Name: EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 학습하세요 EAK16-II/EAKIIH6 펩타이드를 이용한 흉선 상피 세포의 3차원 집합체 형성 방법을. 밀도 구배 및 FACS 정화 기술로 세포를 분리하고 생분해성 하이드로겔 환경에서 세포 생존과 기능을 유지하는 실험 기법을 익혀보세요.

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이 작품은 R21 AI113000 (WSM)와 R01 AI123392 (YF)는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부분적으로 부여 지원되었다.

실험에 사용 된 모든 동물은 앨 건강 네트워크 / 앨 가수 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 검토 및 승인 프로토콜에서 앨-가수 연구소에서 동물 시설에 수용되었다. 1. 콜라게나로 흉선 소화 <ol><li> 수확 흉선 분비. <ol><li> 흉선을 수확 3-5 주령 C57BL6 / J의 이산화탄소에 마우스 (CO 2) 챔버를 안락사. 구체적으로, 3 ~ 5 분 동안 CO 2 유도에서 챔버에 마우스를 배치하고 심장 또는 호흡 정지를 확인하여 죽음을 확인합니다. </li><li> 그 뒷면에있는 시체를 놓고 70 % 에탄올로 몸을 젖은. 피부를 통해 자사의 복부에 날카로운 직선 해부 가위로 작은 수평 절개를합니다. 이 밖에 내부에 켜져 있도록 양쪽 끝 (머리와 다리)에 피부를 당겨. </li><li> 해부 가위 바로 아래에 수평 절단합니다가장 낮은 리브와 옆으로 다이어프램을 잘라. 겸자와 칼 모양의 과정을 잡고 양쪽에 최대 진행 리브의 중간을 잘라. 흉선은 명확하게 볼 수 있도록 갈비 / 흉골을 당깁니다. 참고 : 흉선은 직접 심장의 상단에 놓여 두 엽으로 구성되어 있으며 흰색 반투명​​ 색이다. </li><li> 부드럽게 특종 및 결합 조직 및 세척 용액에 전송 오프 흉선 로브를 당겨, 곡선 집게를 사용하여 (물질의 목록 참조). </li></ol></li><li> 9 ml로 RPMI-1640 (로스웰 파크 메모리얼 연구소 매체-1640) 0.025 ㎎ / ㎖ 정제 된 콜라겐, 10 mM의 HEPES [4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산, 0.2 ㎎ / ㎖을 혼합하여 소화 용액을 준비 50 ㎖의 원심 분리기 튜브의 DNase I. 사용할 때까지 37 ° C의 물을 욕조에서 소화 용액을 유지합니다. 참고 제조 소화 용액의 양이 하나 5 ㎖ 폴리스틸렌 원형 - 함께 배양 할 수 최대 5 성인 마우스 thymi, 충분바닥 튜브. </li><li> 5-6 ml의 RPMI-1640을 함유 한 60mm의 조직 배양 접시에 흉선 전송. </li><li> 림프구가 유출 할 수있는 작은 조각으로 28 G 인슐린 주사기 바늘 (약 1mm 3 사각형)과 흉선을 해부하다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫으로 배양 접시에 RPMI-1640과 흉선 조각을 씻어. 접시를 기울여과 흉선 조각이 바닥에 정착 할 수 있습니다. 천천히 대기음과 유리 피펫을 사용하여 RPMI-1640 상층 액을 버린다. 이 솔루션은 덜 불투명 때까지 유리 피펫으로 4-5 회 5-6 ml의 RPMI-1640이 세척 단계를 반복합니다. 참고 : 유리 피펫은이 단계에서 권장, 흉선 조각이 흉선 조직의 과도한 손실이 발생, 플라스틱에 집착하는 경향이 있기 때문이다. 절차의 나머지, 플라스틱 피펫을 사용합니다. </li><li> 단계 1.5에 기재된 바와 같이 최종 헹굼 후, 상층 액을 제거한다. 3 ㎖ 소화 솔루션을 추가하고 5 ㎖의 둥근 바닥 페이지로 흉선 조각과 솔루션을 전송olystyrene 튜브. </li><li> 튜브의 회전에 튜브를 넣고 12 rpm의 회전 속도로 6 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 배양 후, 흉선 단편은 중력에 의해 상기 튜브의 하단에 정착하자. 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 수집하고 세척 용액 10 ㎖로 50 ml의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 10 mL의 세척 용액으로 세포를 재현 탁. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 반복 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브 5 ml의에서 흉선 조각에 두 번 1.6-1.8 단계를 반복합니다. 같은 50 ML 튜브에 뜨는 수영장. 주 : 원심 번째 및 세 번째 세척 필요는 없다. </li><li> 50 ㎖의 원심 분리기 튜브에 튜브 및 전송에 남아있는 조각을 무너 뜨리는 최종 소화 한 후, 최대 피펫 2 ml의 플라스틱 혈청 학적 피펫 아래. </li><li> 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에서 50 ㎖ 튜브 세척 buffe 10ml에 뜨는, 재현 탁 대기음100 μm의 셀 스트레이너를 통해 연구 및 필터. 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 불연속 밀도 기울기와 TEC는 2. 심화 <ol><li> 2.4 mL의 밀도 구배 배지 (물 iodixanol의 V / w 60 %) 및 ​​9.6 mL의 세척 용액을 혼합하여 21 % 밀도 구배 용액을 제조 하였다. </li><li> 2.5 ml의 세척 버퍼에 5 분,에 resuspend 300 XG에 단계 1.11에서 50 ㎖ 수집 관에서 해리 흉선 세포를 원심 분리기. </li><li> 세포 현탁액에 20 ml의 RPMI-1640 배지를 추가합니다. </li><li> 전자 피펫으로 10 ㎖의 혈청 학적 피펫에서 21 % 밀도 구배 용액 12 ml를 채 웁니다. 50 mL의 원심 분리 튜브 함유 세포 하단의 혈청 피펫의 선단을 배치하고, 밀도 구배 용액이 중력을 통해 상기 튜브의 하단에 배수 할 수있다. <ol><li> 부드럽게 밀도가 다른 두 층을 생성 완료 피펫에서 밀도 구배 용액을 배출. </li></ol></li><li> 600 XG FO에서 원심 분리기R 스윙 버킷 로터에서 실온에서 20 분. 가장 느린 수준에서 감속 속도를 설정합니다. </li><li> 새로운 50 ㎖ 튜브에 상단 층과의 계면을 전송. 참고 : 열팽창 계수의 차이의 대부분은 인터페이스에 유지됩니다. 림프구는 원심 분리 후 튜브의 바닥에 침전됩니다. 이들 세포는 다른 용도로 사용되는 경우, 3 회 20 ㎖ 세척 용액 펠렛을 헹군다. 세척 완충액 10ml에 세포를 재현 탁. </li><li> 4 ° C에서 6 분 동안 400 XG에 단계 2.6 및 원심 분리기 튜브에 40 ml의 세척 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 피펫으로 상층 액, 흡인를 제거합니다. </li><li> 단계 2.7에 기재된 바와 같이 세척하고, 흡인 2 회 더 반복한다. </li><li> 세척 용액 2 ㎖에 재현 탁하고는 혈구 세포 계산. </li></ol> FACS 3. 분리의 열팽창 계수의 차이 <ol><li> 세정액 및 전송로 1 × 106 세포 / 100 ㎕의 농도로 290 단계에서 세포를 조절(유동 분류기의 지침에서 권장하는 폴리 프로필렌 또는 폴리스티렌) 5 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 세포. </li><li> 1 × 6 셀 당 2 μL 방지 Fc 수용체 IgG를 추가하고 10 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> (150 희석, 샘플 당 10 μl의 1) 및 안티는 EpCAM 항 CD45 추가 (1 : 100 희석, 샘플 당 10 μL) 항체 이상 20 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 4 ° C에서 6 분 동안 400 XG에 2 ml의 세척 용액을 원심 분리로 세포를 씻으십시오. 피펫으로 뜨는을 대기음. </li><li> 1 ㎖의 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 재현 탁. </li><li> 100 μm의 스트레이너를 통해 필터링합니다. </li><li> 정렬 악기의 셀을 적용합니다. 사이드 산란광 (SSC) / 전방 산란 광 (FSC) 패널 (죽은 세포), (13)을 정렬 CD45-는 EpCAM +의 선택 인구에 다음 게이트에서 가장 작은 세포를 제외한 림프구와 TEC 인구를 선택합니다. </li></ol> 4. GTEC / EAK 집계의 eneration 참고 : 시약 준비 및 층류 후드 혼합 셀을 포함하는 단계를 수행합니다. <ol><li> 멸균 된 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 안티 그의 태그 IgG를 4 μL, 안티는 EpCAM IgG의 8 μL 및 PA / G 2.6 μL를 혼합하여 PA / G 어댑터 착물을 준비하고, 5 분 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 세척 용액 및 피펫 낮은 증발, 96 웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트 잘 하나에 100 μL와 5 × 4 세포 / ml로 단계 3.7에서 분류 열팽창 계수의 차이를 조정합니다. 세포에 14.6 μl의 PA / G 어댑터 단지를 추가합니다. 4 ℃에서 20 분 동안 흔들 플랫폼에서 접시를 놓습니다. </li><li> 200 ㎕를 세척 용액으로 한 번 씻으십시오. 6 분 동안 400 XG에 접시를 원심 분리기. 마이크로 피펫으로 상층 액을 버린다. </li><li> 200 ㎕의 10 % 자당 용액으로 한 번 씻으십시오. 6 분 동안 400 XG에 원심 분리기. 마이크로 피펫으로 상층 액을 버린다. </li><li> 30 μl의 10 %의에서 재현 탁 세포물론 당 terile 자당 솔루션입니다. </li><li> EAKIIH6 10 μL (7.5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 실온에서 5 분 동안 품어. </li><li> 가 TEC 혼합물에 EAK16-II의 20 μL (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. </li><li> 겔화을 시작하는 시스템에 완전 배지 100 μl를 추가합니다. 실온에서 15 ~ 20 분 동안 플랫폼 통에 접시를 놓습니다. </li><li> 37 ° C에서 인큐베이터에있는 접시를 놓고 5 % CO 2. 2-4 시간 후, 전체 매체의 다른 100 μl를 추가합니다. </li><li> 사용할 때까지 매일 매체를 변경합니다. <ol><li> 대기음 마이크로 피펫을 사용하여 조심스럽게 웰의 벽에 피펫 팁을 배치하여 예열 배지 100 ㎕를 추가 겔을주지 않고 표면으로부터 배지 100 ㎕. </li></ol></li></ol> 가 TEC / EAK 집계 5. 특성 <ol><li> 생체 내에서 TEC / EAK 집계의 기능을 조사하기 위해, 무 흉선 누드의 신장 캡슐에서 O / N 문화와 이식 후 TEC / EAK 하이드로 겔을 수집마우스, 이전 절차 11,14 설명 사용. </li><li> 4~6주 안티 CD4의 칵테일 이식 얼룩을 게시 누드 마우스 -CD8, -CD45에서 EDTA를 함유 혈관으로 50 ~ 100 ㎕의 혈액 샘플을 채취하여 주변의 T 세포의 발달을 모니터링 및 -CD3 (12)는 항체. </li><li> 단일 세포 분석 소프트웨어 (12)를 사용하여 유동 세포 계측법으로 말초 혈액 백혈구 (FCM)에 T 림프구의 백분율을 분석한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

열팽창 계수의 차이가 흉선 기질의 주된 인구이며 흉선 샘의 구조와 기능에 필수적인 역할을하지만, 이들은 총 흉선 세포 수의 약 0.1 ~ 0.5 %를 차지한다. 그들은 또한 세포 사멸의 높은 비율이 때때로 즉, 치료는 세포 외 기질 (ECM)의 열팽창 계수의 차이를 해리, 콜라게나 제 소화 다음 관찰 깨지기 세포이다. 그들의 희귀 (~ 20 만 마우스의 흉선 당)과 취약성은 그것을 열팽창 계수의 차이를 분리하는 어려운 작업을했다. TEC 분리 고도로 정제 된 콜라겐 최근의 활용은 크게 효소 소화 15-19 다음 생균의 수를 증가하고있다. 항체 다량 세포 표면 라벨링 및 이벤트에 필요한 과도 번호 FACS에 의해 수집 될 필요가있다 그러나 열팽창 계수의 차이를 매우 작은 숫자들이 분석 및 분리를위한 중요한 과제로 남아. 항체 복합체 동안D 자기 비드 기술은 CD45 + 흉선 세포를 고갈하는 데 사용할 수 있습니다, 그들의 큰 수량이 장기적으로...

흉선이 획득 면역계의 기능에 필수적인 병원체 반응성 자기 저항성 T 세포의 다양한 집단의 생성을 담당 차 림프 기관이다. 그것은 흉선 기질의 스폰지 상 3 차원 (3-D) 매트릭스를 통해 이주 현상 흉선 세포는 림프구 전구 세포와 골수 이민 동적 인 기관이다 계통 명세서 및 분화를 거쳐, 최종적으로 이주 성숙한 T 세포. 이 아니라 프로그래밍 프로세스의 성공은 주로 이주 흉선 및 신청 흉선 상피 세포 (TEC는) 설정 및 흉선 미세 환경의 무결성을 유지하기위한 필수적인 가슴샘 기질의 주된 집단 간의 크로스 토크에 따라 다르다. 그 해부학 적 위치 및 고유 함수에 기초하여, TEC는 두 개의 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 피질의 열팽창 계수의 차이이다 respon (cTECs)자기 MHC (주요 조직 적합성 복합체)을 선택하기위한 sible은 T 세포 (긍정적 인 선택) 및 자기 반응성 T 세포 (음 선택) 1, 2를 제거하기위한 필수적인 수질의 열팽창 계수의 차이 (mTECs)을 제한. 많은 요인 (예를 들어, 노화, 감염, 방사선 조사, 약물 치료) 손상된 적응 면역의 결과로, 흉선 상피 세포에 돌이킬 수없는 손상을 일으킬 수 있습니다. 수많은 시도에도 불구하고, 흉선 기능을 복원하기 때문에 흉선 미세 환경을 재현하는 어려움에 도전하고있다. 2 차원 환경에서 배양 TEC는 빠르게 thymopoiesis 3,4에 중요한 유전자의 발현이 감소하는 반면 특히 흉선 3 차원 (3-D)의 구성은, 열팽창 계수의 차이의 생존과 기능에 중요하다. EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK)과 C 말단 histidinylated 아날로그 EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH)은 저 분자량, 탈 물 공급에 가용성 인 양친 매성 올리고 펩타이드이다20 mM의 염화나트륨 (인간 체액 정상 염 농도 154 mM)을보다 높은 이온 강도에 노출되었을 때 R, β-브릴을 형성 겔화하지만 겪는다. 이 환경에 응답 특성은 3 차원 구조를 형성하기 위해 그들에게 다목적 빌딩 블록을 만든다. 단지 단백질 약물과 다른 생체 분자를 고정 할 수있는 어댑터 역할을 할 수 있습니다 (: EAKII-H6에 그의 태그는 도킹 메커니즘을하는 항 그의 IgG를 / 된 Fc 결합 재조합 단백질 A / G (PA / G는 αH6) 제공 예를 들어 하이드로 겔 합성 5-8 항체). 우리는 이전에 하이드로 겔에 고정 형광 표지의 IgG 분자 최대 십삼일 9 주사 부위에 유지 될 수 있음을 증명하고있다. αH6 때 또한 : 안티 - CD4 IgG를 함께 고정 PA / G 어댑터가 EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) 하이드로 겔에 첨가하고, CD4 + T 세포는 특별히 (10)를 체포했다. 유사한 기술을 사용하여, 최근 입증하는 TEC는 (C)의 3-D 통합(: PA / G : αEpCAM αH6) TEC-특정 안티는 EpCAM 항체를 운반하는 어댑터 단지와 EAK 하이드로 겔에 승진 울드. 누드 마우스의 신장 캡슐 밑에 이식하면 EAK 히드로 겔에 포함 된 TEC 클러스터 효과적으로 생체 내에서 기능적 11,12 T 세포의 발달을 지원할 수있다. 여기서 우리는 신속하고 효과적으로 형광 - 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬과 열팽창 계수의 차이를 정화하고 EAK 하이드로 젤 시스템과 3 차원 TEC 응집체를 생성하기 위해 방법을 도시한다.

<table><tbody><tr><td>TEC Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701(1 Gallon)</td><td>Ethanol 200 Proof, deionized water</td></tr><tr><td>Dissecting scissors, straight</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>그레이프 겸자, 스트레이트</td><td>파인 사이언스 툴 Inc.</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게, 곡선</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>세척 용액</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0.1% BSA, 2&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (인산염 완충 식염수)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (소 혈청 알부민)</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>소화 용액</td><td></td><td></td><td>9 ml RPMI-1640, 0.025&nbsp; mg/ml Liberase TM 연구 등급, 10&nbsp; mM 헤페스, 0.2&nbsp; mg/ml DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM 연구 등급</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>"정제된 콜라겐분해효소"라고 불립니다</td></tr><tr><td>.1&nbsp; M HEPES</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; ml 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm 조직 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp; cc U-100 인슐린 주사기 28&nbsp; 1/2&nbsp; G</td><td>Becton 디킨슨</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브</td><td>팔콘</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml 유리 피펫</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-678-27E</td><td>흉선 조각을 헹구는 데 사용합니다. 흉선 조각은 플라스틱 피펫으로 벽에 달라 붙는 경향이 있습니다.</td></tr><tr><td>MACSmix 튜브 로테이터</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp; &마이크로; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>밀도 그라디언트 매체: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml 폴리프로필렌 라운드-바텀 튜브</td><td>팔콘</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD16/CD32 (Fc 블록)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>희석되지 않은 상태로 사용, 2&nbsp; &마이크로; 샘플당</td></tr><tr><td>l Anti-mouse CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>1:150, 10&nbsp; &마이크로; 샘플당</td></tr><tr><td>L Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>1:100, 10&nbsp; &마이크로; l 샘플 당</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단일 세포 분석 소프트웨어</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK Gel Assembly</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Tag</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td><td>"anti-His-Tag IgG"</td></tr><tr><td>정제 안티 마우스 CD326 (EpCAM)</td><td>BioLegend</td><td>118202</td><td>"anti-EpCAM IgG"</td></tr><tr><td>재조합 단백질 A/G</td><td>피어스 바이오테크놀러지</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>는 "1.5&nbsp; ml 마이크로 원심분리기 튜브"</td></tr><tr><td>96-well, 조직 배양 플레이트, 저증발 뚜껑이 있는 둥근 바닥</td><td>BD Falcon</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>Rocking 플랫폼: Nutator Mixer no.1105</td><td>BD Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 자당</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>멸균 증류수로 준비</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAKAK-CONH2)</td><td>American Peptide Company& 주의;</td><td></td><td>맞춤형 합성, 10&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)</td><td>미국 펩타이드 회사&nbsp;</td><td></td><td>맞춤형 합성, 7.5&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>완전한 중간</td> RPMI-1640<td></td><td></td><td>, 10% FBS, 1% 펜/스트렙, 1% L-글루타민, 1% NEAA, 5&nbsp; mM 헤페스, 50&nbsp; &마이크로; M 2-메르캅토에탄올</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>사용 전 열 비활성화</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200&nbsp; mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (비필수 아미노산) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(100개)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>플랫폼 쉐이커: 벨리 댄서</td><td>Stovall Life Sciences Inc.</td><td>모델: USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

eak 16-ii와 facs 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / eakiih6 자기 조립 하이드로 겔을

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

노화 또는 병리학적 모욕과 관련된 흉선 침범은 성숙한 T 세포의 생산량을 감소시킵니다. 기능이 저하된 흉선의 기능을 회복하는 것은 침입하는 병원체에 대해 효과적인 T 세포 매개 후천성 면역 반응을 유지하는 데 중요합니다. 그러나 흉선 재생과 활성화는 주로 흉선 상피 세포(TIC)의 생존과 기능에 중요한 흉선 기질의 고유한 3D 미세환경을 재현하는 데 어려움이 있기 때문에 어려운 것으로 판명되었습니다. 당사는 양친매성 EAK16-II 올리고펩타이드의 자체 조립 특성과 히스티딘화 유사체 EAKIIH6 기반으로 TEC 응집체의 형성을 촉진하기 위해 새로운 하이드로겔 시스템을 개발했습니다. TEC는 밀도 구배를 가진 분리된 흉선 세포에서 농축하고, 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 분류하고, 단백질 A/G 어댑터 복합체에 항-His IgG와 함께 고정된 항-상피 세포 접착 분자(EpCAM) 항체로 표지되었습니다. 세포 응집체의 형성은 TEC를 EAKIIH6 및 EAK16-II 올리고펩티드와 함께 배양한 다음 배지의 이온 농도를 증가시켜 겔화를 시작함으로써 촉진되었습니다. EAK 하이드로겔에 내장된 TEC 응집체는 흉선 누드 마우스에 이식할 때 생체 내에서 기능적 T 세포의 발달을 효과적으로 촉진할 수 있습니다.

CD45- 간질 세포를 풍부하게하는 밀도 구배 분리 프로토콜을 사용의 효과를 조사하기 위해, 인터페이스 석출 림프구 펠렛 모두에서 수확 한 세포를 항 CD45, 항는 EpCAM 항체로 염색 하였다. 두 방지 Ulex Europaeus 응집소 1 (UEA1) 및 안티 MHC 클래스 II 항체는 더 CTEC 및 mTEC 하위 집합을 식별하기 위해 염색 칵테일에 포함되었다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 우리는 일상적 TEC는 15-20 배 농축 가까이 달성 할 수 있었다. EAK 하이드로 겔의 열팽창 계수의 차이의 집계를 검사하려면, 열팽창 계수의 차이는 보편적으로 막 바인딩, 적색 형광 tdTomato 분자를 표현하는 4 주 이전 B6.ROSA 만 T / MG 마우스에서 분리 하였다. 전술 한 바와 같이 제조 T...

이 비디오는 FACS 분리를 위해 밀도 구배로 흉선 상피 세포(TECH)를 강화하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한 EAK16-II/EAKIIH6 펩타이드를 사용하여 TEC 응집체 형성을 촉진하는 것을 보여줍니다. EAK16-II/EAKIIH6 하이드로겔의 미세환경은 TEC의 생존과 기능을 유지하는 데 필요한 3D 구성을 제공합니다.

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

이 절차의 전반적인 목표는 흉선 상피 자가 생존 및 기능을 지원하기 위한 3차원 구조에서 흉선 상피 세포 응집을 촉진하는 데 EAK 16-II/EAKIIH6 펩타이드의 사용을 입증하는 것입니다. 이 방법은 흉선 생명공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 EAK-16-II/EAKIIH6 펩타이드를 활용하고, 흉선 상피 세포 응집을 촉진하고, 생분해성이며, 주사에 사용할 가능성이 있다는 것입니다.흉선을 채취하려면 3-5주 된 C57 블랙 6J 마우스를 누운 자세로 놓고 70% 에탄올로 머리카락을 적시는 것으로 시작합니다. 날카롭고 곧은 절개 가위를 사용하여 복부 피부를 가로로 작게 절개합니다. 그런 다음 절개 부위 양쪽의 피부를 당겨 복강을 노출시킵니다.다음으로 가장 낮은 리브 바로 아래를 수평 절단하고 횡격막까지 옆으로 자릅니다. 집게를 사용하여 xiphoid process를 당기고 가슴 양쪽을 따라 갈비뼈 중앙을 자릅니다. 흉선이 명확하게 보이도록 갈비뼈와 흉골을 위로 당깁니다.그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 결합 조직에서 흉선의 엽을 부드럽게 퍼내어 세척액에 넣으십시오. 헹굼 후 흉선을 5-6ml의 RPMI 1640이 함유된 16ml 조직 배양 접시에 옮기고 28게이지 인슐린 바늘을 사용하여 조직을 약 1입방밀리미터 정사각형 조각으로 절부합니다. 다음으로, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시의 매체로 조직 조각을 헹굽니다.그런 다음 접시를 기울여 조각이 바닥에 가라앉도록 합니다. 흡인에 의해 매체 상등액을 천천히 제거합니다. 그런 다음 용액이 덜 불투명해질 때까지 매번 5-6ml의 신선한 배지로 4-5회 더 세척을 반복합니다.최종 세척 후 접시에 3ml의 소화액을 넣고 흉선 조각과 용액을 5ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 옮깁니다. 섭씨 37도의 튜브 회전기에서 12rpm으로 6분 동안 조직을 배양합니다. 회전이 끝나면 파편이 튜브 바닥에 가라 앉고 파스퇴르 피펫을 사용하여 상등액을 10 밀리리터의 세척 용액이 들어있는 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.상층액을 원심 분리하고 얼음 위에 10ml의 새 세척액에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 방금 시연한 것처럼 회전기에서 흉선 조각을 두 번 더 소화하여 동일한 50ml 튜브에서 상층액을 당깁니다. 최종 분해 후, 플라스틱 2ml 혈청학적 피펫을 사용하여 남아 있는 단편을 분쇄하고 조직을 50ml 튜브로 옮깁니다.튜브를 회전시켜 세포를 수집하고 펠릿을 10ml의 세척 버퍼에 재현탁합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 올려 놓은 상태에서 100미크론 스트레이너를 통해 세포를 여과합니다. 흉선 상피 세포를 농축하려면 세포를 다시 스핀다운하고 펠릿을 2.5ml의 세척 완충액에 재현탁합니다.다음으로, 20ml의 RPMI 1640을 세포에 추가하고 10mL의 혈청학적 피펫을 사용하여 중력에 의해 세포 아래에 새로 준비된 21% 밀도 구배 용액 12ml를 조심스럽게 층을 이룹니다. 이제 가장 느린 감속 속도에서 스윙 버킷 로터에서 원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 원심분리가 끝나면 최상층과 계면을 새로운 50ml 튜브로 옮기고 최대 40ml의 세척 용액을 셀에 추가합니다.각 세척 후 상층액을 흡인하기 위해 피펫을 사용하여 3회 연속 원심분리하여 밀도 구배를 제거합니다. 그런 다음 계산을 위해 최종 펠릿을 2ml의 세척 용액에 다시 현탁시킵니다. 흉선 상피 세포 EAK 응집체를 생성하려면 흉선 상피 세포를 세척 용액에서 밀리리터당 4개의 세포로 희석하여 5배 10으로 조정하고 웰당 100마이크로리터의 세포를 저증발 96웰, 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 파종합니다.다음으로, 14.6마이크로리터의 갓 준비된 단백질 AG 어댑터 복합체를 각 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에 놓습니다. 20 분 후, 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 제거하여 웰 당 200 마이크로 리터의 세척 용액으로 세포를 씻습니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 10 % 자당 용액으로 세포를 다시 씻으십시오.웰당 30마이크로리터의 10% 멸균 자당 용액에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 10마이크로리터의 EAKIIH6에 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 20 마이크로 리터의 EAK 16-II를 첨가 한 다음 100 마이크로 리터의 완전한 배지를 첨가하고 플레이트를 실온의 플랫폼에 올려 놓아 겔화를 시작합니다.15-20분 후 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮겨 2-4시간 동안 가열합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 완전한 배지를 더 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배지를 변경하려면 마이크로피펫을 사용하여 겔을 방해하지 않고 배양물 표면에서 100마이크로리터의 배지를 흡인하고 팁을 각 웰의 벽에 대고 100마이크로리터의 예열된 배지로 배양물을 파종합니다.방금 시연된 바와 같이 밀도 구배 분리 프로토콜을 사용하면 CD45 음성 기질 세포는 이러한 대표적인 점도표에서 볼 수 있듯이 일상적으로 15배에서 20배 농축될 수 있습니다. 여기서, 방금 시연된 바와 같이 형질전환 마우스를 발현하는 4주 된 적색 형광성에서 제조된 흉선 상피 세포 응집체를 2일 동안 체외에서 배양하고 컨포칼 현미경으로 검사했습니다. 일단 숙달되면 흉선 상피 세포는 3-4시간 내에 유동 분류를 위해 농축될 수 있습니다.개발 후 이 기술은 흉선 조직 공학 분야의 연구자들이 적응 면역 체계를 조절하기 위해 주사 가능한 기능적인 미니 흉선 단위를 개발할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에의 준비 2 dGuo - 처리 증명 thymus 문화를 reaggregate.

Thymus 문화 Reaggregate

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

다음 프로토콜은 thiol - 에너지 사진을 클릭 반응에 의해 형성 단계 성장 PEG-펩타이드 hydrogels에서 췌장 β-세포를 캡슐화에 대한 기술을 제공합니다. 이 물질 플랫폼은 세포 캡슐화에 대한 cytocompatible microenvironment를 제공뿐만 아니라 hydrogels 내에 형성된 세포 구조의 사용자 관리 빠른 복구를 허용합니다뿐만 아니라.

단계 성장 PEG-펩타이드 Hydrogels에서 β-세포 Spheroids의 생성 및 복구

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

현재의 2D 배양 시스템이 in vivo 시나리오를 모방하지 않기 때문에 in vitro에서 수질 흉선 상피 세포를 연구하는 것은 대체로 성공적이지 못했습니다. 본 명세서에 기술된 3D 배양 시스템(변형된 피부 유기형 배양 모델)은 mTEC 증식, 분화 및 난잡한 유전자 발현의 유지를 재현하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

이 프로토콜은 3D 콜라겐 하이드로겔(두께 &lt;250μm)에서 섬유를 정렬하기 위해 확장 변형(스트레칭)을 생성하기 위해 유체 흐름 방향을 따라 기하학이 변화하는 미세유체 채널의 사용을 보여줍니다. 결과 정렬은 수 밀리미터에 걸쳐 확장되며 연신 변형률의 영향을 받습니다.

Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

여기에서는 흉선 상피 세포(TEC) 성숙 및 장기간의 유지 관리, 체외 흉선형성을 지원하는 것을 목표로 하는 3D 피브린 하이드로겔에서 성장한 인간 iPSC 유래 흉선 오가노이드 형성을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

학습하세요 EAK16-II/EAKIIH6 펩타이드를 이용한 흉선 상피 세포의 3차원 집합체 형성 방법을. 밀도 구배 및 FACS 정화 기술로 세포를 분리하고 생분해성 하이드로겔 환경에서 세포 생존과 기능을 유지하는 실험 기법을 익혀보세요.

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

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