Name: 약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 학습하세요 신경 줄기 세포 기반 EMT 연구 모델을 통해 비이동성 세포의 이동 유도 및 약물 발굴 방법을. 이 기술은 고급 신경교종 및 기타 상피암 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 MHS와 AG (SNF IZLIZ3_157230)에 부여하여 바젤 과학 재단의 대학과 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다. 우리는 감사 : 박사 타니아 리 날디 Burkat을 아낌없이 인프라를 제공하기 위해; 토론과 의견에 대한 Bettler 그룹의 모든 구성원. 우리는 게르하르트 Dorne (라이카, 스위스) 풀 HD MC170 비디오 카메라의 전문적이고 유능한 설치 (라이카, 스위스) 감사합니다.

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

EMT 분석을 활용 NSCs을위한 표준화 된 시스템이 설명이 연구에서 (보충 그림 3에 요약). 표준화 재현성 (표 1 및 2)을 보장한다. NSCs의는 개발 피질에서 일반적으로 EMT를 받아야하지 않는 조직을 파생됩니다. 이 EMT 초기 단계의 분석을 위해 유리하다. EMT의 초기 단계는 적절하게 유전 적 변화를 축적하고 이미 EMT 기능을 채택하고있다 종양 세포에서 공부 할 수 없습니다. 또한, 일차 종양 샘플은 대부분의 악성 종양 이종 침습 및 비파괴 세포를 모두 포함하고 있기 때문에 EMT 이해할 적합하지 않다. 제시된 프로토콜은 EMT 유도의 초기 단계를 연구하는 새로운 모델 EMT 연구자를 제공합니다. (첫 번째 단계 Zeb1 및 Zeb2 동안 제 2 단계 Twist2 동안, 상향 조절된다 Figur을 : 여기에서 우리는 Hogan 박사와 트위스트 가족의 키 EMT의 유도가 순차적으로 활성화되는 것을 보여전자 6). 이전에, ...

배아 발달의 여러 단계 동안, 상피 세포가 서로 (예를 들어, 꽉 접합)에 강한 준수를 잃고 중간 엽 전이 (EMT) 1 과정이라고 상피의 철새 표현형을 획득. EMT는 같은 간엽 세포 신경 능선 부가적인 세포 유형의 형성 상기 (2)로부터 neuroepithelium 편석 인구 요구된다. EMT는 배아 단계 동안 만 중요하지만 병변 4 탈수 초성 이러한 상처 치유 (3) 및 중추 신경계 (CNS)와 재생 성인 유기체의 생리 학적 과정을 유지할 성인기 이후 단계에서 요구되지 않는다. 상피 종양은 궁극적으로 암의 진행 1,3로 이어지는, 이동, 침윤 및 전이에 대한 개시 단계로 EMT를 활성화하는 것으로 알려져있다. EMT는 참으로 중앙에서 강력한 마이그레이션 1,3에 연결되어 있습니다. C의 세포 단계onditioning, 시작 겪고 및 EMT를 유지 완전히 이해하고 추가 조사가 필요하지 않습니다. 여기서, 정의 된 성장 인자와 미디어 (NO 혈청 효소없이 사용)와 NSCs을 기반으로하는 표준 시험 관내 EMT 모델 시스템이 제공된다. 이 모델 시스템은 EMT 작업 과학자 관련이있다. 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 단백질 가족 모두 개발 및 질병 1 EMT에 중요한 것으로 나타났다. 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 가족도 제공 시스템에 참여하고 있습니다. 이 시스템은 일반적으로는 EMT EMT 유도시 초기 사건의 연구에 특정 이점을 제공받지 않는 전뇌의 특정 영역에 기초한다. 같은 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 단백질과 같은 키 EMT의 유도가, 또한 CNS 외부 조직 시스템에서 EMT에서 발견되기 때문에 모델 시스템은 잠재적으로, 중추 신경계 외부 상피 세포의 EMT 연구에 적용 할 수 있습니다. 이 모델의템은 특히 줄기 세포의 일반적 특징과 EMT을 연구 개발 피질에서 NSCs을의 표준화 분리 할 수​​ 있습니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 NSCs의 절연 유도 EMT 및 FGF2 및 BMP4의 영향 하에서 후속 이동을 연구 하였다. 우리는 FGF-따라서 모델 시스템의 유효성을 검사, 세포의 이동을 촉진하는 TGFβ가-신호와 상호 작용을 BMP는-신호 관찰.

<table><tbody><tr><td>BMP4, rhBMP4</td><td>RnD 시스템&nbsp;</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장 인슐린 시</td><td>그마&nbsp;</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Boyden 챔버, CytoSelect 세포 침입 분석</td><td>Cell Biolabs</td><td>CBA-110</td><td>24 웰 플레이트 시스템</td></tr><tr><td>그리드</td><td>Ibidi 500mm 접시, 35mm</td><td>80156</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange</td><td>Life Technologies</td><td>C10045</td><td>플라즈마 멤브레인 염료, 1:1,000에서 사용.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>LifeTechnologies</td><td>D1306</td><td>재고 5 mg/ml. 사용 1:10,000. 암성. 적절한 보호(장갑, 코트, 고글)가 필요합니다.</td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1 중간 병</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>FGF2, rhFGF2</td><td>RnD 시스템</td><td>233-FB-01M</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine, 소</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F4759</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 보충제&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>픽셀 측정 기능이 있는 그래픽 소프트웨어</td><td>Fiji</td><td>fiji.sc/Fiji</td><td>버전 2.0.0-rc-30/1.49s</td></tr><tr><td>HBSS 미디어</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>인간 아포-트랜스페린</td><td>시그마</td><td>T1147</td><td>폐 자극성 가능성 흡입을 피하십시오. 적절한 보호 장치를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Nestin, 마우스 안티 Nestin 항체</td><td>Genetex</td><td>GTX26142</td><td>1:100에서 사용, 4% PFA 고정, Triton X100에서 0.1%</td></tr><tr><td>Olig2, 토끼 안티 Olig2 항체</td><td>제공 Hirohide Takebayash</td><td>개인 재고</td><td>1:2,000에서 사용, 4% PFA 고정, Triton X100에서 0.1%</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신/곰팡이존</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Podoplanin, 마우스 안티 Podoplanin 항체</td><td>Acris</td><td>DM3614P</td><td>1:250에서 사용, 4% PFA 고정, Triton X100</td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma를 피하십시오&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>푸트레신</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P5780</td><td>피부 및 눈에 자극성이 있으나. 적절한 보호가 필요합니다.</td></tr><tr><td>아셀렌산나트륨</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Sox10, 토끼 안티 Sox10 항체</td><td>Millipore Chemicon</td><td>AB5774</td><td>1:200에서 사용, 4% PFA 고정, 0.1%TGFb1에서 Triton X100</td></tr>, <tr><td>rhTGFb1</td><td>RnD 시스템</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>코팅되지 않은 페트리 접시</td><td>팔콘코닝</td><td>351029</td><td></td></tr></tbody></table>

약 발견에 적합 emt 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 상피 세포가 중간 엽에 transdifferentiating의 과정을 설명합니다. EMT는 또한 일반적으로, 아교 모세포종에서 가장 흔한 악성 뇌종양을 발생 배아 개발하는 동안 기본 과정이다. EMT는 유방암, 폐암, 대장 암, 위암을 포함하는 뇌 밖에 여러 암에서 관찰되었다. EMT 중앙 이​​동, 침윤 및 전이 형성을 촉진하여 악성 종양에 연결되어 있습니다. EMT 유도의 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 여기에서 우리는 대뇌 피질의 신경 줄기 세포 (NSCs을) 이후 EMT 유도의 표준화 분리에 대한 체외 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 하나의 세포 이식편의 배양을 사용하는 유연성을 제공한다. 이 시스템에서, 래트 또는 마우스 배아 NSCs의 전뇌는 한정 배지에서 배양하여 혈청 효소의 결여이다. NSCs의는 oligodendroc에서 관찰 Olig2 및 Sox10, 두 개의 전사 인자를 표현YTE 전구 세포 (개 OPC). 이 시스템을 사용하여, FGF-, BMP- 사이의 상호 작용 Zeb1, Zeb2을 포함하는 TGFβ는-신호 및 Twist2는 TGFβ 활성화가 크게 상승 BMP- / TGFβ 상호 작용을 제안, 세포 이동을 강화 여기서 관찰되었다. 결과 EMT 유도 및 유지에 관여하는 것으로 FGF-, BMP- 및 TGFβ-시그널링 네트워크 가리. 이 모델 시스템은 시험 관내에서 EMT를 조사 관련이있다. 그것은 비용 효율적이고 높은 재현성을 보여줍니다. 또한, 그 이전의 응답에 대한 (정량적 거리 측정)을 억제하거나 EMT (정량적 측정)을 향상시키기 위해 화합물의 높은 처리량 스크리닝과 상이한 화합물의 비교를 허용한다. 이 모델은 따라서 잘 EMT에 영향을 미치는 물질 약물 라이브러리를 테스트하는 데 적합합니다.

이 EMT 모델 시스템은 단일 셀이나 현상 신경관의 특정 영역에서 이식편으로서 NSCs의 양의 표준화 분리에 기반 중앙 피질 (도 1 및도 2). 정량적 평가를 위해, 절편을 500 μm의 격자 배양 접시 (도 3)의 중앙에 바로 시딩 하였다. 중앙 피질에서 이식편 먼저 성장 인자 (표 1)의 상이한 조합에 추가 이틀 후, 이틀 FGF2 노출시켰다. 우리는 개발 신경 튜브의 다른 지역보다 큰 피질에서 시작되었다. 우리는 BMP4에서 배양 만 외식은 철새 응답 (표 1 및 보충 그림 2)를 보여 관찰. 다음 podoplanin (PDPN) 표현은 정의 된 조건에서 분석 하였다. PD...

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

이 절차의 전체적인 목적은 일반적으로 이동성이 없는 세포에서 이동을 유도하여, 이동을 활성화하거나 차단하는 특정 화합물을 식별하는 것입니다. 이 방법은 세포 이동 및 침습 분야의 핵심 질문에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있으며, 특히 신경 줄기세포를 연구하는 과학자들에게 유용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비이동성 및 비침습성 세포가 이동성 및 침습성 세포로 변하는 과정을 분석할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 신경 줄기세포에서 유래한 것으로 알려진 인간 고등급 신경교종에서 발생하는 상피-간엽 이행(EMT)을 차단하는 새로운 화합물의 식별로 확장됩니다. 이 방법은 EMT와 신경 줄기세포에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 유방암, 폐암 또는 결장암과 같은 다른 상피성 암을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다. 배아기 14.5일에 쥐 전지에서 손가락 형성이 시작되는 것을 통해 쥐 배아의 연령이 정확한지 확인하십시오.다음으로, 실체 현미경 아래에 배치된, ice-cold PBS가 채워진 개별 코팅되지 않은 페트리 접시에 배아를 옮깁니다. 미세 팁 포셉을 사용하여 배아 껍질(embryonic hulls)을 제거합니다. 배아는 ice 위에서 팽창 배지(expansion medium) 상태로 유지합니다.오토클레이브로 멸균한 두 개의 미세 핀셋을 사용하여, 발달 중인 종뇌와 간뇌의 교차 지점부터 시작하여 앞뒤로 동시에 당겨 머리 피부와 두개골을 제거합니다. 그런 다음 중뇌와 후뇌를 구분하는 중뇌-후뇌 경계를 확인하고, 중뇌-후뇌 경계 바로 위나 아래에서 후뇌를 절단합니다. 핀셋으로 중뇌 블록을 잡고 두개골 기저부에서 종뇌, 간뇌와 안면 골격 사이의 연결 부위를 끊어낸 뒤, 종뇌, 간뇌, 중뇌 블록을 얼음 위에 놓인 코팅되지 않은 확장 배지 담긴 페트리 접시에 침전시킵니다.모든 신경 블록을 동일한 방식으로 채취한 후, 현미경 하에서 말단뇌, 간뇌, 중뇌 블록 하나를 신선하고 차가운 PBS로 옮깁니다. 중뇌를 간뇌에서 분리하려면, 먼저 간뇌와 말단뇌 사이의 조직을 절단합니다. 그다지 말단뇌의 두 반구를 나누고, 향후 뇌실간공(foramen interventriculare)을 통해 보이는 내측 및 외측 신경절 융기를 확인합니다.내측 및 외측 신경절 융기와 전방 피질이 만나는 지점을 따라 직선으로 절개한 후, 피질, 해마 및 맥락총을 관통하는 직선으로 절개합니다. 미측 신경절 융기와 후방 피질이 만

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 배아 생쥐의 개발​​ 피질에서 neuroprecursors의 절연에 사용되는 방법을 설명합니다. , 자궁에서 태아를 제거하는 대뇌 피질의 조직을 해부하고, 고립 대뇌 피질을 소화에 대한 절차는 표시됩니다.

마우스 신경 줄기 세포 엽 성의 전구 물질의 문화

이 비디오 프로토콜은 배아 일 14 마우스 뇌의 ganglionic eminences에서 신경 줄기 세포의 분리 및 확장에 대한 neurosphere 분석의 응용 프로그램을 보여줍니다.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 및 사체 연구에 기초하여 두 개의 시험관 발생 독성 시험 시스템 (UKK 및 UKN1)를 설명한다. 테스트 시스템은 인간 발생 독성 위험을 예측하고, 동물 연구, 비용 및 화학 물질의 안전성 검사에 필요한 시간을 단축에 기여할 수있다.

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

마우스 ES 세포를 기능적 시냅스와 창발적 네트워크 행동을 나타내는 매우 순수한 뉴런의 정의된 집단으로 구별하기 위한 사용자 정의 프로토콜이 설명됩니다. 전기생리학적 분석은 보툴리눔 신경독소 혈청형/A-/G 및 파상풍 신경독에 노출된 후 시냅스 전달의 상실을 보여줍니다.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다.

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

학습하세요 신경 줄기 세포 기반 EMT 연구 모델을 통해 비이동성 세포의 이동 유도 및 약물 발굴 방법을. 이 기술은 고급 신경교종 및 기타 상피암 연구에 활용됩니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

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