종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

이 절차의 전반적인 목표는 고해상도, 생체 내 다광자 mircrospy를 통해 종양 미세환경 내의 동적 이벤트를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 혈관 투과성 및 다세포 상호 작용에 관여하는 동적 이벤트와 같은 종양 미세환경에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 미세환경에서 발생하는 이벤트의 동역학을 관찰하고 측정할 수 있다는 것입니다.

절차를 시작하기 전에 두 개의 광자 레이저와 검출기를 포함한 모든 현미경 및 레이저 구성 요소를 켭니다. 그리고 가열 상자를 섭씨 30도로 설정하여 스테이지를 예열합니다. 현미경 스테이지와 스테이지 인서트를 70% 에탄올로 닦습니다.

스테이지가 건조되면 25 x 1.05 NA 현미경 대물렌즈에 큰 물방울을 떨어뜨려 커버 유리와의 광학 접촉을 유지하고 인서트 이미징 포트 위에 1.5 두께의 커버 유리를 놓습니다. 그런 다음 30cm 길이의 폴리에틸렌 튜브 조각을 자릅니다. 커버 유리 위에 고무 패드를 놓습니다.

집게를 사용하여 플라스틱 피팅에서 31 게이지 바늘을 떼어내고 바늘 허브의 뭉툭한 끝을 튜브에 삽입합니다. PE 튜브의 다른 쪽 끝에 31 게이지 바늘을 삽입하고 부착합니다. 그런 다음 1cc 주사기에 멸균 PBS를 채우고 주사기를 31게이지 바늘에 부착합니다.

PBS를 사용하여 튜브와 바늘에서 모든 공기를 씻어냅니다. 그런 다음 하나는 200마이크로리터의 적절한 혈관 라벨이 있는 주사기이고 다른 하나는 적절한 주사 가능한 단백질이 있는 주사기입니다. 수술을 시작하기 전에 발가락 꼬집음에 반응이 없는 적절한 마취를 확인하고 마취된 마우스에 안구연고를 바르십시오.

다음으로, 꼬리 순환을 증가시키기 위해 열 램프 아래의 수술 플랫폼에 동물을 놓습니다. 2분 후 꼬리를 70% 에탄올로 소독하고 31 게이지 카테터의 끝을 측면 꼬리 정맥에 2-3mm 삽입합니다. 그런 다음 1cm 길이의 실험실 테이프를 카테터에 붙여서 바늘을 꼬리 길이를 따라 정맥과 평행하게 고정합니다.

카테터가 고정되면 복부와 종양 표면에 70% 에탄올을 면봉으로 닦습니다. 그만큼 복부 위의 피부를 들어 올리고 멸균 가위를 사용하여 복막에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하면서 복부의 복부 정중선을 따라 약 1cm의 피하 절개를 만듭니다. 유선과 종양을 연결하는 결합 조직을 복막에서 부드럽게 잘라 종양을 노출시킵니다.

그런 다음 가위와 집게를 사용하여 종양의 노출된 표면에서 근막과 지방을 부드럽게 제거합니다. 종양이 노출되면 마우스를 예열된 이미징 스테이지로 옮깁니다. 실험실 테이프를 사용하여 커버 유리를 고정한 다음 현미경 대물렌즈 위의 커버 슬립을 덮고 있는 고무 패드의 구멍에 종양을 놓습니다.

동물이 제자리에 있을 때 고무 패드 챔버에 PBS를 채워 조직에 수분을 유지하고 커버 슬립과의 광학 접촉을 유지하십시오. 맥박 산소 측정기 프로브 칼라 센서를 목에 두어 동물의 활력 징후를 모니터링하고 가열 상자를 동물 위에 놓습니다. 그런 다음 현미경 IP를 사용하여 종양 표면의 형광 종양 세포와 흐르는 혈관이 있는 부위에 초점을 맞춥니다.

관심 영역이 선택되면 현미경을 다광자 이미징 모드로 전환하고 초점 조정기를 사용하여 대물렌즈를 원하는 시작 위치로 이동합니다. 그런 다음 Z 위치 상단 버튼을 클릭하여 z 계열의 상한을 설정하고 두 번째 조화 생성 채널의 종양 표면에서 콜라겐 섬유 네트워크를 시각화합니다. 그런 다음 대물렌즈를 원하는 이미징 깊이로 이동하고 z 위치 하단 버튼을 클릭하여 z 시리즈의 하한을 설정합니다.

그런 다음 단계 크기 필드에 원하는 값을 입력합니다. 그런 다음 타임랩스 패널로 전환하고 적절한 랩스 시간을 입력합니다. 이미징 매개변수가 결정되면 카테터에 부착된 주사기를 혈관 표지 염료 주사기로 교체하고 용액이 정맥으로 들어가도록 주의하면서 최대 200마이크로리터의 염료 용액을 천천히 투여합니다.

주사 후 PBS 주사기를 카테터에 다시 넣고 z 단계 저속 이미징을 시작합니다. 모든 이미지를 얻었으면 PBS의 주사기를 주사 가능한 단백질이 포함된 주사기로 교체하고 라인에 기포가 유입되지 않도록 주의합니다. 그런 다음 단백질 현탁액을 마우스에 천천히 주입하고 주사기를 PBS가 함유된 주사기로 교체합니다.

대식세포는 식세포 마이크로파지에서 축적되는 형광 표지된 70 kilodalton 및 dextran으로 추적할 수 있습니다. 종양 세포와 마이크로피지에 이중 라벨링을 통해 이 두 세포 유형과의 직접적인 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 종양 혈관 투과성의 변화를 시각화하기 위해 양자 점을 사용하여 혈관 공간을 라벨링할 수도 있습니다.

그들은 충분히 커서 동맥 간 공간을 통해 쉽게 확산되지 않습니다. 지속적인 고해상도 이미징은 혈관 투과성 이벤트의 캡처와 dextran extravasation 및 clearance의 kinetics의 정량화를 용이하게 합니다. 이 예시 시야에서, vacscular di-extravasation의 피크는 extra vascular TMR 신호에 의해 입증된 바와 같이 29분에서 34분 사이에 관찰됩니다.

혈관 투과성을 유도하기 위해 추가 혈관 염료 또는 단백질을 주입하면 혈관 투과성을 조절하는 신호 전달 이벤트에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 실제로, 주입 후 처음 몇 초 이내에 10킬로달톤의 덱스트란 FITC가 혈관 구조에서 유출되는 것을 관찰할 수 있는 반면, 덱스트란 TMR의 155킬로달톤은 혈관 공간에 국한된 상태로 남아 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 종양 표면을 손상시키지 않고 결합 조직을 부드럽게 제거하고 종양 표면을 촉촉하게 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 세포 역학 절차에 따라 이러한 종양 세포 이동을 시각화하여 종양 세포 이동 및 혈관 내 방향성에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생체 간 다광자 현미경을 통해 종양 미세환경에서 동적 셀룰루아 이벤트를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.