으로 약물 종종 불리는 항 - 유사 분열 약물. 개발이 계속 (500)로 처리 (2) 및 동영상 1 및 p53의 상태 만 다른 유사한 유방암 유래 MCF7 세포주의 쌍의 2 표시 예가도</strong...

여기에서는 항암 치료제에 반응하는 단일 세포를 종단으로 추적하는 장기 타임 랩스 현미경 검사 방법을 설명합니다.

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

본 절차의 전반적인 목표는 배양된 단일 세포에서 항암 치료 반응을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 불균질한 치료 반응 및 세포 운명을 포함하여 암 연구 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 먼저, 인증된 멸균 라미나 플로우 후드 내에서 텍스트 프로토콜에 따라 배양 인증 디시에 HT1080 세포를 준비하고, 습윤 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양하십시오.이미징 2일 전, 1.5번 유리 바닥 12-웰 플레이트의 필요한 웰당 50,000개의 HT1080 FuGENE 세포를 분주합니다. 실험 시작 시 약 60%의 합쳐짐(confluence) 정도에 도달할 수 있도록, 세포의 성장 속도와 사용한 플레이트에 따라 분주하는 세포 수를 조절하십시오.환경 챔버를 습도 약 80%, 시료 위치의 온도는 37 °C로 설정하십시오. 제조사의 지침에 따라 수조에 멸균 증류수가 채워져 있는지 확인하십시오. 그런 다음 환경 챔버를 원하는 온도 설정으로 켜고, 이를 현미경 스테이지에 배치하여 설정하십시오.스테이지 상단 챔버와 스테이지 인셋 사이에 빈 공간이 있는 경우, 챔버를 삽입하기 전에 스테이지 인셋 개구부의 가장자리에 파라핀 필름 조각을 덮어 챔버를 스테이지에 결합시키십시오. 두 경우 모두 모션 아티팩트를 유발할 수 있으므로, 연결 부위가 챔버를 당기고 있지 않은지 확인하십시오. 물이 담긴 더미 디쉬를 챔버에 넣고, 챔버가 37 °C로 평형을 이룰 때까지 기다린 후 안정적인 온도를 유지하십시오.이미징 설정을 위해 현미경, 컴퓨터 및 필요한 주변 기기를 켭니다. 광원의 종류에 따라 필요할 때까지 전원을 켜지 말고 대기하십시오. 대물렌즈 터렛을 낮은 위치에 두고, 20x 0.7 개구수 대물렌즈를 선택하십시오.그 다음 샘플을 대물렌즈 위에 배치하면, 샘플이 챔버 내에 있을 때 세포를 더 쉽게 찾을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미징할 세포를 환경 챔버로 옮긴 후, 안정적인 환경을 유지하기 위해 챔버를 밀봉하고 대기 가스를 켭니다. 다음으로, 노출 시간을 제한하고 낮은 강도의 빛을 사용하여 광독성을 방지할 수 있는 이미징 조건을 선택합니다.X, Y, Z 평면과 이미지를 촬영할 각 위치에 필요한 파장을 설정합니다. 대부분의 세포 공정의 장기 타임랩스 촬영의 경우, 10분에서 20분마다 이미지를 한 장씩 획득하십시오. 시간 해상도가 높을수록 더 많은 데이터 포인트와 더 견고한 세포 추적이 가능하지만, 누적 광노출량이 증가하고 데이터 세트의 규모가 커집니다.HT1080 FuGENE은 동적인 녹색 및 적색 형광 단백질을 가지고 있으므로, 다음의 노출 시간을 사용하고 2x2 빈(bin)을 설정하십시오. 고급 설정에서 기본 설정을 사용하여 소프트웨어 제어 자동 초점 기능을 활성화하십시오. 권장 단계 크기로 10 micrometers의 자동 초점 범위를 지정하십시오.열 드리프트를 줄이기 위해 실험용 디쉬 내 배지의 절반을 37°C로 데운 원하는 약물이 포함된 배지로 교체하십시오. 마지막으로, 타임랩스를 시작하고 텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 획득하십시오. 이 영상들은 p53 상태만 서로 다른 유방암 유래 MCF7 세포주 쌍의 예시를 보여주며, 이들은 kinesin-5를 억제하여 유사분열 정지를 유도하는 항암제로 처리되었습니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 안정적인 p53 knockdown을 통해 p53을 제거하면, 세포는 유사분열 종료 후 정지하는 대신 정지하지 않고 두 번째 유사분열 단계로 진입하는 반복적인 사이클을 거치며 분열 없이 유사분열을 빠져나옵니다. 여기에는 mCherry가 융합된 염색질 마커 Histone 2b와 EGFP가 융합된 beta tubulin을 안정적으로 발현하는 자궁경부암 유래 Hela 세포가 나타나 있습니다. 미세소관 안정화 약물인 paclitaxol을 처리하면 유사분열 동안 염색체의 정렬과 분리가 방해받아, DNA 손상에 취약한 핵 팽대(nuclear bulges)와 미세핵(micronuclei)이 형성됩니다.이 세포주는 CDT1(오렌지색)과 geminin(녹색)에 대한 두 가지 형광 유비퀴틴 세포 주기 지표를 안정적으로 공동 발현하며, 세포 주기를 정상적으로 진행합니다. 동일한 세포에 CDK46 억제제를 처리하면, 세포는 G2기를 거쳐 정상적으로 분열한 후 G1기에서 강력하게 정지하며, 이는 성장하는 종양에서 효과적인 세포 정지 효과를 나타낼 가능성을 시사합니다. 이 기술의 주된 장점은 이러한 반응을 추론하는 대신, 며칠 동안 단일 세포의 반응을 실시간으로 직접 관찰할 수 있다는 점입니다.

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 마우스 모델에서 종양으로의 이중특이성 항체 유도 T 세포 이동을 추적하는 방법을 보여줍니다. 루시페라아제(Luciferase)에 의해 형질도입된 effector T 세포를 피하 종양 세포 이종이식편을 통해 마우스에 주입합니다. 그런 다음 이중특이성 항체를 도입하여 T 세포와 종양 세포에 결합합니다. T 세포의 국소화는 생물 발광 이미징을 사용하여 추적되며, 신호의 크기는 T 세포가 종양으로 침투하는 정도를 나타냅니다.

종양에 대한 이중특이성 항체 유도 T 세포 이동을 추적하는 In Vivo 기술

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

이 프로토콜에서는 이미지 거주 종양 침투 CD8 T 세포 인간 폐 종양 조각 내 붙일 결합 된 항 체와 함께 표시 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 CD8 T 세포 이동의 실시간 분석을 허용 한다.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

생체 내 면역형광 국소화(IVIL) 방법은 생체내 종양 표적화 및 ex vivo 면역염색의 조합을 사용하여 살아있는 유기체에서 종양학적 목적을 위해 항체 및 항체 접합체의 생체 분포를 검사하는데 사용될 수 있다. 방법.

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

암세포, 특히 4T1 마우스 유방 암종 세포에 대한 대식세포 식세포 활성은 본 연구에서 영상화되었다. 살아있는 세포 동배 모델은 형광및 차동 간섭 대조 현미경의 조합을 사용하여 확립되고 관찰되었다. 이 평가는 이미징 소프트웨어를 사용하여 멀티포인트 타임랩스 비디오를 개발하는 데 사용되었습니다.

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

여기서 우리는 마우스 종양 제노이식 모델에서 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 프로토콜을 제시한다.

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

이 연구는 소아 미만성 정중선 신경아교종 세포주에 적용되는 생3D 세포 면역세포화학 프로토콜을 제시하며, 3D 세포 침습 및 이동과 같은 동적 과정에서 원형질막에서 단백질의 발현을 실시간으로 연구하는 데 유용합니다.

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

여기에서 우리는 T 세포 참여 이중특이적 항체의 항종양 효능 및 메커니즘을 평가하기 위한 연구에서 종양에 대한 이중특이적 항체 유도 T 세포 이동의 생체 내 추적을 용이하게 하기 위해 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하는 방법을 설명합니다.

루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적

이 프로토콜은 원형질막 단백질의 나노스케일 공간 조직을 해명하기 위한 단일 항체 표지(SAL)를 설명합니다. 단일 분자 수준에서 누적된 항체-에피토프 상호작용을 활용하여 막 SAL(mSAL)은 국소 에피토프 분포를 지도화하는 동시에 천연 세포 환경에서 항체 결합 행동을 포착합니다.

단일 항체 표지를 이용한 막 단백질의 단분자 위치 현미경

학습하세요 시간 경과 현미경을 이용한 단일 세포 추적 기법으로 항암 치료 반응을 관찰하는 방법을. HT1080 및 HeLa 세포주를 사용하여 실시간으로 세포 운명과 치료 효능을 분석할 수 있습니다.

유리를 통해 보면 : 시간 ​​경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

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