Name: 인간의 혈액 - 뇌척수액 장벽의 맥락총 상피 세포 기반 모델은 기저 측면에서 세균 감염을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 인간 혈액-뇌척수액 장벽의 맥락총 상피 세포 기반 모델을 HIBCPP 세포를 사용하여 기저측면 세균 감염을 연구하는 방법입니다. 이 기법은 중추신경계 감염 질환의 병원체-상피 상호작용 분석에 활용됩니다.

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저자는 전자 현미경을 수행해 주신 Hartwig Wolburg 교수에게 감사의 뜻을 전합니다.

1. 거꾸로 모델 시스템에서 시드 HIBCPP 세포에 대한 세포 배양 필터 삽입을 준비 <ol><li> 5 μg의 / ㎖ 인슐린 보충 전 따뜻한 DMEM / F12 (HAM), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 10 % 소 태아 혈청 (FCS). </li><li> 거꾸로 12 웰 플레이트 (도 1E)로 3 ㎛의 공극 크기 0.33 cm² 성장 영역 세포 배양 필터 삽입 배치 무균 핀셋을 사용한다. </li><li> 세포 배양 필터 인서트의 하부 구획실 (약 3 mL) 및 필터 인서트의 상부에 100 ㎕의 배지를 채운다. 플레이트뿐만 아니라 매체와 낮은 구획 홍수. 필터 인서트의 하부 구획 (도 1E)를 충전 상태로 유지하는 방식으로 과도한 매체 기음. 참고 :이 단계에 대한 혈청 학적 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> , 뚜껑을 12 웰 플레이트를 커버하고 인큐베이터에 준비된 세포 배양 필터 삽입을 전송 37 ° C,세포에 첨가 할 때까지 5 % CO 2. </li></ol> 2. 재배 및 HIBCPP 세포의과 Passaging <ol><li> 5 μg의 / ㎖, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 10 % FCS로 보충 된 DMEM / F12 (HAM)을 준비한다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 매체와 PBS. 플라스크에서 대기음 매체. 플라스크 및 소용돌이에 10 ml의 PBS를 추가합니다. 일단이 단계를 반복합니다. </li><li> 플라스크 및 소용돌이에 3 ㎖ 0.25 % 트립신 EDTA를 추가합니다. , 인큐베이터에 37 ° C, 5 % CO 2를 놓습니다. </li><li> 약 20 분 후 인큐베이터에서 플라스크를 제거합니다. 세포가 플라스크의 바닥에서 분리되어 있는지 확인하고 현미경으로 조사 때 둥근 모양을 표시합니다. 주 : 세포가 서로 완전히 분리되지 않고 자주 덩어리에서 발견된다. 통로 (38)까지 세포를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 17 ml의 매체를 추가 트립신 중지하십시오. 아래로 pipetting에 의해 세포를 재현 탁하고, 현탁액을 전송50 ML 튜브로. 실온에서 10 분 동안 50 XG 원심 분리기. </li><li> 매체의 적절한 부피의 세포를 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포 수를 계산. 주 : 현탁 HIBCPP 세포의 농도가 1 × 106 세포 / ml이어야한다. HIBCPP 세포의 유지 대에는 T75 플라스크에 10 ml의 배지에 1-6 × 106 세포의 양을 전송하기 위해 제안된다. 모든 둘째 날 매체 변경합니다. </li></ol> HIBCPP 세포 3. 시드 반전 세포 배양 필터 삽입 <ol><li> (필터의 바닥면 예) 각 반전 필터 인서트의 위에 세포 현탁액 (예. 8 × 10 4 세포) (그림 1E)의 80 μl를 추가합니다. 참고 : 세포가 균일하게 파종하기 전에 튜브를 반전 현탁액에 분산되어 있는지 확인합니다. </li><li> 인큐베이터에 12 웰 플레이트 및 전송의 뚜껑, 37 ° C, 5 % C와 시드 - 세포 배양 필터 삽입을 커버O 2. </li><li> 첫날, 24 웰 플레이트의 우물에 1 ml의 매체를 입력합니다. 12 웰 플레이트에서 집게를 사용하여 세포 배양 필터 삽입을 들어 올리고, 내부 매체를 폐기 필터 삽입을 켜고 준비 24 웰 플레이트 (그림 1E)에 표준 방향으로 배치합니다. </li><li> 모든 둘째 날 새로운 배지로 세포를 놓습니다. 신선한 매체와 24 우물을 준비하고 여기에 필터 삽입을 전송합니다. 0.5 ml의 신선한 매체와 삽입을 입력합니다. 4 절에 설명 된대로 매일 봉사자를 확인합니다. </li><li> 세포 배양 인서트에 HIBCPP 시드 셀들 티이 값을 초과 할 경우 70 Ω X cm² (약 사일 파종 후) 다음, 1 % FCS, 5 μg의 / ㎖ 인슐린을 포함하는 배지에서 세포 배양을 계속한다. 물론 각 1 ml의 배지로 24 웰 플레이트를 준비합니다. 상단 구획에 제조 된 우물과 교환 매체로 필터 삽입을 전송합니다. 참고 : 컨 플루 후이 혈청 철수의 형성을 유도높은 막전위. </li><li> 필터 실에서 대기음 매체는 잘 준비에 전송하고 500 ㎕의 매체를 입력합니다. 일단이 단계를 반복합니다. , 인큐베이터에 하룻밤 37 ° C, 5 % CO 2 세포를 넣습니다. </li></ol> Transepithelial 전기 저항 4. 측정 (봉사자) <ol><li> 80 % 에탄올에 15 분 동안 상피 조직 voltohmmeter의 전극의 끝 부분을 담가. 후드 voltohmmeter를 전송하고 잠시 전극 건조를 할 수 있습니다. 평형 또 다른 15 분 동안 세포에 사용되는 각각의 배지에 전극을 배치합니다. </li><li> 필터 삽입 실에 짧은 아암을 배치가 하부 구획의 바닥 매번 접촉되도록 상기 전극의 긴 아암을 배치하여 측정을 수행한다. 참고 : 세포 배양 필터 삽입의 저항 값을 배지에서 세포없이이 빈 값을 사용해야합니다 ((측정 값 (Ω) - 빈 값 (Ω)) × 필터표면 (즉, 0.33 cm²)). </li><li> 15 분 동안 80 % 에탄올로 전극 제자리를 측정 한 후. 건조 튜브에 저장합니다. </li></ol> Paracellular 투수 5. 결​​정 <ol><li> 5 μg의 / ㎖ 인슐린을 1 % FCS로 보충 된 200 ㎖의 배지에서 1g FITC-이눌린을 녹인다. 세포의 감염 전에 상부 필터 구획에 용액 50 μg의 / ㎖을 적용합니다. </li><li> 감염 후 많은 이눌린은 셀 층을 통해 필터 실에서 전달 방법을 결정하기 위해 낮은 우물에서 매체 샘플을 수집합니다. </li><li> FITC-이눌린 표준 용액을 조제하고 1 수행 2 희석액, 10 배 (100 %, 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 %, 3.13 %, 1.56 %, 0.78 %, 0.39 %, 0.2 % 및 0 %) . 마이크로 플레이트 리더의 모든 시료의 측정에 의해 형광을 결정합니다. </li></ol> 세포 배양 필터 삽입에 HIBCPP 세포의 감염에 대한 박테리아의 6. 준비 <ol><li> 실험에 어느 날 이전에, 스크랩 t그는 냉동 N. 뇌수막염은 Vitox 초콜릿 한천에 글리세롤 주식과 행진을 해제 균주. 5 % CO 2, 37 ° C에서 인큐베이터에서 하룻밤 성장. </li><li> 하룻밤 문화에서 20-30 식민지를 추출하고 0.042 %의 NaHCO3, 0.01 M의 MgCl 2, 1 % Polyvitex 보충 8 ml의 Proteose 펩톤 매체를 포함하는 튜브에 전송합니다. </li><li> 220 rpm으로 37 ℃에서 1.25 시간 동안 세균을 흔들어. 실온에서 10 분 동안 2,684g에서 원심 분리하여 균체 펠릿. 뜨는을 취소하고 8 ML의 무 혈청 배지와 세균 펠렛을 재현 탁. 소용돌이는 더욱 서스펜션을 보장합니다. </li><li> 배양 밀도를 결정하기 위해, 600 nm 인 광학 밀도 (OD)로 1:10 희석도를 측정한다. OD 0.1 600 세균 현탁액을 조정합니다. 참고 :이 서스펜션이 약이 포함되어 있습니다. 1 × 10 8 CFU / ㎖. </li><li> 박테리아 세포 농도를 확인하기 위해, 최대 서스펜션 단계적 (1:10) 희석초콜릿 한천 플레이트 상에 10-5의 희석과 접시. 주의 : 유사한 연속 희석 세균 성장​​ 곡선을 계산하기 위해 수행 될 필요가있다. </li></ol> 이중 면역 형광에 의한 세균 침략의 세포 배양 필터 삽입 및 결정에 HIBCPP 세포의 7 감염 <ol><li> 1 % FCS, 5 μg의 / ㎖ 인슐린을 포함하는 배지에서 세포 배양을 계속 한 후, 상피 조직 voltohmmeter를 사용하여 매일 세포를 측정한다. 세포가 약 500 Ω X cm²의 봉사자에 도달 한 경우, 감염을 수행한다. </li><li> 시간의 지정된 기간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 점 감염 인큐베이터에 감염된 세포 (MOI)의 다수의 세균 현탁액을 제조로 세포를 감염. 주 : MOI가 합류 (1.21 × 106 세포 / ㎠)에서 계정에 세포 배양 필터 인서트 당 세포의 수를 고려하여 계산 될 수있다. </li><li> 감염되고 중지1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 500 μL의 혈청 배지로 3 회 (SFM)을 세정 이온 하부 구획 필터 구획에 1 ml에 적용 하였다. </li><li> 500 μL의 SFM 필터 실에 1 % BSA 버퍼를 포함하고 비특이적 결합 부위에 대한 항체의 부착을 방지하기 위해 실온에서 20 분 동안 상기 하부 구획의 1 ml의 차단. </li><li> 100 ㎕를 일차 항체 항 N.으로 품어 필터 구획하고 실온에서 20 분 동안 상기 하부 구획의 500 μL : meningtidis α-OMP (200 1). 주 : 필요한 경우, 항체 농도가 적정 될 필요가있다. </li><li> 필터 실로부터 매체를 흡입하여 세포를 세척, 1 % BSA를 함유하는 제조도 1 ML의 SFM에 필터 인서트를 전송하고, 1 % BSA를 함유하는 500 μL의 SFM과 비운 필터 실을 채운다. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 필터 안돼요을 500 ㎕의 4 % 포름 알데히드로 세포를 고정rtment 실온에서 10 분 동안 하부 구획 한 용액. </li><li> 필터 실에서 매체를 흡입하여 세포를 씻으, 한 ML PBS와 준비를 잘하여 필터 삽입을 전송하고 500 ㎕의 PBS로 비워 필터 구획을 입력합니다. 일단이 단계를 반복합니다. 참고 : 샘플 4 ° C에서 PBS에 밤새 저장할 수 있습니다. </li><li> 컷 고정 된 세포 배양은 삽입의 필터링 250 ㎕의 PBS가 1 % BSA를 함유 씻는다. 세포 외 박테리아를 얼룩 : 라벨 250 μl의 형광 (여기 파장 594 nm의) 차 항체 닭 반 토끼 (500 일)와 실온에서 15 분 동안 세포를 품어. 주 : 필요한 경우, 항체 농도가 적정 될 필요가있다. </li><li> PBS 250 ㎕를 실온에서 1 시간 동안 1 % BSA 및 0.5 % 트리톤 X-100가 함유 된 세포 Permeabilize 하시려면. 250 ㎕의 PBS가 1 % BSA를 함유하는 세포를 세 번 씻는다. </li><li> 250 μL 차 항체 항 N.으로 품어 뇌수막염 </EM&gt; α-OMP (1 : 200) 30 분 동안은 역외 및 세포 내 세균을 염색합니다. 250 ㎕의 PBS가 1 % BSA를 함유하는 세포를 세 번 씻는다. </li><li> 형광 표지 (여기 파장 660 ㎚) Phalloidin의 (1 : 250) 및 4&#39;- 나프티 diamidino -2- 페닐 인돌 염산염 (DAPI () : 형광 표지 (여기 파장 488 ㎚) 이차 항체 (500 (1)) 250 μL를 적용 1 : 50,000) 실온에서 1 시간 동안 역외 및 세포 내 박테리아, 액틴 세포 골격과 핵을 염색합니다. 주 : 필요한 경우, 항체 농도가 적정 될 필요가있다. </li><li> 250 ㎕의 PBS가 1 % BSA를 함유하는 세포를 세 번 씻는다. 현미경을 통해 검사까지 4 ° C에서 매체 및 저장을 장착의 셀을 포함. </li><li> 미리 정의 된 필드 당 침입 박테리아의 수를 결정합니다. 필터 멤브레인 당 20 필드를 계산하여이 작업을 수행합니다. 침입 세균의 비율을 계산한다. 참고 : 지역 코픽으로 20 현미경 분야의 평균 세균 수를 곱하면ient. 결과는 0.33 cm² 세포 배양 필터 인서트 본 총 박테리아의 양을 나타낸다. 감염 기간 동안 배지에서 자란 균의 양이이 값을 나눈다. </li></ol>

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제어 포인트의 상피 세포는 혈액 2,3-에서 CSF를 분리 BCSFB을 형성한다. 우리는 최근 BCSFB의 기능적 인간 모델로 HIBCPP 세포주를 확립. 세포는 높은 막 전위의 개발 고분자에 대해 낮은 투과성뿐만 아니라 TJS 5 연속 스트랜드의 존재를 포함하여 시험 관내 BCSFB 중요한 장벽 기능을 표시. TJ 단백질은 세포의 기저 / 혀끝 극성에 기여한다. 극성 표면 수용체에 관한 지역화 높은 중요성뿐만 아니라 특정 수송 체 단백질이다. 우리는 CNS 6,7 내에서 높은 제어 미세 환경을 유지하는 ATP 바인딩 카세트의 수용체 ECAD와 만난뿐만 아니라 회원 (ABC) 트랜스 포터 가족의 극성 현지화를 보여 주었다. BCSFB을 극복하여 CNS에 항목을 얻을 수있는 여러 가지 미생물 지도자로있다수막염 (8)을 포함한 중증 질병에 g. CP 상피 세포에 침입 할 수있는 병원체의...

혈액 - 뇌척수액 장벽 (BCSFB)은 혈액과 뇌 (1) 사이의 세 가지 장벽 사이트 중 하나입니다. 그것의 형태 학적 상관 관계가 맥락막 신경총 (CP) 2,3의 상피 세포이며, 강력하게 혈관과 뇌의 뇌실에 위치하고있는 내피 - 상피 컨볼. 제어 포인트는 뇌척수액 (CSF)를 생산뿐만 아니라 혈액에서 후자를 분리하는 역할을한다. 장벽 기능을 달성하기 위해, CP 상피 세포는 낮은 pinocytotic 활성을 나타내는 특정 전송기를 표현하고 조밀 기밀 접합 (TJS) 2,3-의 연속적인 네트워크에 의해 접속되어있다. 일본인 여성 4 악성 맥락막 신경총 유두종 유래의 인간 맥락막 신경총 유두종 (HIBCPP) 세포의 BCSFB의 시험 관내 모델의 기능을 구성하는 데 사용 하였다. HIBCPP 세포는 TJ의 형성 등의 기능 BCSFB의 특성 몇 가지를 보여스트랜드 transepithelial 전기 저항 (티이)로 판정 할 수있는 높은 transepithelial 막전위의 개발 및 거대 분자를위한 작은 투과성. 또한, HIBCPP 세포는 이온 성 미세 환경을 조절하는 역할을하고, 기저 / 혀끝 극성 5,6,7를 표시 할 수 있습니다 특성 수송을 표현한다. BCSFB는 중추 신경계 (CNS)에 8 병원균 (박테리아, 바이러스, 진균)에 대한 엔트리 사이트로서 기능하는 것으로 나타났다. 나이 세리아 뇌수막염 (N. 뇌수막염), 그람 음성 박테리아를 포함하여 병원균의 침입은 뇌막염과 같은 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 는 CP의 보호 상피 장벽을 극복 증거가 수막 구균 성 질환은 혈관과 CP 상피 세포 9, 10에서 수막 구균의 증가 금액을 나타내는 환자에서 조직 병리학 적 관찰에 의해 지원됩니다. 숙주 세포 바로 항목을 얻으려면cteria들은 중​​재 또는 숙주 세포에있는 특정 표면 수용체에 의해 트리거되는 endocytotic 메커니즘을 하이재킹. 이들 수용체와 병원체의 상호 작용이 종 수 있기 때문에 특정 (11) 동물 모델은 제한된 범위로 참고 될 수있다. HIBCPP 세포주 침입 프로세스뿐만 아니라 인간의 모델 시스템에서 기본이되는 분자 기전을 연구 할 수있는 기회를 제공한다. 세포 배양 삽입을 사용하는 두 가지 세포 측면에서 숙주 세포로 병원균의 상호 작용을 분석하기 위해 우리가 할 수 있습니다. 많은 박테리아를 포함 N. 뇌수막염은 감염 분석하는 동안 중력의 영향을 강하게 될 수 있습니다. 분석법 중 HIBCPP 세포와 병원체의 최적의 상호 작용의 경우, 초기 박테리아는 세포 배양 필터 삽입 시스템의 상부 구획에 첨가 하였다. 각각 체외 시스템의 두 가지 변화가 있었다 ESTA 꼭대기 또는 기저 세포 측에서 감염을 사용하려면blished : 표준 시스템에서 HIBCPP 세포 미생물이 CSF 측에 위치하며 셀 (도 1a, C)의 꼭대기면 접촉에 들어갈 때의 상황을 모방 필터 인서트의 상부 구획으로 시딩 하였다. 반면, 반전 된 세포 배양 필터 인서트 시스템에서 HIBCPP 세포를 사용하여 세균이 혈류를 입력 한 상황을 반영한다. 미생물은 기저 측 (그림 1B, D)에서 혈액과 만남 CP 상피 세포에 전파. 주목할이 모델 시스템에서 세균이 기저 세포 측면에서 특히 5,7- 극성 방식 HIBCPP 세포에 침입하는 것이 밝혀졌다. 이어서 CP의 감염의 병원체가 침입 패턴 - 인식 수용체를 통해 결찰 선천 면역 (PRRS)에 의해 인식 될 수있다. PRRS의 잘 설명 된 회원은 수신자 같은 수용체 (TLR) 가족에 속한다. TLR들 수 빈라고 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 있습니다 감염성 미생물의 특성 구조에 라. 수용체의 결찰 차례로 BCSFB 13,14 걸쳐 윤회 면역 세포를 자극 사이토 카인 및 케모카인 (12)의 발현을 유발 숙주 세포의 활성화 시그널링 캐스케이드로 이끈다. HIBCPP 세포가 여러 가지의 mRNA 수준에서 TLR들과 N.와 그 감염을 표현하는 것으로 밝혀졌다 뇌수막염은 CXCL1-3, IL6, IL8 및 TNFα (15, 16)를 포함한 여러 사이토 카인과 케모카인의 분비를 초래한다. 여기에서는 BCSFB 모방 반전 세포 배양 삽입 시스템에서 배양하고, 인간 세포주 HIBCPP 감염을 설명한다. 이 모델 시스템은 생체 관련 기저 세포 측면뿐만 아니라, 이후 세포 반응과 병원균의 상호 작용을 연구 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4&acute;,6 디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>안티 Neisseria 수막염 &알파;-OMP</td><td></td><td></td><td>이 항체는 H. Claus 박사와 U. Vogel 박사(University of W&uuml; rzburg, Germany)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (닭 토끼 방지)</td><td>Invitrogen</td><td>A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 (닭 토끼)</td><td>Invitrogen</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 660 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>초콜릿 한천 플레이트</td><td>Biomerieux</td><td>43109</td><td></td></tr><tr><td>사이토칼라신 D</td><td>시그마</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-글루트 + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-글루트 + 15 mM HEPES w/o 페놀레드</td><td>Gibco</td><td>11039-047</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>2393</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Mg + Ca</td><td>Gibco</td><td>14040-174</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Polyvitex</td><td>Biomerieux</td><td>55651</td><td></td></tr><tr><td>프로테오스 펩톤</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>무혈청 배지</td><td>Gibco</td><td>10902-096</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트용 Thincert 세포 배양 인서트, 공극 크기 3 &마이크로; m</td><td>Greiner</td><td>662630</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 75 cm&sup2; 레드 캡 멸균</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>볼트-옴 미터 Millicell-ERS2 MERSSTX01 전극</td><td>Millipore</td><td>MERSSTX00</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 혈액 - 뇌척수액 장벽의 맥락총 상피 세포 기반 모델은 기저 측면에서 세균 감염을 연구하는

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

뇌의 심실계에 위치한 맥락막총(CP)의 상피 세포는 혈액-뇌척수액 장벽(BCSFB)을 형성합니다. BCSFB는 혈액에서 뇌척수액(CSF)을 분리하고 분자 교환을 최소한으로 제한하는 기능을 합니다. BCSFB의 시험관 내 모델은 인간 맥락막 신경총 유두종(HIBCPP)에서 유래한 세포를 기반으로 합니다. HIBCPP 세포는 밀착연접(TJ)의 형성, 경상피 전기 저항(TEER)의 발달, 거대분자에 대한 미미한 투과성을 포함한 전형적인 장벽 기능을 나타냅니다. BCSFB를 통해 중추신경계(CNS)에 침투하여 뇌수막염과 같은 심각한 질병을 유발할 수 있는 여러 병원체가 있습니다. 이러한 병원체 중 하나는 인간 특이적 박테리아인 Neisseria meningitidis(N. meningitidis)입니다. 역 세포 배양 필터 삽입 시스템에서 HIBCPP 세포를 사용하면 기저측 세포 측에서 BCSFB 세포와 병원체의 상호 작용을 연구할 수 있으며, 이는 생체 내와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 세포 배양 삽입물에서 HIBCPP 세포의 파종 및 배양에 대해 설명합니다. 또한, 이중 면역형광을 통한 침입 및 부착 박테리아의 분석과 함께 N. meningitidis에 의한 세포의 감염이 입증되었습니다. CP의 세포는 종양 세포의 뇌 전이뿐만 아니라 알츠하이머병 및 다발성 경화증과 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 다른 질병에도 관여하기 때문에 모델 시스템은 다른 연구 분야에도 적용될 수 있습니다. 이는 분자 메커니즘을 해독하고 새로운 치료 표적을 식별할 수 있는 잠재력을 제공합니다.

여기에서 우리는 역 세포 배양 삽입 시스템에서 배양 및 HIBCPP 세포의 감염을 설명합니다. 이 모델은 우리가 (도 1)을 전파하고, 혈류를 통하여 상피 세포에 진입 박테리아의 생리 학적 상태를 재생 상기 기저 셀 측으로부터 침입 메커니즘 기본 분자 신호 경로를 연구 할 수있다. HIBCPP 셀 최소 레벨에 대한 분자 교환을 제한 할 수 있도록 소정의 배리어 기능을 표시. 이것은 adherens 접합 (AJ) 꽉 접합 (TJ) 단백질의 발현에 의해 달성된다. TJ 관련 단백질 occludin은, 클라우딘 및 ZO-1의 면역 형광 분석은 세포 TJS의 연속 가닥 (그림 2A, B, C)에 의해 서로 연결되어 있음을 입증, 세포 - 세포 접촉의 사이트에 중단없이 신호를 한 것으로 밝혀졌습니다. t의 상...

맥락막신경총(CP)의 상피 세포는 혈액-뇌척수액 장벽(BCSFB)을 형성합니다. BCSFB의 시험관 내 모델은 인간 맥락막 신경총 유두종(HIBCPP) 세포를 사용합니다. 이 기사에서는 세포 배양 필터 삽입 시스템을 사용한 HIBCPP 세포의 배양 및 기저측 감염에 대해 설명합니다.

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

이 방법의 전반적인 목표는 인간의 혈액-뇌척수액 장벽을 모사한 맥락막총 상피세포 기반 모델을 구축하는 것입니다. 이를 통해 기저-측면(basal-lateral)에서의 세균 감염 연구가 가능해집니다. 본 방법은 세균이 맥락막총 상피와 상호작용하는 동안 어떤 과정이 관여하는지와 같은 중추신경계 감염성 질환에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 상피 세포의 기저 측면 검은 부분(basal lateral black side)과 병원체 간의 상호작용 분석이 가능하다는 점입니다. 이 방법은 면역 세포 및 종양 세포의 맥락막총 상피 통과 전이 조사와 같은 다른 연구에도 적용될 수 있습니다. 저는 Shibata 등이 2005년에 발표한 논문을 읽었을 때, 이 방법에 인간 맥락막총 유두종 또는 HIBCCP 세포를 사용하는 아이디어를 처음 얻었습니다.세포주에 대해 설명합니다. 먼저 멸균 핀셋을 사용하여 공극 크기가 3 $\mu$m인 0.33 $\text{cm}^2$ 성장 면적의 세포 배양 필터 인서트를 12웰 플레이트의 각 웰에 거꾸로 배치합니다. 그런 다음 세롤로지컬 피펫을 사용하여 웰에 예열된 배지 약 3 mL를 채우고, 하단 구획이 가득 찰 때까지 초과 용액을 흡입하여 제거합니다.다음으로, 10% FCS가 첨가된 37°C의 계대배양 배지 100 µL를 필터 위에 추가합니다. 배지를 추가할 때 기포가 생기지 않도록 하는 것이 매우 중요한데, 기포가 생기면 세포에 영양분이 충분히 공급되는 것을 방해하기 때문입니다. 모든 인서트에 배지를 추가했다면, 플레이트를 덮고 인서트들을 37°C, 5% CO2 배양기로 옮깁니다.이제 HIBCPP 세포가 담긴 플라스크를 10 mL의 PVS로 두 번 흔들어 세척합니다. 두 번째 세척 후, 세포에 0.25% trypsin EDTA 3 mL를 넣고 플라스크를 흔들어 섞습니다. 그런 다음, 세포를 약 20분 동안 배양합니다.배양 종료 후, 세포가 플라스크 바닥에서 떨어져 나와 둥근 형태를 띠는지 확인합니다. 세포는 서로 완전히 분리되지 않으며 종종 응집된 상태로 관찰됩니다. 반응을 중단시키기 위해 17 milliliters의 배지를 가해 배양물을 재부유시킨 후, 부유액을 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.그 다음, 세포를 원심 분리하여 가라앉히고, 세포 펠렛을 적절한 부피의 배지에 다시 현탁하여 세포 수를 측정합니다. 이어서, 세포 농도를 1 × 10⁶ cells/mL로 희석한 후, 튜브를 반전시켜 세포를 균일하게 분포시킵니다. 그런 다음, 각 필터 인서트 상단에 80 µL의 세포 현탁액을 첨가합니다.모든 인서트에 세포 파종이 완료되면, 플레이트를 덮고 인큐베이터로 옮겨 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 24웰 플레이트의 각 웰에 배지 1 mL를 추가합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 각 인서트를 들어 올려 내부의 배지를 버리고, 인서트를 24웰 플레이트의 개별 웰에 정방향으로 배치합니다.필터 인서트를 12-웰 플레이트에서 24-웰 플레이트로 뒤집어 옮길 때, 상단에 배양 중인 세포가 있는 필터 막을 건드리지 않도록 주의하십시오. 인서트에 0.5 milliliters의 신선한 배지를 채운 후, 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 이틀마다 신선한 배지가 담긴 새로운 24-웰 플레이트로 인서트를 옮겨 상단 구획의 배지를 교체해 줍니다.세포의 경상피 전기 저항(trans-epithelial electrical resistance, TEER)을 측정하려면, 먼저 상피 조직 전압-전류계의 전극 팁을 80% 에탄올에 담급니다. 15분 후, 전극을 에탄올에서 꺼내어 건조시킵니다. 그 다음, 전극 팁을 소량의 배양액에 넣고 15분 동안 더 유지합니다.전극이 평형 상태에 도달하면, 긴 팔 부분이 세포 배양 플레이트의 한 웰 내 하단 구획의 바닥에 닿게 하고, 짧은 팔 부분은 필터 인서트 구획까지 닿도록 배치하십시오. 공백 값을 얻기 위해 세포가 없는 배지가 담긴 세포 배양 필터 인서트의 저항값을 측정하십시오. 그런 다음, 세포가 파종된 각 인서트의 TEER을 측정하십시오.측정 후, 전극을 80% 에탄올에 15분 동안 담가 두었다가 건조한 튜브에 보관하십시오. HIBCPP가 파종된 인서트의 TEER 값이 70 ohms/cm²를 초과하면, 5 µg/mL의 인슐린과 1% FCS가 첨가된 신선한 배양액으로 배지를 교체하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양하십시오. 인서트 배양물의 세포 간 투과성을 결정하려면, 신선하게 조제된 50 µg/mL의 FITC-inulin이 포함된 신선한 저혈청 배양액을 각 인서트의 상단 필터 구획에 첨가하고 세포를 다시 인큐베이터로 옮기십시오.배양액의 TEER 값이 cm²당 약 500 ohms에 도달하면, 감염 다중도(multiplicity of infection) 10으로 원하는 세균 현탁액을 세포에 감염시키고 적절한 배양 기간 동안 세포를 인큐베이터로 돌려보냅니다. 그 다음, 필터를 1 mL의 무혈청 배지가 담긴 새 웰로 옮겨 세포를 3회 세척합니다. 매회 필터 구획에 동일한 배지 500 µL를 넣습니다. 마지막으로, 각 세포 배양 필터 인서트의 하단 웰에서 배지 샘플을 수집하고, 이를 10, 1, 2배 희석된 FITC-inulin 표준물질과 비교하여 마이크로 플레이트 리더로 측정함으로써 세균 감염 후 필터 구획에서 세포층을 통해 통과한 inulin의 농도를 결정합니다.HIBCCP 세포는 분자 교환을 어느 정도 제한할 수 있게 하는 특정한 장벽 기능을 나타냅니다. 예를 들어, ZO-1, Occludin 및 Claudin-1 단백질과 관련된 밀착 연접의 면역형광 분석 결과, 세포 간 접촉 부위에서 끊어지지 않는 신호가 관찰되었습니다. 이는 밀착 연접의 연속적인 가닥을 통해 세포들이 서로 연결되어 있음을 보여줍니다.적절한 조건에서 배양했을 때, HIBCPP 세포는 처리 전 최대 약 500 ohms per centimeter squared에 달하는 높은 막 전위를 나타내며, 거대 분자에 대한 낮은 투과성과 더불어 혈액-뇌척수액 장벽의 전형적인 장벽 기능을 유지합니다. 그러나 DMSO 농도가 증가함에 따라 TEER 값은 농도 의존적으로 감소하며, Cytochalasin D 처리 후에도 이와 유사한 유의미한 TEER 값의 하락이 관찰됩니다. 또한, 2 volume percent의 DMSO 또는 Cytochalasin D를 첨가하면 FITC-inulin flux에 대한 투과성이 상응하게 유의미하게 증가합니다.또한, HIBCCP 세포의 세균 감염 결과, 두 가지 병원성 세균 균주인 MC58 및 그 협막 결핍 돌연변이체에 의한 세포층으로의 상당한 침투가 확인되었습니다. 반면, 비병원성 alpha 14 균주에서는 미미한 침투만이 관찰되었습니다.이 절차를 수행할 때, 세포를 파종한 후에는 필터 막을 만지지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 접촉 시 온전한 HIBCCP 층이 파괴될 수 있기 때문입니다. 본 절차 이후, 맥락총 상피세포를 가로지르는 면역 세포 및 종양 세포 이동 기전과 관련된 추가적인 의문을 해결하기 위해 vitro 투과 분석(transmigration assays)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 약리학 분야의 연구자들이 맥락총 상피를 통한 기질의 전이를 in vitro에서 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, 병원균의 기저 측면 감염을 위한 혈액-뇌척수액 장벽의 HIBCCP 세포 기반 모델을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 병원균을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 안전 후드 내에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

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Medicine

의학

이 비디오는 혈액뇌장벽(BBB)을 통과하는 병원체를 연구하기 위한 체외 모델을 보여줍니다. 밀접한 연접을 발현하는 미세혈관 내피 세포는 상부 챔버에서 내피층을 형성하고, 뉴런, 성상세포, 미세아교세포는 다공성 막으로 분리된 하부 챔버의 뇌 실질을 나타냅니다. BBB 모델의 바이러스 감염은 혈액에서 뇌로 전달되는 병원체를 모방합니다. 신경친화성 바이러스를 도입하면 트랜스사이토시스(transcytosis)를 통해 BBB를 교차하여 신경 세포를 감염시키고 바이러스 자손을 복제 및 방출하여 성공적인 신경 침입을 보여줍니다.

혈액-뇌 장벽과 뇌 세포 감염의 병원체 교차를 연구하기 위한 체외 모델

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

여기에서는 체외에서 중추신경계로의 림프구 전이를 조사할 수 있는 인간 혈액-뇌 장벽 모델에 대해 설명합니다.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

여기서, 우리는 경피 / 내피 전기 저항 측정을위한 상업적으로 이용 가능한 젓가락 전극과 함께 사용할 수있는 프로그래밍 가능한 출력 주파수와 저렴한 볼트 암페어 미터를 설정하는 방법을 보여줍니다.

프로그래밍 가능한 출력 주파수를 사용하여 자체 제작 된 볼트 암페어미터를 사용하여 TEER 측정을 수행하는 간단한 접근 방식

인간의 혈액-뇌 장벽은 선택적으로 친수성 분자와 병원체가 뇌에 침투하는 것을 방지합니다. 수막염과 수술 후 정신 착란을 포함한 여러 가지 병리는 혈액 - 뇌 장벽의 침투성 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 우리는 미생물 통과에 의한 장벽 투과성을 시험하기 위해 내피 세포 배양 모델을 기술한다.

미세 혈관 내피 세포를 통해 미생물 통과에 의해 혈액 - 뇌 장벽의 투과성 분석

이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

이 연구는 분리 된 관류 된 마우스 뇌 맥락막 신경총에 대한 유세포 측정과 두 가지 게이팅 전략을 사용합니다. 이 프로토콜은이 뇌 구조를 채우는 주요 면역 세포 하위 집합을 식별합니다.

미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화

맥락막 신경총(CP)은 신경과학에서 충분히 연구되지 않은 조직으로 중추신경계의 건강과 질병에 중요한 역할을 합니다. 이 프로토콜은 CP를 분리하기 위한 미세 해부 기술과 세포 구조의 전체 보기를 얻기 위한 주사 전자 현미경의 사용을 설명합니다.

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

배우세요 인간 혈액-뇌척수액 장벽의 맥락총 상피 세포 기반 모델을 HIBCPP 세포를 사용하여 기저측면 세균 감염을 연구하는 방법입니다. 이 기법은 중추신경계 감염 질환의 병원체-상피 상호작용 분석에 활용됩니다.

인간의 혈액 - 뇌척수액 장벽의 맥락총 상피 세포 기반 모델은 기저 측면에서 세균 감염을 연구하는

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