Name: 종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 학습하세요 종양 미세 환경에서 다세포 역학을 실시간으로 관찰하는 다광자 현미경 기법을 통해 혈관 투과성과 세포 상호작용을 측정하는 방법을. 이 기술은 암 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 보너스 번호 (ASH, W81XWH-13-1-0010)에서 국방부의 유방암 연구 프로그램, NIH CA100324, PPG CA100324 및 통합 이미징 프로그램에 의해 지원되었다.

설명하는 모든 절차는 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 알버트 아인슈타인 대학의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행해야합니다. 1. 생성 형광 표지 된 종양 및 종양 관련 대 식세포 <ol><li> 강화 된 녹색 형광 마우스 유방 종양 바이러스 긴 터미널 반복, 즉 형광 기자 [와 형질 전환 마우스와 폴리오 중간에 T 항원 (MMTV-PyMT)를 구동하는 자연, 토착, 유전자 조작 마우스 유방암 모델을 교차하여 형광 표지 된 종양 세포를 생성 단백질 (EGFP), 향상된 시안 형광성 단백질 (ECFP)로 이루어지는 군 또는 Dendra2] -8,9-. </li><li> PyMT 동물에서 형광 라벨 식세포와 형광 [즉, MacGr myeloid- 및 macrophage- 특정 형광 기자들과 유 전적으로 조작 된 마우스 모델을 교차하여 종양 세포를 표지EEN 15 MacBlue 마우스 Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16]. </li><li> 대안 적으로, 형광 형광 표지 PyMT 종양 세포 (동계) 인간 유방암 세포주 또는 일차 인간 환자 유래의 종양 (이종) (11, 17)의 동 소성 이식을 통해 종양 표지 생성한다. <ol><li> 임플란트 형광 형광 표지 된 종양 세포와 골수 세포를 13 동물을 생성하는 형광 단백질 표지 된 골수 세포 동계 마우스에 PyMT 종양 세포를 표지. </li></ol></li><li> 시작 2 시간 전에 형광 라벨 식세포 인간 세포주 또는 환자 유래 차 종양의 이종 이식 종양 중증 합병 면역 결핍증 (SCID) 마우스에 10 mg을 정맥 주사 (IV) 꼬리 정맥에 의해 / kg 형광 70 kDa의 덱스 트란의 100 μl를 주입 생체 내에 이미징. </li></ol> 2. 현미경 설정 및 이미지 준비 참고 :이 절차는 셋업을 설명합니다광자 현미경 8 생체 내에 이미징. <ol><li> 두 광자 레이저와 검출기를 포함한 모든 현미경과 레이저 구성 요소의 전원을 켭니다. </li><li> 무대를 미리 따뜻한 30 ° C로 가열 상자를 켭니다. 이 단계는 동물의 생리 학적 온도를 유지하는데 중요하다. </li><li> 거꾸로 현미경 장소 현미경 무대에서 주문 제작 단계 인서트에 사용. 사용자 지정 삽입 이미징을위한 중앙에 관통 구멍 직경 &quot;무대 삽입 공간과 1 맞게 가공 두께의 알루미늄&quot;1/8의 장이다. <ol><li> 70 % 에탄올과 공기 건조와 현미경 스테이지와 무대 삽입을 닦습니다. </li><li> 커버 유리와 광학 접촉을 유지하기 위해 20 배, 1.05 NA 현미경의 목적에 물 큰 드롭 놓습니다. </li><li> 현미경 스테이지 인서트 촬상 포트 위에 배치 용 커버 유리 (두께 1.5 #). 실험실 테이프와 장소에 고정합니다. </li><li> 2cm X 2cm의 구멍을 펀치 구멍 펀치를 사용하여그리고 유연한 고무 패드에 사용자 지정 단계 인서트의 구멍과 정렬 패드의 구멍 현미경 무대에 고무 패드를 배치합니다. </li></ol></li></ol> 이미징 동안 주입 3. 꼬리 정맥 카테터의 준비 및 시약 <ol><li> 폴리에틸렌 (PE) 관의 30cm 길이를 잘라. </li><li> 이 플라스틱 피팅 떨어져 중단 될 때까지 집게를 사용하여 앞뒤로 31 G 바늘의 금속 바늘을 이동합니다. </li><li> 집게를 사용하여 PE 관으로 분리 된 바늘의 뭉툭한 끝을 삽입합니다. </li><li> 체육 튜브의 다른 쪽 끝으로 31 G 바늘을 삽입합니다. </li><li> 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 1 cc의 주사기를 입력하고 31 G 바늘에 삽입하고 PBS로 튜브와 바늘에서 모든 공기를 세척합니다. PBS 수화 혈액 9,18 삼투압을 유지하기 위해 사용되며, 그러나 식염수도 사용될 수있다. </li><li> 3 mg을 200 μL와 1 cc의 주사기를 채우기 / 155 kDa의 덱스 트란 - 테트라 메틸 (TMR을 kg을) 또는 혈관 표시를위한 양자 도트를 사용합니다. </li><li> 이러한 얼음 1 공통 주사기 대신 혈관 내피 성장 인자 A (VEGFA 165)의 165 아미노산 동종 같은 다른 주사 단백질을 준비한다. 0.05 ㎎ / ㎖의 농도로 0.2 ㎎ / ㎏ VEGFA 165 19 주사. </li></ol> 내주 꼬리 정맥 카테터 4. 삽입 <ol><li> 캐리어 가스로서, O2와 5 %의 이소 플루 란 유도 챔버를 사용하여 마취하에 동물을 놓는다. </li><li> 완전히 마취하고 발가락 핀치에 응답하지 않습니다 일단 수술 플랫폼에 마우스를 전송합니다. </li><li> 수술 플랫폼 오픈 이소 플루 란 마취 라인은 유도 챔버에 마취 라인을 닫고 동물의 주둥이를 통해 코 콘을 배치합니다. 2.5 %로 5 %에​​서 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다. </li><li> 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 가열 램프하에 동물 히트추가로 2 분에 꼬리 혈액 순환을 증가시키기 위해 순환 깊은 마취 둔화. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스의 꼬리 정맥을 소독. </li><li> 동물의 측면 꼬리 정맥에 3 장으로 구성 카테터에서 31 G 바늘의 끝을 삽입하고 2-3mm의 바늘을 밀어 넣습니다. </li><li> 꼬리 정맥에 배치됩니다 카테터를 보장, 피를 볼 주사기에 다시 당깁니다. </li><li> 꼬리의 길이를 따라 정맥에 장소 병렬로 바늘을 잡고 바늘 위에 배치 실험실 테이프의 1cm 길이를 사용합니다. </li></ol> 5. 피부 플랩 수술은 유방 종양을 노출 <ol><li> 수술 플랫폼에서 동물 종양 및 70 % 에탄올로 복부 표면을 면봉. 참고 : 한 바와 같이,이 절차는 완전히 무균 수행되지 않습니다. 감염은 교란 요인이 될 수있는 긴 촬상 세션 들어, 적절한 무균 기술을 사용하도록 권장한다. </li><li> steri 사용멸균 가위는 복부 중간 선 길이 약 1cm 따라 피하 절개를 함께 제작 포셉은 복부 피부를 들어 올려. 절개 동안 복막을 천공하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 유방 종양을 노출 멀리 복막에서 유선 종양을 부착 결합 조직을 잘라. </li><li> 조심스럽게 분리하고, 종양 혈관의 무결성을 유지하는 출혈을 최소화하면서 종양의 노출 된 표면에서의 밴드와 지방 절취 위 및 집게를 사용. 이 단계는 종양의 종양 맥관 구조와 공급을 유지하는데 중요하다. </li></ol> 현미경 6. 동물 준비 <ol><li> 이미징을위한 현미경 목표를 통해 무대 삽입에 커버 슬립에 배치 노출 된 종양으로 사전 예열 영상 무대에 동물을 전송합니다. 니들을 제거하지 않도록 동물 부드럽게 꼬리 정맥 카테터를 전송하기 위해주의한다. </li><li> 장소 일동물의 주둥이를 통해 전자 마취 코 콘은 3 % 이소 플루 란으로 마취 세트를 유지합니다. </li><li> 종양이 고무 패드의 구멍에 달려 유​​리 커버 슬립으로 접촉되도록 배치 동물. </li><li> 조심스럽게 제자리에 종양을 잡고 이미지 수집하는 동안 움직임을 줄이기 위해 실험실 테이프로 현미경 무대를 해결하기 위해 두 개의 고무 패드를 사용합니다. </li><li> 수화 조직을 유지하고 coverslip에 광학 접촉을 유지하기 위해 PBS와 고무 패드의 챔버를 입력합니다. </li><li> 펄스 산소 농도계 프로브와 동물의 생체 신호 모니터링을 시작합니다. 동물의 허벅지에 클립 센서를 부착합니다. 대안 목 맞게 구성되는 칼라를 사용할 수있다. </li><li> 30 ° C (20)을 유지하기 위해 동물을 통해 가열 상자를 놓습니다. </li><li> 천천히 마취를 유지하고 혈류를 유지하기 위해 0.5 %의 이소 플루 란의 수준을 감소시킨다. </li></ol> 7. 이미지 인식 및 Fluoresc 사출엔트 염료 및 주사 단백질 <ol><li> 종양의 표면에 형광 종양 세포의 현미경 접안 렌즈 초점 사용. </li><li> 혈관을 흐르는 영역을 찾아 관심의 영역을 선택합니다. 흐르는 혈관와 관심 영역의 선택은 종양 혈관을 평가하는데 중요하다. </li><li> 관심 영역이 선택되면 광자 촬상 모드로 전환 현미경. </li><li> A부터 Z 시리즈의 상한값과 하한값을 설정한다. 원하는 시작 위치로 이동 목표 포커스 조절 장치를 사용하고, Z 위치 &quot;최고&quot;버튼을 클릭하여 Z 시리즈의 상한을 설정한다. 제 2 고조파 발생 (SHG) 채널에서의 종양의 표면의 콜라겐 섬유 네트워크 시각화 어떠한 세포 만 콜라겐 섬유를 볼 수 없을 때 관찰하여 Z 시리즈의 상한을 결정한다. <ol><li> (typica 원하는 촬상 깊이 대물 이동하여 Z 시리즈의 하한을 설정에서야 베드로 50-150 μm의)와 Z 위치를 클릭 &quot;바닥&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 스텝 사이즈 필드에 원하는 값을 입력하여 스텝 사이즈를 설정한다. 해상도 획득 시간에 대한 고려에 기초하여 스텝 크기를 결정하는 (전형적으로 2 ㎛의은 고해상도 3D 재구성에 사용이 5㎛ 달리한다). </li></ol></li><li> 시간 경과 필드에 원하는 경과 시간을 타임 랩스 패널로 전환하고 입력하여 시간 경과 간격을 설정합니다. 최적의 시간 해상도 연속 촬상 0 초까지의 시간 간격을 설정한다. 참고 : 장시간 경과 이미징하는 대물 침지 액체를 보충하기 위해 인수 사이에 10 초까지의 시간 간격을 설정할 것을 추천한다. </li><li> 영상에 대한 매개 변수가 결정되고 나면, 천천히 155 kDa의 덱스 트란 - TMR을 주입. <ol><li> 꼬리 정맥 카테터에 PBS와 주사기를 제거하고 리에 모든 거품을 소개하지 않는 155 kDa의 덱스 트란 - TMR 돌보는이 들어있는 주사기로 교체네브라스카. </li><li> 천천히 200 μL의 최대 볼륨, 마우스에 155 kDa의 덱스 트란 - TMR을 주입, 주사기는 PBS를 포함하여 주사기를 교체합니다. 중요한 단계 : 천천히 주입을 수행하고 정맥의 외부 솔루션을 입지 않도록 예방 조치를 취해야. </li></ol></li><li> 레코드 버튼을 클릭 한 다음 그들을 우울하게하는 Z-스택 및 시간 경과 버튼을 클릭하여 Z-스택 시간 경과 이미징의 인수를 시작합니다. </li><li> 다른 형광 덱스 트란, 즉, 10 kDa의 덱스 트란 - 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC), 또는 단백질, 즉, VEGFA (165)는, 미리 준비되어있는 경우, 0 =에서 분 시작을위한 이미지 수집의 시작 후에 주입. <ol><li> 꼬리 정맥 카테터에 PBS와 주사기를 제거하고 라인에 모든 거품을 소개하지 않는 10 kDa의 덱스 트란-FITC 또는 VEGFA 165 돌보는이 들어있는 주사기로 교체합니다. </li><li> 천천히 꼬리 정맥 카테터를 통해 마우스에 주사제를 주입와 PBS가 포함 된 주사기와 주사기를 교체합니다. </li></ol></li><li> 매 30-45 분 천천히 동물의 수화를 유지하기 위해 PBS 또는 식염수 50 ㎕를 주입. </li></ol> 8. 안락사 <ol><li> 이미지 수집의 종료에, 동물을 안락사. <ol><li> 5 %로 이소 플루 란을 늘립니다. </li><li> 그것은 호흡과 무대에서 동물을 제거하기 위해 중단 후 30 초까지 5 % 이소 플루 란에서 동물을 유지합니다. </li><li> 완전한 안락사을 보장하기 위해 자궁 경부 전위를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 9. 이미지 처리 <ol><li> 각 시점에서 각 채널에 대한 16 비트 TIFF 파일로 이미지를 획득하고 순차적으로 저장한다. </li><li> 스펙트럼 중첩 (즉, GFP 및 CFP), XY 드리프트의 제거 및 ImageJ에 9 년에 설립 된 방법을 사용하여 시간 경과 시퀀스에서 영화의 세대 분리를 수행합니다. 고해상도 이미지 (13)의 3 차원 표면의 재구성을 수행. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

종양 미세 환경에서 자연적으로 발생하는 세포 상호 작용은 종양 세포 운동성 및 intravasation 변화로 이어질 수있다. 살아있는 종양 조직의 고해상도 생체 내에 촬상 매우 과도 10,13,24 될 수 다세포 역학의 시각화를 허용한다. 종양 미세 환경에서 프로세스의 분자 메커니즘에 필수적인 정보를 제공 할 수 있습니다 이산 시점으로 얻은 생체 내 분석 또는 시간 경과 이미지의 최종 점. 생체 내에 영상화 연구 약물 치료 25 내지 30에 혈관 신생, 종양 세포 이동 및 응답에 대한 새로운 통계를 생성 며칠 동안 발생하는 종양 미세 환경에서 처리를 연구하는 데 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석 인해 프로세스의 시간 스케일로 종양 미세 환경에서 과도 이벤트의 동력학을 캡처 할 수는 7,31 공부된다. 일정한 과정에서 여러 일시적인 이벤트를 구별하는 것은 의미있는 광고입니다생체 내에 현미경의 유리한. <p class="jove_c...

차 유방 종양에서 종양 세포의 보급은 대 식세포 및 혈관 내피 세포를 포함하는 기질 세포뿐만 아니라 종양 세포를 포함하지만, 호스팅하는 것으로 나타났다. 또한, 종양 혈관 투과성 증대 1 이상이다. 따라서, 종양 세포, 대 식세포 및 내피 세포가 일차 종양 미세 혈관 투과성 및 종양 세포 intravasation을 중재 상호 작용하는 방법을 결정하는 단계 이해 전이에 중요하다. 혈관 투과성, 종양 세포 intravasation 종양 미세 환경에 다세포 상호 작용의 기본 신호 메커니즘의 동역학을 이해하는 항암 치료제의 개발 및 관리에 중요한 정보를 제공 할 수있다. 생체 내에서 종양 혈관 투과성 연구의 주요 수단은 에반스 블루 2, 고 분자량의 덱스 트란 (155 kDa의) 혈관 외 염료로 측정했다염료의 주입 후 일정한 시간 점 (3)과 형광 또는 (알부민을 포함) 추적자 공역 단백질 4. 현미경의 발전은, 동물 모델 및 형광 염료는 생체 내에 현미경 (5)를 통해 세포 과정과 살아있는 동물의 혈관 투과성의 시각화를 사용할 수있다. 여러 시점에 걸쳐 정적 인 이미지, 또는 짧은 시간 경과 시퀀스의 인수와 라이브 동물 이미징은 종양 미세 환경 6,7 동적 이벤트의 완전한 이해를 허용하지 않습니다. 실제로, 24 시간의 과정을 통해 정적 이미지 획득은 종양 혈관 그러나 혈관 투과성의 역학은 6 관찰되지 않았다 새는 것을 보여 주었다. 따라서 12 시간까지 연장 된 연속 시간 경과 영상은 종양 미세 환경에서 동적 이벤트의 반응 속도를 캡처합니다. 이 프로토콜은 확장 된 시간 경과 multiphot의 사용을 설명합니다생체 내에 현미경에 종양 미세 환경에서 동적 다세포 이벤트를 공부합니다. 종양 미세 환경의 여러 세포 유형은 주사 염료 또는 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 동물을 사용하여 표시되어 있습니다. 혈관 염료 또는 단백질 촬상 개시 후 주입 될 수있는 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 종양 미세 환경에 다세포 이벤트 운동 데이터를 획득한다. 생균 이미징 유방 종양 피부 플랩 수술 준비를 통해 노출된다. 이미지는 다수의 광전자 증 배관 튜브 (PMT) 검출기 (8)를 구비 한 다 광자 현미경을 이용하여 12 시간 동안 획득된다. 적절한 필터를 사용하여 감산 알고리즘 종양 미세 구 동시에 5 형광 신호를 획득하도록 4 PMT 검출기를 가능하게한다. 고해상도의 광자 생체 내에 현미경 더 이어지는 종양 미세 환경에서 종양 - 기질 상호 작용의 단일 셀의 고해상도 영상을 캡처 U혈관 투과성 및 종양 세포 intravasation 10-13 nderstanding. 특히 종양 세포, 대 식세포 및 내피 세포 간의 상호 작용 부위에서 선택적으로 발생하는 확장 된 생체 내에 촬상 밝혀 고도로 국부 일시적인 혈관 투과성 이벤트가도 13의 (전이 TMEM 14 종양 미세 환경으로 정의). 또한, 종양 세포는 intravasation TMEM 발생 공간적 및 시간적 혈관 투과성 (13)와 상관된다. 이러한 이벤트의 역학의 단일 셀 해상도는 종양 미세 환경에 형광 표지 된 세포의 확장 시간 경과 광자 현미경의 사용을 통해 가능하게되었다.

<table><tbody><tr><td>155 kDa 덱스트란-테트라메틸로다민 이소티오시아네이</td>트 <td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td>은 <td>1x PBS에서 20 mg/ml</td></tr>로 재구성 <tr><td>70 kDa 덱스트란-Texas Red</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td>은 <td>1x PBS에서 10 mg/ml로 재구성</td></tr><tr><td>10 kDa 덱스트란-플루오레세인 이소티오시아네이</td>트 <td>Sigma Aldrich</td><td>FD10S</td>는 1x PBS Qdot 705 ITK 아미노(PEG) 양자 점 수명<td>에서 20 mg/ml로 재구성</td></tr><tr><td></td><td> </td><td></td><td>희석Q21561MP 기술 25 &#956; l 175 &#956년; 주입용 1x PBS의 l</td></tr><tr><td>MMTV-PyMT 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2374</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-ECFP 마우스(Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>26051</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-EGFP 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoethesia(isoflurane)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>산소</td><td>AirTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기, 투베르쿨린 슬립 팁</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1 (0.3 mm x 25&nbsp; mm) 바늘</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 마이크로 의료 튜브&nbsp;</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td>0.28mm 내경 x 0.64mm 외경</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Corning</td><td>2980-225</td><td>두께 1.5, 22 x 50&nbsp; mm</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT 맥박 산소 농도계, 소프트웨어 및 센서</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>연질 고무 패드</td><td>McMaster-Carr</td><td>8514K62</td><td>초연질 폴리우레탄 필름, 3/16" 두께, 12" x 12", 40 Oo 경도계, 일반 뒷면</td></tr><tr><td>하드 고무 패드</td><td>McMaster-Carr</td><td>8568K615</td><td>고강도 네오프렌 고무 시트 1/4" 두께, 12" x 12", 50&nbsp; 경도계</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>현미경은 20X 1.05NA 대물 렌즈를 사용하는 Olympus IX-71 스탠드를 기반으로 하는 맞춤형 2개의 레이저 다광자 현미경입니다.</td></tr><tr><td>7-펀치 세트</td><td>McMaster-Carr</td><td>3429A12</td><td>1/4" to 1" 홀 직경, 해머 구동 홀 펀치용</td></tr></tbody></table>

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

종양 미세환경에서 숙주 기질 세포는 종양 세포와 상호 작용하여 종양 진행, 혈관 신생, 종양 세포 파종 및 전이를 촉진합니다. 종양 미세환경에서의 다세포 상호작용은 방향성 종양 세포 운동성 및 혈관 투과성을 포함한 일시적인 사건으로 이어질 수 있습니다. 종양 혈관 투과성의 정량화는 혈관 염료의 유출을 측정하기 위해 종말점 실험을 자주 사용했습니다. 그러나 다세포 상호 작용과 혈관 투과성의 일시적인 특성으로 인해 이러한 동적 이벤트의 동역학을 식별할 수 없습니다. 주사 가능한 염료 또는 형광 단백질로 세포와 혈관 구조를 라벨링함으로써 고해상도 타임 랩스 생체 내 현미경 검사는 종양 미세환경에서 일시적인 이벤트를 직접 실시간으로 시각화할 수 있도록 했습니다. 여기에서는 다광자 현미경을 사용하여 살아있는 마우스에서 확장된 생체 내 이미징을 수행하여 종양 미세환경에서 다세포 역학을 직접 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 세포 표지 전략, 유방 피부 피판의 수술 준비, 꼬리 정맥 카테터에 의한 주사 가능한 염료 또는 단백질 투여 및 타임 랩스 이미지 획득에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법에서 얻은 타임 랩스 시퀀스는 종양 미세환경에서 운동성 및 혈관 투과성의 세포 이벤트의 동역학의 시각화 및 정량화를 용이하게 합니다.

연장 시간 경과 생체 내에 현미경 종양 미세 환경에서 다세포 프로세스의 단일 셀 해상도 이미징 할 수 있습니다. 형광 표지 된 종양 세포, 대 식세포, 혈관 공간, 제 2 고조파 발생 신호를 이용하여 콜라겐 섬유 네트워크를 시각화함으로써 종양 미세 환경에서 다수의 구획을 동시에 촬상 동안 추적. Dendra2 (도 1a)로 표지 유방 종양 세포, MMTV-PyMT-Dendra2 쥐에서 수행 된 형광 단백질 표지 된 종양 세포가 형질 전환 마우스에서 생성 될 수있다. ECFP으로 표시 식세포가 Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 마우스 이러한 형질 전환 마우스를 횡단하여 종양 세포와 대 식세포 모두 MMTV-PyMT 마우스에 표시되어 있습니다. 종양 세포 및 대 식세포의 이중 표지 전략 두 세포 유형의 직접적인 상호 작용 (도 1a 실시간으로 시각화 될 수있다). 또한, GFP 형질...

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

이 절차의 전체적인 목표는 고해상도 생체 내 다광자 현미경(intravital multiphoton microscopy)을 통해 종양 미세환경 내의 역동적인 사건들을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 혈관 투과성과 다세포 상호작용에 어떤 역동적 사건들이 관여하는지와 같은 종양 미세환경에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 미세환경 내 사건들의 역학을 관찰하고 측정할 수 있다는 점입니다.절차를 시작하기 전, 두 광자 레이저와 검출기를 포함한 모든 현미경 및 레이저 구성 요소를 켭니다. 그리고 스테이지를 예열하기 위해 가열 박스를 30 °C로 설정합니다. 현미경 스테이지와 스테이지 인서트를 70% ethanol로 닦아냅니다.스테이지가 건조된 상태에서, 커버글라스와의 광학적 접촉을 유지하기 위해 25 x 1.05 NA 현미경 대물렌즈 위에 물 한 방울을 크게 떨어뜨리고, 인서트 이미징 포트 위에 두께 1.5번의 커버글라스를 놓습니다. 그런 다음, 30cm 길이의 폴리에틸렌 튜브를 자릅니다. 커버글라스 위에 고무 패드를 놓습니다.핀셋을 사용하여 31 gauge 바늘을 플라스틱 피팅에서 분리한 다음, 바늘 허브의 뭉툭한 끝부분을 튜브에 삽입합니다. PE 튜브의 반대쪽 끝에 31 gauge 바늘을 삽입하고 연결합니다. 그런 다음, 1 cc 주사기에 멸균 PBS를 채우고 주사기를 31 gauge 바늘에 연결합니다.PBS를 사용하여 튜브와 바늘 내의 모든 공기를 밀어내십시오. 그런 다음, 1 cc 주사기에 적절한 혈관 표지물 200 µL를 채우고, 다른 주사기에는 적절한 주입용 단백질을 채웁니다. 수술을 시작하기 전, 발가락 집기 자극에 반응이 없는지 확인하여 마취 상태를 점검하고, 마취된 마우스에 안연고를 도포하십시오.다음으로, 꼬리의 혈류량을 높이기 위해 가열 램프 아래의 수술대 위에 동물을 놓습니다. 2분 후, 70% ethanol로 꼬리를 소독하고 31 gauge 카테터의 팁을 꼬리 외측 정맥으로 2~3 mm 삽입합니다. 그런 다음, 카테터에 1 cm 길이의 실험용 테이프를 붙여 바늘이 꼬리 길이를 따라 정맥과 평행하게 유지되도록 고정합니다.카테터가 고정되면, 복부 쪽과 종양 표면을 70% ethanol로 닦아냅니다. 그다음 복부 피부를 들어 올리고 멸균 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 약 1cm 길이의 피하 절개를 실시하되, 복막을 찌르지 않도록 주의합니다. 유선 및 종양을 복막에서 분리하여 종양을 노출시키기 위해 연결 조직을 조심스럽게 절개합니다.그 다음, 가위와 핀셋을 사용하여 종양의 노출된 표면에서 근막과 지방을 조심스럽게 제거합니다. 종양이 노출되면 생쥐를 미리 가열된 이미징 스테이지로 옮깁니다. 실험용 테이프를 사용하여 커버글라스를 고정한 후, 현미경 대물렌즈 위의 커버슬립을 덮고 있는 고무 패드의 구멍에 종양을 위치시킵니다.동물이 적절한 위치에 놓이면, 조직의 수분을 유지하고 커버슬립과의 광학적 접촉을 유지하기 위해 고무 패드 챔버를 PBS로 채웁니다. 동물의 활력 징후를 모니터링하기 위해 목 주변에 펄스 옥시미터 프로브 칼라 센서를 배치하고, 동물 위에 가열 상자를 놓습니다. 그런 다음, 현미경 IPs를 사용하여 종양 표면의 형광 종양 세포와 혈관이 흐르는 영역에 초점을 맞춥니다.관심 영역(ROI)을 선택한 후, 현미경을 다광자 이미징 모드로 전환하고 포커스 조절기를 사용하여 대물렌즈를 원하는 시작 위치로 이동시킵니다. 그런 다음, Z position top 버튼을 클릭하여 z 시리즈의 상한선을 설정하고, 제2고조파 생성(SHG) 채널에서 종양 표면의 콜라겐 섬유 네트워크를 시각화합니다. 이어서 대물렌즈를 원하는 이미징 깊이까지 이동시킨 후, z position bottom 버튼을 클릭하여 z 시리즈의 하한선을 설정합니다.다음으로, 단계 크기 필드에 원하는 값을 입력하십시오. 그런 다음, 타임랩스 패널로 전환하여 적절한 타임랩스 시간을 입력합니다. 이미징 파라미터가 결정되면, 카테터에 연결된 시린지를 혈관 라벨링 염료가 담긴 시린지로 교체하고, 염료 용액이 정맥으로 들어가는지 주의하며 최대 200 µL의 염료 용액을 천천히 투여하십시오.주입 후, PBS 주사기를 카테터에 다시 연결하고 z-스텝 타임랩스 이미징을 시작하십시오. 모든 이미지를 획득한 후, 라인에 기포가 유입되지 않도록 주의하며 PBS 주사기를 주입용 단백질이 담긴 주사기로 교체하십시오. 그다음 단백질 현탁액을 마우스에 천천히 주입하고, 다시 PBS가 담긴 주사기로 교체하십시오.대식세포는 식세포 작용을 하는 대식세포 내에 축적되는 형광 표지된 70 kilodalton 및 dextran을 통해 추적할 수 있습니다. 종양 세포와 대식세포를 이중 표지하면 이 두 세포 유형 간의 직접적인 상호작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 종양 혈관 투과성의 변화를 시각화하기 위해 양자점(quantum dots)을 사용하여 혈관 공간을 표지할 수도 있습니다.이들은 크기가 충분히 커서 동맥 간 공간을 통해 쉽게 확산되지 않습니다. 지속적인 고해상도 이미징을 통해 혈관 투과성 사건을 포착하고 덱스트란의 혈관 외 유출 및 소실 속도를 정량화할 수 있습니다. 본 예시의 시야에서는 혈관 외 TMR 신호로 확인되는 바와 같이, 29분에서 34분 사이에 혈관 외 유출의 정점이 관찰됩니다.혈관 투과성을 유도하기 위해 추가적인 혈관 염료나 단백질을 주입하면 혈관 투과성을 조절하는 신호 전달 사건에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 실제로 주입 후 수 초 내에 10 kilodaltons의 dextran FITC가 혈관에서 혈관 외로 누출되는 것을 관찰할 수 있는 반면, 155 kilodalton의 dextran TMR은 혈관 공간 내에 국한되어 있습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 종양 표면을 손상시키지 않고 결합 조직을 조심스럽게 제거하고, 종양 표면이 건조해지지 않도록 수분을 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 세포 역학 절차를 통해 종양 세포의 이동과 같은 과정을 시각화함으로써, 종양 세포 이동의 방향성과 혈관 내 침범(intravasation)에 관한 추가적인 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인터비탈 다광자 현미경(intervital multiphoton microscopy)을 이용하여 종양 미세환경 내의 동적인 세포 사건들을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

extended-time-lapse-intravital-imaging-real-time-multicellular

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.

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이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

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여기에서 우리는 동일한 살아있는 동물 내의 침습적 외과 적 개입 (예를 들어, 생검) 전후 뇌 종양 세포의 고해상도 시간 경과 다광자 이미징을위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 종양 세포의 철새, 침략적 인 행동에 대한 이러한 침습적 인 외과 적 절차의 영향을 단일 세포 수준에서 연구 할 수 있습니다.

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우리는 쥐에 있는 고분자량 (155 kDa) dextran의 정맥 주입을 사용하여 전이 (TMEM) 출입구 기능 및 암 세포 intravasation의 종양 미세 환경과 관련되었던 과도 혈관 투과성을 평가하기 위한 2개의 방법을 기술합니다. 방법은 살아있는 동물에 있는 활력 화상 진찰 및 면역 형광을 사용하여 고정된 조직 분석을 포함합니다.

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

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백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

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종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

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