Name: 알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: 학습하세요 동결 골절 기법과 저온 주사 전자 현미경을 이용하여 식물 잎 조직의 광합성 막 초분자 구조를 연구하는 방법을. 이 기술은 틸라코이드 막 단백질 복합체 분포와 생물광물질 위치를 규명하는 데 활용됩니다.

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우리는 전자 현미경 이미지를 스캔에 대한 자신의 도움이 조언을 안드레스 Kaech (취리히 대학) 감사합니다. 이 작품은 미국 - 이스라엘 Binational 농업 연구 개발 기금 (더 부여합니다. US-4334-10를, ZR을) 이스라엘 과학 재단 (더 부여합니다. 12분의 1,034을, ZR)을하고, 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 지원되었다 (RGP0005 / 2013, ZR). 전자 현미경 연구는 과학의 와이즈만 연구소의 어빙과 나노 Cherna 모스코 위츠 센터 및 바이오 나노 이미징에서 실시 하였다.

고압 냉동에 의해 잎 조직의 1 곳을 알아내는 - 고정 참고 :이 섹션은 동결 파괴 실험에 잎 조직의 고압 동결을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 식물 샘플과 관련된 고려 사항에 대해서는 29를 참조하십시오. 이것은 약간 변형 조직 또는 샘플들의 다른 유형에 적응 될 수있다. <ol><li> 면도날의 모서리를 사용하여, (도 1)을 0.1 / 0.2 mm의 알루미늄 판 상체의 0.1 mm의 캐비티의 바닥을 긁어. 12 개 이상의 혈소판 (6 샘플)을 준비합니다. 디스크의 둘레에 칼 자국을 만들 않도록주의하십시오. <ol><li> 긁힘 후, 무수 에탄올에 디스크를 씻어 그들을 건조하게 깨끗한 접시에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 제조업체의 지시에 따라 고압 냉동 시스템을 준비한다. 이소프로판올와 고압 냉동 기계의 알코올 챔버를 입력합니다. </li><li> 집에서 만든 진공 보조 infiltratio 준비N 장치는 액체와 잎 조직에서 발견되는 가스를 대체합니다. <ol><li> 단단히 10 ㎖ 주사기의 끝 부분에 200 μL 피펫 팁을 연결한다. 팁 ~ 1cm를 잘라. 단단히 절단 팁을 맞는 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 뚜껑에 구멍을 만듭니다. 진공 주사기의 플런저를 당겨 관내 생성 될 수있다. </li></ol></li><li> 면도날을 사용하여 식물 잎의 작은 조각을 잘라 핀셋으로 1 헥사로 절반 가득 microcentrifuge 관 내부의 잎을 배치합니다. 부드럽게 진공을 만들 수있는 플런저를 잡아 당겨 액체와 잎의 세포 간 공간을 침투, 약 30 초 동안 유지 한 후 천천히 플런저를 놓습니다. </li><li> 핀셋을 사용하여 튜브의 잎 조각을 제거합니다. 가 0.2 mm보다 두꺼운 경우에는 면도날과 잎을 잘라 내고 혈소판에 맞는 작은 조각을 잘라. </li><li> 냉동 시스템의 홀더에 가입 긁힌면이 깨끗하고 혈소판을 배치 한 후 르의 절단 조각을 배치혈소판에 AF. 1 헥사와 잎 주변의 나머지 공간을 채 웁니다. 잎 직면하고있는 상처와 다른 혈소판을 이용하여 샌드위치를​​ 닫습니다. </li><li> 닫고 홀더를 강화하고 시스템의 챔버에 삽입합니다. 다음 (~ 300 2,100 바 - 500 밀리 초)을 고정하기 위해 &#39;제트&#39;버튼을 눌러 신속하게 액체 질소에 홀더를 전송합니다. 조심스럽게 샌드위치를​​ 파괴하지 않도록주의하면서 미리 냉각 된 핀셋을 사용하여 홀더에서 냉동 샌드위치를​​ 제거합니다. 참고 : 휴일 냉동 샌드위치 즉시 골절 동결 또는 나중에 사용하기 위해 액체 질소에 보관 될 수 있습니다. 액체 질소를 처리 할 때 보호 복 및 보호 안경을 사용합니다. </li></ol> 2. 동결 골절 및 더블 레이어 코팅 27,28 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라, 백금 / 탄소 백금 (Pt / C), 탄소를 증발 건 모두 포함한 사용 냉동 파쇄 시스템을 준비. 45도에서의 Pt / C 총을 놓습니다ND 90도 카본 건. <ol><li> 사전 프로그램의 Pt / C (피복 률 0.02-0.04 ㎚ / 초)의 두 나노 층의 코팅 방식과 (0.1 ㎚ / 초 ~ AT) 탄소 나노 6 층. <ol><li> 동결 골절 기계의 화면에 설정을 입력합니다. 코팅 방식이 저장 될 사용자 번호를 선택합니다. </li><li> &#39;레이어 1&#39;에 대한 백금 / C를 선택합니다. 시간 프레임을 선택 예. 5 분 (코팅을 완료하기 위해 필요한 필요한 시간 초과). 2 nm의 두께를 정의하기 위해 상하 화살표를 사용. </li><li> 선택 탄소를 제외하고, 2 단계를 반복 2.1.1.2을 레이어로 이동 6 nm의 두께를 정의하기 위해 &#39;레이어&#39;버튼을 누릅니다. </li></ol></li><li> 테스트 및 총 동작을 조정합니다. <ol><li> 선택 &#39;레이어 1&#39;. &#39;GUN1&#39;버튼을 눌러 편 / C 건을 선택하고 동결 골절 기계의 증발 제어 장치에 &#39;ON&#39;버튼을 누릅니다. 증착 속도를 모니터링하고 UNT 전압 및 발광 노브를 사용하여 조정0.04 ㎚ / 초 - (IL)는 0.02의 비율로 도달. 를 눌러 &#39;OFF&#39;는 백금 / C 총을 끕니다. </li><li> 선택 &#39;레이어 2&#39;. 선택 &#39;GUN2&#39;를 제외하고, 2.1.2.1를 반복 0.1 나노 미터 / 초 ~의 증발 속도를 조정. </li></ol></li></ol></li><li> (수화 또는 탈수 잎에 대한 각각) -140 C 또는 -160 ℃로 동결 골절 시스템 단계 쿨. 기계로 진공 냉동 이송 셔틀을 장착하고 액체 질소로의 챔버를 입력합니다. -7 10 × 8 밀리바 - 냉각 동결 골절 실의 압력은 일반적으로 1 사이입니다. </li><li> 로딩 스테이션으로 동결 파쇄 시편 홀더 (3 mm 혈소판 적합)를 삽입한다. 액체 질소로 로딩 스테이션 챔버 홍수. </li><li> 고정밀 급 핀셋을 사용하여 하나 홀더 하나 상에 두 개의 냉동 샌드위치를​​ 넣습니다. 제자리에 안전하게 맞는지 확인하기 위해 홀더를 뒤집어 후 홀더에 첫 번째 샌드위치를​​ 조이고. 두 번째 샌드위치에 대해 반복합니다. </li><li> 디동결 골절 시스템에서 냉각 된 셔틀 인 Etach 및 로딩 스테이션에 연결합니다. , 셔틀 밸브를 열고 홀더에 후퇴 암을 소개하고 제자리에 고정. 셔틀에 홀더 팔을 다시 소개하고 로딩 스테이션 노브를 사용하여 셔틀 밸브를 닫습니다. 동결 골절 기계에 셔틀 버스를 연결하고 후퇴 팔 챔버로 홀더를 소개합니다. 기계에서 셔틀 버스를 분리합니다. </li><li> 이 샌드위치의 정상 혈소판을 노크되도록 높이로 동결 골절 마이크로톰 칼을 맞 춥니 다. </li><li> 마이크로톰 나이프, 신속하게 샌드위치를​​ 중단하고 즉시 칼에 파편 집착하여 샘플의 오염을 방지하기 위해 그것을 인상, 그리고 물 분자에 의해 오염 가능성에서 샘플을 보호하기 위해 새로 노출 된 평면 위의 냉각 셔터를 켜 챔버. </li><li> 코트 백금 및 카본으로 샘플. <ol><li> SC의 &#39;레이어 1&#39;을 입력재 N. &#39;ON&#39;버튼 다음에 &#39;GUN1&#39;버튼을 눌러 편 / C 총을 켭니다. 증발 속도를 조사하고 이르면 0.02 - 0.04 ㎚ / 초, 동시에 샘플을 노출시켜 증착 된 층의 두께를 모니터링 &#39;측정&#39;버튼을 누른다. 참고 : 두께가 미리 선택된 값에 도달 할 때 총이 자동으로 꺼집니다. </li><li> 백금 / C의 증착이 완료되면 셔터 샘플을 커버한다. </li><li> &#39;레이어 2&#39;로 이동하는 &#39;레이어&#39;버튼을 누릅니다. 반복 (카본) &#39;GUN2&#39;0.1 ㎚ / 초 ~의 증착 속도를 선택 제외한 2.8.1 및 2.8.2 단계. </li></ol></li><li> -120 ℃로 동결 골절 시스템 스테이지를 따뜻하게. </li></ol> 3. 전자 현미경을 알아내는은 스캐닝 <ol><li> 크라이 작업 주사 전자 현미경을 준비한다. <ol><li> 주 메뉴 및 확인의 단계 / 스테이지 초기화를 선택합니다. </li><li> 선택 도구 / 당함O 패널, 그리고 목록에서 선택하여 &#39;에어 록&#39;패널을 엽니 다. Close (닫기) 열 회의소 밸브 &#39;버튼을 클릭합니다. &#39;진공&#39;탭 아래에있는 벤트 버튼을 클릭하여 현미경 실을 환기. </li><li> 선택 도구 / 고토 패널, 그리고 &#39;스테이지 포인트 목록&#39;패널을 엽니 다. 샘플 홀더를 수용하기위한 적절한 좌표로 무대를 이동하는 냉동 교환 위치를 선택합니다. 주 : &quot;극저온 교환 위치&quot;진공 반송 유닛의 위치와 정렬되도록 미리 설정된다. </li><li> 장갑의 깨끗한 쌍 시료 챔버를 열고 현미경의 메인 무대에 크라이 단계를 삽입합니다. 챔버를 닫고 &#39;진공 탭&#39;아래의 펌프 버튼을 클릭합니다. </li><li> -120 ℃로 현미경 쿨. 액체 질소와 현미경 듀어를 입력합니다. 스테이지의 온도 이하 -120 ° C - 방울 후 -120 ℃로 크라이 전송 제어 장치에 가열 기능을 활성화. </li></ol></li><li> AT &amp; T는현미경으로 극저온 이송 셔틀을 ACH 및 (단계 250에서와 같이) 현미경 크라이 단계로 후퇴 아암을 이용하여 샘​​플 홀더 옮긴다. 현미경에서 셔틀 버스를 분리합니다. </li><li> 에어 락 패널에서 &#39;열기 열 회의소 밸브&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 조이스틱을 사용하여 - 조심스럽게 대물 렌즈 (2mm 작업 거리 1)에 가까운 시편 홀더를 이동합니다. &#39;조리개&#39;탭에서 10 μm의 구멍을 선택합니다. &#39;총&#39;탭에서 EHT 필드를 두 번 클릭합니다. EHT 목표 10 (kV의)를 입력하고 확인을 클릭합니다. 바닥 EHT 탭을 클릭하고 &#39;EHT에&#39;를 선택합니다. </li><li> &#39;감지기&#39;탭에있는 감지기 드롭 다운 목록에서 &#39;InLens&#39;를 선택합니다. 적절한 촬영 조건 (초점, 밝기 및 대비, 빔 정렬, 난시)을 최적화합니다. </li><li> &#39;검색&#39;탭을 클릭합니다. 빔 피해를 최소화하기 위해 (픽셀 당 나노초 (100)의 체류 시간에 해당하는 &#39;스캔 속도 = 1&#39;) 고속 스캔을 선택하고,1,024 x 768 픽셀의 &#39;스토어 해상도&#39;. &#39;노이즈 감소&#39;드롭 다운 목록에서 &#39;선 평균&#39;를 선택합니다. 검색을위한 30 라인 - 20 N의 값을 조정합니다. 골절 세포와 엽록체 (도 2A와 2B)와 지역을 검색합니다 (키보드에서 컨트롤 탭을 눌러)이 &#39;센터 포인트&#39;기능을 사용하여 샘플을 이동합니다. </li><li> (- 70 kX이 50) (그림 2C 및 2D) 낮은 배율에서 골절 엽록체의 이미지를 획득. 흥미로운 엽록체 골절면을 확대하고 높은 배율에서 이미지를 수집하기 위해 (키보드 제어 전환 탭을 눌러)이 &#39;센터 기능&#39;기능을 사용하여 (100-200 kX이, 3도, 4). 이미지 획득을위한 단계 3.6에서와 동일한 매개 변수를 사용하지만, 노이즈 감소 (30)에 대한 N&gt; 100 선 평균 값을 변경합니다. <ol><li> 주 현미경 제어 유닛에 또는 &#39;검색&#39;탭을 눌러 정지는 검색을 중지하고 저장&#39;저장 TIFF&#39;버튼을 눌러 이미지입니다. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 분석 참고 :이 섹션은 피지 (31) 오픈 소스 패키지를 사용하여 동결 골절 SEM 이미지에서 막 입자의 분할에 대한 간단한 절차를 설명합니다. 유사한 결과가 다른 화상 해석 소프트웨어를 얻을 수있다. <ol><li> 주 프로그램 창에 이미지 파일을 드래그하여 피지 오픈 이미지입니다. 이미지 / 종류 / 8 비트를 선택하여 8 비트 이미지를 변환합니다. 선택 이미지 / / 밝기 / 명암 대비를 조정하고 필요에 따라 (그림 5A)를 조정합니다. </li><li> 직선 도구를 사용하면 선을 포함 된 이미지 스케일 바의 크기를 그립니다. / 설정 규모를 분석 선택합니다. 적절한 규모의 정보 (길이 알려진 거리 단위)를 입력하고 확인을 클릭합니다. 이 조정 조정 된 이미지를 저장합니다. </li><li> 선택 프로세스 / 필터 / 가우시안 블러 (1.5 nm의 반경) 및 OK (그림 5B)를 클릭합니다. </li><li> 선택 이미지 / / AUT를 조정오 현지 임계 값합니다 (니 블랙 방법을 사용) 및 OK (그림 5C)를 클릭합니다. </li><li> 다음 편집 / 반전 및 프로세스를 선택 / 진 / 유역 (그림 5D). </li><li> 자유형 선택 도구와 관심 (ROI)의 영역 주위에 테두리를 그립니다. / 선택 편집 / 선택하여 투자 수익 (ROI) 관리자에게 선택을 추가 관리자 또는 &#39;T&#39;를 클릭하여 추가합니다. </li><li> 외부 편집 / 삭제 (그림 5E)을 선택합니다. </li><li> / 설정 측정 분석 선택 적절한 매개 변수 (예를 들어, 지역에 맞는 타원)을 선택합니다. </li><li> 분석 선택 / 입자를 분석합니다. 옵션 &#39;가장자리에 제외&#39;하고 확인을 클릭합니다 필요한 경우, &#39;관리자에 추가&#39;, 입자의 크기에 적절한 범위를 입력하고 &#39;결과 표시&#39;를 표시합니다. 결과는도 5F에 도시된다. </li><li> 저장된 조정 이미징 파일 (4.2 단계)를 엽니 다. &#39;모두보기&#39;를 선택하고 투자 수익 (ROI) 관리자에서 &#39;라벨&#39;을 선택 취소합니다. 선택한 partic를 검토레는 원본 이미지에 놓고 수동으로 추가하거나이 투자 수익 (ROI) 관리자의 버튼을 &#39;추가&#39;또는 &#39;삭제&#39;를 사용하여 선택을 제거합니다. 자유형 선택 도구와 ROI 관리자 (그림 5 세대와 5H)의 &#39;업데이트&#39;버튼을 사용하여 필요한 모든 선택 사항을 수정합니다. </li><li> 얻어진 측정 값을 사용하여 데이터를 분석한다. 결과 창에서 / 결과를 클릭 얻을 요약, 예를 들어, 평균 지역 및 주요 및 ROI 관리자에 나열된 입자의 마이너 축을 의미한다. , 결과 / 배포를 클릭합니다 (예 : 지역 등) 매개 변수를 선택하고이 매개 변수에 대한 히스토그램을 볼 수 확인을 클릭합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 논문에 기재된 기술은 극저온 사형 전자 현미경으로 잘 보존 고압 동결 식물 조직의 컨텍스트 내에서 동결 파쇄 막의 조사를 허용한다. 이러한 절차를 사용하는 주요 장점은 시료 준비 순전히 물리적 점이다; 화학 물질이나 탈수를 포함하는 어떤 단계가 필요하지 않습니다. 따라서, 거의 원시 상태 26,32에서 생물학적 구조를 연구 할 수 있습니다. 잎 조직을 사용하는 장점은 하나의 엽록체 내, 즉 그 나라의 생리 컨텍스트 내 전체 세포 조직에 관한 정보뿐만 아니라, 틸라코이드 막으로서 연구 특정 막을 얻을 수 있다는 점이다. C. 연구에 필수적 또 다른 장점은, 다른 상대 수분 함량 (RWC)에 pumilum 식물들은 그들의 수화 상태는 제조 동안 변경되지 않는다는 것이다. 이것은 출발 원료로서 단리 또는 엽록체 틸라코이드 막이 이용 대향로동결 파괴 실험. 후자에서, 하나는 어떤 구조적 및 / 또는 초분자의 변경 가능성 소기관 / 막 분리 중에 일어나는 것을 고려...

산소를 광합성, 고대 시아 노 박테리아에서 원래는 엽록체 세포 기관의 개발을 주도 endosymbiotic 이벤트에 의해 조류와 육상 식물에 의해 계승되었다. 모든 현대 산소를 광 영양 생물에서 광합성 전자 수송 및 양성자 동기 힘의 생성과 환원력은 &#39;틸라코이드&#39;막이라고 평평 주머니 같은 소포 내에서 수행된다. 이러한 막은 광합성 광 구동 반응을 수행 및 에너지 전달을위한 매체를 제공하는 단백질 복합체를 집. 식물과 (일부) 조류의 틸라코이드 막은 두 가지 형태 도메인으로 구분됩니다 : &#39;기질 라멜라&#39;라는 &#39;그라나&#39;와 그라나을 상호 언 스택 막이라고 단단히 appressed 막 지역 1. 식물과 조류 틸라코이드 막의 다양한 동결 골절 연구는 1970 년대 초반부터 진행되고있다. 때 동결 골절, 막세포 구획에 따라 한 exoplasmic 얼굴 (EF)와 원형질 얼굴 (PF)를 생성, 자신의 소수성 코어 (2)에 따라 분할되는 반 막 테두리, 원래 Branton 등에 의해 화폐로 주조있다. . 각각의 &#39;와&#39;U &#39;나타내는&#39;누적 &#39;과&#39;언 스택 &#39;막 지역으로, EFS, EFU, PF에와 PFU : 1975 년 3 식물과 조류 틸라코이드 네 가지 골절면이있다. 분할 또는 파손되지 않은 막 단백질 복합체, 전자 또는 멤브레인의 P의 양쪽으로 유지하는 경향이있다. 틸라코이드의 다른 골절면이 서로 다른 크기의 입자 밀도 (4), 다음에 많은 연구를 포함하는 초기의 관찰은 광 반응을 수행 관찰 된 입자와 세포막 단백질 복합체 사이의 식별과 상관되었다 5-13 (참조 또한 14, 15 리뷰). FRE틸라코이드 막 랑 골절 실험은 일반적으로 분리 절차를 수행하는 동안 발생할 수있는 구조 및 / 또는 초분자 조직의 모든 변화의 위험, (그러나 16, ​​17 참조) 엽록체 또는 격리 된 틸라코이드 막 준비에 수행된다. 파쇄 후에, 레플리카들은 다음의 탄소 (C)의 두꺼운 층으로 백금 / 탄소 백금 (Pt / C)의 증발에 의해 제조되고, 생체 물질 (18)의 마지막으로 소화. 복제본은 투과형 전자 현미경 (TEM)에 의해 가시화된다. 기존의 동결 골절 - 복제 기술은 다른에 초분자 광합성 막의 조직 및 적응 연구를위한 중요한 도구, 예를 들어 역할을하고 있습니다., 빛, 조건 19-23. Craterostigma 24 pumilum homoiochlorophyllous 부활 식물의 우리의 최근의 연구에서 우리는 초분자 조직 오의 변화를 조사하는 것을 목표로탈수 및 재수 동안 F 틸라코이드 막뿐만 아니라 전반적인 세​​포 조직. homoiochlorophyllous 부활 종의 고유성은 자신의 광합성 장치를 유지하면서, 자신의 식물 조직 (잎)에서 탈수의 조건 살아남을 수 있다는 것입니다. 물을 사용할 수있게되면,이 식물은 복구하고 몇 일 25 시간 내에 광합성 활동을 다시 시작합니다. 이 연구를 위해 동결 파쇄 판 시료의 극저온 주사 EM (SEM) 이미지는 고압 샘플 크라이 고정화 냉동실과 결합시켰다. 이러한 절차는 기본 상태 (26)에 가까운 상태에서 냉동 수화 생물학적 시료를 시각화하기위한 수단을 제공한다. 하나의 주요 장점은 샘플이없는 연속적인 단계를 동결 골절 및 코팅 후 직접 조사하는 것입니다. 자신의 수화 상태가 준비하는 동안 유지되는이 다른 상대 수분 함량 (RWC)에서 식물의 조사에 특히 관련이있다. 방법지금까지 하나의 중요한 단점은 광합성 단지의 크기의 정확한 측정에 필요한 높은 배율에서 스캔 할 때 냉동 - 수화 샘플 특히, 영상 중에 빔 손상으로 고통 수 있다는 것이다. 이것을 극복하기 위해서, 방법은 &quot;이중층 코팅 &#39;(DLC) 특정 극저온 SEM 촬상 조건을 사용 하였다 결합 27,28했다. 이들은 훨씬 적은 빔 구분 샘플 결과 및 광합성 단백질 초분자 조직과 부활의 식물 C.의 다른 세포 성분에 대한 가치있는 정보의 해명에 대해 허용 현장에서 높은 배율에서 pumilum.

<table><tbody><tr><td>에탄올 abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-헥사데센</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0.1/0.2 혈소판</td><td>엔지니어링 오피스 M. Wohlwend GmbH, 스위스</td><td>241</td><td>혈소판은 직경 3mm, 두께 0.5mm(A형)이며 0.1/0.2mm 깊이의 공동(직경 2mm)이 있습니다. 유사한 혈소판을 Leica Microsystems에서 얻을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>고정밀 등급 핀셋</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72706-01</td><td>Dumont (스위스) Durostar 스타일 #5 핀셋; 다른 고정밀 핀셋으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>고압 냉동 기계</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>고압 냉동 대안: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC 뵈켈러; 3. EM PACT2, 라이카 마이크로시스템즈; 4. EM HPM 100, 라이카 마이크로시스템즈; 5. EM ICE, 라이카 마이크로시스템즈.</td></tr><tr><td>동결 파괴 시스템</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>극저온 준비 로딩 스테이지</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>단일 동결 파괴용 시편 홀더</td><td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>직경 3mm의 시편 캐리어용 클램프 홀더</td></tr><tr><td>진공 극저온 이송 셔틀</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SEM 스테이지</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>이미지 수집 소프트웨어</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Fiji/Image J, National Institute of Health</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

동결 시료의 파단 크라이 주사 전자 현미경 (SEM)의 근처 기본 조건에서 생물학적 구조를 조사 할 수있다. 여기, 우리는 잎 샘플에서 광합성 (틸라코이드) 막의 초분자 조직을 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이는 고압 잎 조직의 동결, 동결 파쇄, 이중층 코팅 최종적 극저온 SEM 촬영에 의해 달성된다. 이중 층 코팅 방법의 사용은 고배율 취득 수 (&gt; 100,000X) 냉동 수화 샘플 최소 빔의 손상뿐만 아니라, 최소한의 충전 효과 이미지. 설명 된 절차를 사용하여 우리는 현장에서, 부활 공장 Craterostigma의 pumilum의 탈수시 발생하는 광계 빛 수확 안테나 단백질 복합체의 초분자 분포의 변화를 조사 하였다.

도 1은 고압 동결, 동결 파쇄 Craterostigma pumilum 잎 조각을 포함 혈소판 극저온 SEM 이미지를 나타낸다. 일부 샘플에서 골절 세포의 큰 영역 (그림 1A)를 얻을 수있다. 다른 사람에, 잎 조각은 단단히 상부 디스크에 결합 된 상태를 유지하고 그것으로 (그림 1B)를 따라 참패를 당하고있다. 그러나, 두 번째 경우에서, 일부 잎 조직 여전히 잎 &quot;찌꺼기&quot;묘화에 의해 수집 될 수있는 산화철 (도 1b, 화살촉) 및 데이터의 상당한 양의 칼날 홈에 부착 된 상태로있다가 골절 하였다 제공. 성공적인 골절이 발견되면, 세포의 저배율 사진이 경우 엽록체 (도 2)에 대한 관심 지역을 식별하기 위해 취득된다. <p class="jove_content" fo:keep-...

여기에서는 동결 파괴 식물 조직을 연구하는 절차를 설명합니다. 고압 동결 잎 샘플은 동결 파쇄 및 이중층 코팅되어 빔 손상을 최소화하면서 고배율에서 극저온 주사 전자 현미경을 사용하여 이미지화되는 잘 보존된 동결 수화 샘플을 생성합니다.

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

이 기술의 전반적인 목적은 동결-파쇄된 잎 조직 시료의 저온 주사 전자 현미경 분석을 통해 광합성 막의 초분자 구조 조직을 연구하는 것입니다. 이 방법은 세포와 소기관의 형태학적 특성 분석, 막 내장 단백질 복합체의 분포, 그리고 생광물질의 위치 확인과 같은 세포 생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 잎 조직에 대해 동결-파쇄를 수행하므로, 틸라코이드 막의 초분자 구조 조직을 천연 소기관 및 세포 환경 내에서 조사할 수 있다는 점입니다.본 방법은 여기서 생물학적 시료를 대상으로 시연되었으나, 젤, 폴리머 및 약물 전달 시스템과 같은 대상에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이러한 절차에 익숙하지 않은 사용자는 모든 시료가 잘 동결되거나 적절하게 파쇄되지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 고압 동결법을 통해 잎 조직의 초저온 고정(cryofixation)을 수행하려면, 먼저 면도날 끝을 사용하여 0.1~0.2mm 알루미늄 플레이트의 0.1mm 공동(cavity) 바닥을 긁어내십시오.6개 샘플을 위해 최소 12개의 혈소판을 준비합니다. 그런 다음 절대 에탄올을 사용하여 혈소판을 세척하고 깨끗한 디시에 보관합니다. 고압 동결기를 준비한 후, 샘플 박스를 액체 질소로 채웁니다.면도날을 사용하여 식물에서 잎의 작은 조각을 잘라내고, 핀셋을 이용해 헥사데칸(hexadecane)이 절반 정도 채워진 마이크로원심분리 튜브 안에 조직을 넣습니다. 잎 조직의 세포 간극에 침투시키기 위해, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비한 침투 장치의 팁을 마이크로원심분리 튜브 뚜껑의 구멍에 삽입하고, 플런저를 당겨 진공 상태를 만듭니다. 약 30초 후, 플런저를 놓습니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 튜브에서 잎 조각을 꺼냅니다. 면도날을 사용하여 플레이틀에 들어갈 수 있을 만큼 작은 조각으로 자릅니다. 필요한 경우, 잎의 두께가 0.2 millimeters 미만이 되도록 다듬습니다.조직의 붕괴를 방지하기 위해, 고압 동결 전 잎에 액체를 침투시킵니다. 유리화된 시료를 얻을 가능성을 최대화하기 위해 시료의 두께는 200 microns 미만으로 유지합니다. 깨끗한 플레이틀릿의 긁힌 면이 위로 향하도록 동결기 홀더에 배치합니다.그 다음, 절단한 잎 조각을 플레이트에 넣습니다. 다른 플레이트를 사용하여 잎 쪽을 향해 긁힌 면이 닿도록 덮어 샌드위치 구조를 만들기 전, 헥사데칸을 사용하여 플레이트의 남은 공간을 채웁니다. 홀더를 닫고 조여 줍니다.제트 버튼을 눌러 시료를 급속 동결합니다. 그런 다음 홀더를 즉시 액체 질소로 옮깁니다. 예냉된 핀셋을 사용하여 샌드위치가 파손되지 않도록 주의하며 홀더에서 분리합니다.해당 절차에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 하나는 무작위로 진행되어 cryo-SEM에서만 성공 여부를 평가할 수 있는 동결 파쇄(freeze-fracture)이며, 다른 하나는 빔 손상을 최소화하면서 고배율 이미지를 얻기 위해 필요한 이중층 코팅입니다. 제조업체의 지침에 따라 동결 파쇄 장치를 준비하고 프로그래밍할 때, 백금 탄소(Pt/C) 건은 45도로, 탄소 건은 90도로 설정하십시오. 동결 파쇄 시스템의 스테이지를 -140°C 또는 -160°C로 냉각하십시오.그 다음 진공 냉동 전송 셔틀을 장비에 부착하고 액체 질소를 사용하여 셔틀 챔버를 채웁니다. 동결 파쇄 시편 홀더를 로딩 스테이션에 삽입하고, 액체 질소로 로딩 스테이션 챔버를 가득 채웁니다. 다음으로, 고정밀 핀셋을 사용하여 동결 샌드위치를 홀더에 로드하고 단단히 고정합니다.그 다음 홀더를 뒤집어 샌드위치가 제대로 고정되었는지 확인하고, 두 번째 샌드위치에 대해서도 동일하게 반복합니다. 냉각된 셔틀을 동결 파쇄기에서 분리하여 로딩 스테이션에 연결합니다. 이어서 셔틀 밸브를 열고 리트랙팅 암(retracting arm)을 홀더에 삽입하여 고정한 후, 홀더가 장착된 암을 다시 셔틀 내부로 넣습니다.셔틀을 동결 파쇄기에 다시 부착한 후, 리트랙팅 암(retracting arm)을 사용하여 홀더를 챔버 안으로 넣습니다. 이제 동결 파쇄 마이크로톰 칼의 높이를 조절하여 샌드위치의 상단 플레이트가 떨어져 나가도록 정렬합니다. 마이크로톰 칼을 이용해 샌드위치를 빠르게 파쇄합니다.그런 다음, 칼에 붙어 있는 파편으로 인해 시료가 오염되는 것을 방지하기 위해 즉시 칼을 들어 올립니다. 챔버 내의 물 분자로 인해 시료가 오염될 가능성을 차단하기 위해, 냉각된 셔터를 새로 노출된 평면 위에 배치하십시오. 다음으로, 시료에 백금 코팅을 하기 위해 Setup을 눌러 화면에 Layer 1이 표시되도록 합니다.그 다음 GUN 1 버튼을 누른 후 ON 버튼을 눌러 Pt/C 건을 켭니다. 증착 속도를 확인하고, 속도가 0.02~0.04 nm/s에 도달하면 Measure 버튼을 눌러 샘플을 동시에 노출시키면서 증착층의 두께를 모니터링합니다. 카본을 코팅하려면 GUN 2를 선택한 후 ON 버튼을 누릅니다.증착 속도가 약 0.1 nanometers per second가 되면, Measure 버튼을 누름과 동시에 셔터를 이동시켜 시료를 노출시킵니다. 코팅이 완료되면 스테이지 온도를 -120 °C까지 올립니다. 주사전자현미경을 저온 작업 준비 상태로 만들기 위해, 메인 메뉴에서 Stage, Stage Initialize를 차례로 선택하고 확인을 누릅니다.Vacuum 탭에서 Vent 버튼을 클릭하여 현미경 챔버를 벤트합니다. 그런 다음 Tools, Goto Panel을 선택하고 Stage Points List 패널을 엽니다. 샘플 홀더를 받기 위해 스테이지를 적절한 좌표로 이동시키려면 CRYO EXCHANGE 위치를 선택하십시오.깨끗한 장갑을 착용한 상태에서 시료 챔버를 열고 크라이오스테이지를 현미경의 메인 스테이지에 장착합니다. 챔버를 닫고 Vacuum 탭에서 Pump 버튼을 클릭합니다. 다음으로, 현미경 듀어에 액체 질소를 채워 현미경을 냉각합니다.스테이지의 온도가 -120 °C 아래로 떨어지면, cryo transfer unit의 가열 기능을 활성화하여 스테이지 온도를 -120 °C까지 올립니다. 이제 cryo transfer shuttle을 현미경에 부착하고, 리트랙팅 암(retracting arm)을 사용하여 샘플 홀더를 현미경 cryo 스테이지로 이동시킵니다. 조이스틱을 사용하여 시편 홀더를 대물렌즈 가까이 조심스럽게 이동시킵니다.Apertures 탭에서 10-micron aperture를 선택합니다. 그런 다음 Gun 탭의 EHT Target 필드를 더블 클릭하고, EHT target에 10 kilovolts를 입력한 후 OK를 클릭합니다. 이어서 가속 전압을 켜기 위해 하단의 EHT 탭을 클릭하고 EHT On을 선택합니다. Detectors 탭의 드롭다운 목록에서 InLens를 선택합니다. 그다음 Scanning 탭을 클릭하여 빔 손상을 최소화하기 위한 고속 스캔인 스캔 속도 1과 저장 해상도 1024 by 768 pixels를 선택합니다.노이즈 감소(Noise Reduction) 드롭다운 목록에서 라인 평균(Line Average)을 선택하고, 탐색을 위해 n 값을 20~30라인으로 조정합니다. 그런 다음, 키보드의 Control 키와 Tab 키를 클릭하여 중심점 기능을 사용해 샘플을 관심 영역으로 이동시키는 동시에 배율을 높여 세포가 파괴된 영역을 식별합니다. 세포가 파괴된 영역을 확인한 후, 배율을 높인 상태로 샘플을 스캔하여 파괴된 엽록체를 찾습니다.그 다음, 노이즈 감소를 위해 라인 평균 n 값을 100보다 크게 변경합니다. Scanning 탭에서 Freeze를 눌러 스캔을 중지합니다. 키보드에서 Control Shift Tab을 눌러 중심 기능(center-feature function)을 사용하여 관심 있는 엽록체-파단면을 확대하고, 이전과 동일한 파라미터를 사용하여 고배율 이미지를 획득합니다.마지막으로, Save TIFF 버튼을 눌러 이미지를 저장하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 이미지 분석을 수행합니다. 이 그림은 파쇄된 세포 영역이 넓게 나타난 고압 동결 및 동결 파쇄된 Craterostigma Pumilum 잎 조각이 포함된 혈소판의 cryo-SEM 이미지를 보여줍니다.이 예시에서는 잎 조각이 소실되었으나, 일부 잎 조직이 플레이틀릿(platelet)의 나이프 홈에 부착된 채로 남아 있습니다. 성공적인 파쇄면을 찾은 후, 파쇄된 엽록체와 같은 관심 영역을 식별하기 위해 세포의 저배율 이미지를 획득합니다. 이후 단일 파쇄 엽록체의 이미지를 획득하여 틸라코이드 막의 파쇄면을 식별합니다.이 예시에는 C.Pumilum 잎의 틸라코이드 막을 고배율로 촬영한 이미지가 나와 있습니다. 네 가지 서로 다른 파단면을 구분할 수 있습니다. 적층 및 비적층 막의 엑소플라스믹 파단면(각각 EFs 및 EFu), 그리고 적층 및 비적층 막의 프로토플라스믹 파단면(각각 PFs 및 PFu)입니다.광계 II(Photosystem II) 또는 PS2는 적층된 그라나 막 영역인 EF와 스트로마 틸라코이드 막 영역인 EFu 모두에 위치합니다. 수분을 함유한 상태에서 PS2의 밀도는 EF가 EFu보다 약 3배 더 높으며, 이는 두 면을 구분 짓는 특징이 됩니다. C. pumilum의 탈수 과정 동안 EF 내 PS2의 밀도는 점진적으로 감소하여, 수분 함유 상태 밀도의 약 절반 수준에 도달합니다.특히, 상대 수분 함량이 5에서 10%까지 추가로 탈수되면, PS2 복합체는 열과 배열 형태로 조직됩니다. 동결 파쇄 복제 기술의 발전은 막 단백질 복합체의 크기와 생체막 내 배치를 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 동결 파쇄와 cryo-SEM의 고압 동결을 결합하면 조직 및 세포 수준부터 거대 분자 수준에 이르기까지 다양한 종류의 시료를 거의 천연 상태의 여러 크기 척도에서 조사할 수 있습니다.여기에 제시된 기술 외에도, 에너지가 분산된 X선 분광법(Energy-Dispersive x-ray Spectroscopy, EDS)과 같은 방법들을 cryo-SEM에 적용할 수 있으며, 예를 들어 알칼리화된 생체 광물 분석 등에 활용할 수 있습니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

기본 기술과 투과 전자 현미경에 의한 검사에 대한 생물 표본 및 나노 물질의 동결 골절 처리의 개선이 설명되어 있습니다. 이 기술은 미세 기능과 생체막의 전문을 공개 및 재료 과학 및 나노 기술 제품에 미세 수준의 차원과 공간 데이터를 얻기위한 바람직한 방법이다.

생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

고품질 투과 전자 현미경 이미지를 얻는 것은 특히 물이 채워진 큰 액포와 폭기 공간이 풍부한 식물 세포의 경우 어렵습니다. 직렬 고압 동결 및 급속 동결 대체는 TEM을 위한 식물 샘플의 준비 시간을 크게 단축하는 동시에 탁월한 초구조 보존력을 가진 샘플을 생성합니다.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

이 논문은 거의 네이티브 상태의 거대분자의 고품질 현미경 이미지를 얻는 데 사용되는 초저온 전자 현미경 검사 방법론에 대해 설명합니다. 이 방법은 거대분자의 3D 재구성을 생성하기 위해 고안된 단일 입자 접근 방식을 사용하여 추가 컴퓨터 처리에 적합한 이미지를 생성합니다.

거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 동기 재배, 형광 현미경 검사 법, 급속 한, 및 높은 모니터링 전압 cryo 전자 단층 촬영 사용 됩니다. 이러한 방법론에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 미래의 응용 프로그램 및 개발 논의.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

xylem 내의 물 분포를 관찰하면 우디 식물의 물 흐름 역학에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 이 연구에서는 시료 준비 중 물 상태의 실제 적 변화를 제거하는 저온 유지 및 저온 SEM을 사용하여 현장에서 자일렘 물 분포를 관찰하는 실용적인 접근 법을 보여줍니다.

극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

집속 이온빔 밀링을 사용하여 극저온 전자 단층 촬영을 위한 급락 동결 생물학적 샘플에서 유리질 그리드 상의 라멜라를 생성합니다.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

학습하세요 동결 골절 기법과 저온 주사 전자 현미경을 이용하여 식물 잎 조직의 광합성 막 초분자 구조를 연구하는 방법을. 이 기술은 틸라코이드 막 단백질 복합체 분포와 생물광물질 위치를 규명하는 데 활용됩니다.

알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부

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