종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

이 절차의 전체적인 목표는 고해상도 생체 내 다광자 현미경(intravital multiphoton microscopy)을 통해 종양 미세환경 내의 역동적인 사건들을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 혈관 투과성과 다세포 상호작용에 어떤 역동적 사건들이 관여하는지와 같은 종양 미세환경에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 미세환경 내 사건들의 역학을 관찰하고 측정할 수 있다는 점입니다.

절차를 시작하기 전, 두 광자 레이저와 검출기를 포함한 모든 현미경 및 레이저 구성 요소를 켭니다. 그리고 스테이지를 예열하기 위해 가열 박스를 30 °C로 설정합니다. 현미경 스테이지와 스테이지 인서트를 70% ethanol로 닦아냅니다.

스테이지가 건조된 상태에서, 커버글라스와의 광학적 접촉을 유지하기 위해 25 x 1.05 NA 현미경 대물렌즈 위에 물 한 방울을 크게 떨어뜨리고, 인서트 이미징 포트 위에 두께 1.5번의 커버글라스를 놓습니다. 그런 다음, 30cm 길이의 폴리에틸렌 튜브를 자릅니다. 커버글라스 위에 고무 패드를 놓습니다.

핀셋을 사용하여 31 gauge 바늘을 플라스틱 피팅에서 분리한 다음, 바늘 허브의 뭉툭한 끝부분을 튜브에 삽입합니다. PE 튜브의 반대쪽 끝에 31 gauge 바늘을 삽입하고 연결합니다. 그런 다음, 1 cc 주사기에 멸균 PBS를 채우고 주사기를 31 gauge 바늘에 연결합니다.

PBS를 사용하여 튜브와 바늘 내의 모든 공기를 밀어내십시오. 그런 다음, 1 cc 주사기에 적절한 혈관 표지물 200 µL를 채우고, 다른 주사기에는 적절한 주입용 단백질을 채웁니다. 수술을 시작하기 전, 발가락 집기 자극에 반응이 없는지 확인하여 마취 상태를 점검하고, 마취된 마우스에 안연고를 도포하십시오.

다음으로, 꼬리의 혈류량을 높이기 위해 가열 램프 아래의 수술대 위에 동물을 놓습니다. 2분 후, 70% ethanol로 꼬리를 소독하고 31 gauge 카테터의 팁을 꼬리 외측 정맥으로 2~3 mm 삽입합니다. 그런 다음, 카테터에 1 cm 길이의 실험용 테이프를 붙여 바늘이 꼬리 길이를 따라 정맥과 평행하게 유지되도록 고정합니다.

카테터가 고정되면, 복부 쪽과 종양 표면을 70% ethanol로 닦아냅니다. 그다음 복부 피부를 들어 올리고 멸균 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 약 1cm 길이의 피하 절개를 실시하되, 복막을 찌르지 않도록 주의합니다. 유선 및 종양을 복막에서 분리하여 종양을 노출시키기 위해 연결 조직을 조심스럽게 절개합니다.

그 다음, 가위와 핀셋을 사용하여 종양의 노출된 표면에서 근막과 지방을 조심스럽게 제거합니다. 종양이 노출되면 생쥐를 미리 가열된 이미징 스테이지로 옮깁니다. 실험용 테이프를 사용하여 커버글라스를 고정한 후, 현미경 대물렌즈 위의 커버슬립을 덮고 있는 고무 패드의 구멍에 종양을 위치시킵니다.

동물이 적절한 위치에 놓이면, 조직의 수분을 유지하고 커버슬립과의 광학적 접촉을 유지하기 위해 고무 패드 챔버를 PBS로 채웁니다. 동물의 활력 징후를 모니터링하기 위해 목 주변에 펄스 옥시미터 프로브 칼라 센서를 배치하고, 동물 위에 가열 상자를 놓습니다. 그런 다음, 현미경 IPs를 사용하여 종양 표면의 형광 종양 세포와 혈관이 흐르는 영역에 초점을 맞춥니다.

관심 영역(ROI)을 선택한 후, 현미경을 다광자 이미징 모드로 전환하고 포커스 조절기를 사용하여 대물렌즈를 원하는 시작 위치로 이동시킵니다. 그런 다음, Z position top 버튼을 클릭하여 z 시리즈의 상한선을 설정하고, 제2고조파 생성(SHG) 채널에서 종양 표면의 콜라겐 섬유 네트워크를 시각화합니다. 이어서 대물렌즈를 원하는 이미징 깊이까지 이동시킨 후, z position bottom 버튼을 클릭하여 z 시리즈의 하한선을 설정합니다.

다음으로, 단계 크기 필드에 원하는 값을 입력하십시오. 그런 다음, 타임랩스 패널로 전환하여 적절한 타임랩스 시간을 입력합니다. 이미징 파라미터가 결정되면, 카테터에 연결된 시린지를 혈관 라벨링 염료가 담긴 시린지로 교체하고, 염료 용액이 정맥으로 들어가는지 주의하며 최대 200 µL의 염료 용액을 천천히 투여하십시오.

주입 후, PBS 주사기를 카테터에 다시 연결하고 z-스텝 타임랩스 이미징을 시작하십시오. 모든 이미지를 획득한 후, 라인에 기포가 유입되지 않도록 주의하며 PBS 주사기를 주입용 단백질이 담긴 주사기로 교체하십시오. 그다음 단백질 현탁액을 마우스에 천천히 주입하고, 다시 PBS가 담긴 주사기로 교체하십시오.

대식세포는 식세포 작용을 하는 대식세포 내에 축적되는 형광 표지된 70 kilodalton 및 dextran을 통해 추적할 수 있습니다. 종양 세포와 대식세포를 이중 표지하면 이 두 세포 유형 간의 직접적인 상호작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 종양 혈관 투과성의 변화를 시각화하기 위해 양자점(quantum dots)을 사용하여 혈관 공간을 표지할 수도 있습니다.

이들은 크기가 충분히 커서 동맥 간 공간을 통해 쉽게 확산되지 않습니다. 지속적인 고해상도 이미징을 통해 혈관 투과성 사건을 포착하고 덱스트란의 혈관 외 유출 및 소실 속도를 정량화할 수 있습니다. 본 예시의 시야에서는 혈관 외 TMR 신호로 확인되는 바와 같이, 29분에서 34분 사이에 혈관 외 유출의 정점이 관찰됩니다.

혈관 투과성을 유도하기 위해 추가적인 혈관 염료나 단백질을 주입하면 혈관 투과성을 조절하는 신호 전달 사건에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 실제로 주입 후 수 초 내에 10 kilodaltons의 dextran FITC가 혈관에서 혈관 외로 누출되는 것을 관찰할 수 있는 반면, 155 kilodalton의 dextran TMR은 혈관 공간 내에 국한되어 있습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 종양 표면을 손상시키지 않고 결합 조직을 조심스럽게 제거하고, 종양 표면이 건조해지지 않도록 수분을 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 세포 역학 절차를 통해 종양 세포의 이동과 같은 과정을 시각화함으로써, 종양 세포 이동의 방향성과 혈관 내 침범(intravasation)에 관한 추가적인 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인터비탈 다광자 현미경(intervital multiphoton microscopy)을 이용하여 종양 미세환경 내의 동적인 세포 사건들을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.