알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부

이 기술의 전반적인 목표는 동결 파쇄된 잎 조직 샘플의 극저온 주사 전자 현미경을 사용하여 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 연구하는 것입니다. 이 방법은 세포 및 세포 소기관의 형태학적 특성화, 막 일체형 단백질 복합체의 분포, 생체 광물의 국소화와 같은 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 잎 조직에서 동결 파괴가 수행되므로 틸라코이드 막 초분자 기관화가 천연 세포 기관 및 세포 맥락에서 조사된다는 것입니다.

이 방법은 여기에서 생물학적 샘플에 대해 시연되지만 젤, 폴리머 및 약물 전달 시스템과 같은 분야에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이러한 절차를 처음 접하는 개인은 모든 샘플이 잘 동결되거나 적절하게 파괴되는 것은 아니라는 점을 알고 있어야 합니다. 고압 동결로 잎 조직을 동결 고정하려면 먼저 면도날의 모서리를 사용하여 0.1-0.2mm 알루미늄 혈소판의 0.1mm 구멍 바닥을 긁습니다.

6개의 샘플에 대해 최소 12개의 혈소판을 준비합니다. 그런 다음 무수 에탄올을 사용하여 혈소판을 씻고 깨끗한 접시에 보관하십시오. 고압 냉동기를 준비한 후 샘플 상자에 액체 질소를 채웁니다.

면도날로 식물에서 작은 잎 조각을 자르고 핀셋을 사용하여 헥사데칸 1개로 반쯤 채워진 마이크로 원심분리기 튜브 안에 조직을 넣습니다. 잎 조직의 세포간 공간에 침투하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비된 침투 장치의 끝을 마이크로 원심분리기 튜브의 뚜껑에 있는 구멍에 삽입하고 플런저를 당겨 진공을 만듭니다. 약 30초 후에 플런저를 놓습니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 튜브에서 잎 조각을 제거합니다. 면도날을 사용하여 혈소판에 들어갈 만큼 작은 조각을 자릅니다. 그리고 필요한 경우 잎을 0.2mm 미만의 두께로 자릅니다.

조직 붕괴를 방지하기 위해 고압이 얼기 전에 잎에 액체가 침투합니다. 유리화된 샘플을 얻을 수 있는 기회를 극대화하기 위해 샘플 두께를 200미크론 미만으로 유지합니다. 긁힌 면이 위로 향하도록 깨끗한 혈소판을 냉동기 홀더에 넣습니다.

그런 다음 자른 잎 조각을 혈소판에 넣습니다. 하나의 헥사데칸을 사용하여 혈소판의 남은 공간을 채우고 긁힌 자국이 잎을 향하도록 다른 혈소판을 사용하여 샌드위치를 닫습니다. 홀더를 닫고 조입니다.

제트 버튼을 눌러 샘플을 동결합니다. 그런 다음 홀더를 액체 질소로 빠르게 옮깁니다. 미리 식힌 핀셋을 사용하여 샌드위치가 깨지지 않도록 주의하면서 홀더에서 샌드위치를 제거합니다.

절차에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다: 동결-파괴는 무작위 프로세스이며 그 성공 여부는 빔 손상을 최소화하면서 고배율 이미지를 얻는 데 필요한 cryo-SEM 및 이중층 코팅에서만 평가할 수 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 동결 파괴 기계를 준비하고 프로그래밍하는 동안 백금 탄소 또는 Pt/C 건을 45도, 탄소 건을 90도에 놓습니다. 동결 파괴 시스템 스테이지를 섭씨 영하 140도 또는 영하 160도로 냉각합니다.

그런 다음 진공 극저온 이송 셔틀을 기계에 부착하고 액체 질소를 사용하여 셔틀 챔버를 채웁니다. 동결 파쇄 시편 홀더를 적재 스테이션에 삽입하고 액체 질소로 로딩 스테이션 챔버를 범람시킵니다. 그런 다음 고정밀 등급의 핀셋을 사용하여 냉동 샌드위치를 홀더에 넣고 제자리에 조입니다.

그런 다음 홀더를 뒤집어 샌드위치가 제자리에 고정되었는지 확인하고 두 번째 샌드위치에 대해 반복합니다. 동결 파괴 기계에서 냉각된 셔틀을 분리하고 적재 스테이션에 연결합니다. 그런 다음 셔틀 밸브를 열고 수축 암을 홀더에 삽입하고 제자리에 잠근 다음 홀더가 있는 암을 셔틀에 다시 삽입합니다.

셔틀을 동결 파괴 기계에 다시 부착한 후 수축 암을 사용하여 홀더를 챔버에 삽입합니다. 이제 동결 파괴 마이크로톰 나이프를 샌드위치의 상단 혈소판을 두드리는 높이에 맞춥니다. 마이크로톰 나이프로 샌드위치를 빠르게 부수십시오.

그런 다음 즉시 칼을 들어 올려 칼에 달라붙는 파편으로 인한 샘플의 오염을 방지하십시오. 새로 노출된 평면 위에 냉각된 셔터를 배치하여 챔버 내의 물 분자에 의한 오염 가능성으로부터 샘플을 보호합니다. 다음으로, 샘플을 백금으로 코팅하려면 Setup(설정)을 눌러 화면에 Layer 1(레이어 1)을 표시합니다.

그런 다음 GUN 1 버튼을 누른 다음 ON 버튼을 눌러 Pt/C 건을 켭니다. 증발 속도를 조사하고 초당 0.02-0.04나노미터에 도달하면 측정 버튼을 눌러 증착된 층의 두께를 모니터링하면서 동시에 샘플을 노출시킵니다. 카본으로 코팅하려면 GUN 2를 선택한 다음 ON 버튼을 선택합니다.

증발 속도가 초당 약 0.1나노미터가 되면 측정 버튼을 누르고 동시에 셔터를 움직여 샘플을 노출시킵니다. 코팅이 완료되면 스테이지를 섭씨 영하 120도까지 예열합니다. 극저온 작업을 위해 주사 전자 현미경을 준비하려면 메인 메뉴에서 Stage, Stage Initialize 및 confirm을 선택합니다.

Vacuum(진공) 탭에서 Vent(환기구) 버튼을 클릭하여 현미경 챔버를 환기시킵니다. 그런 다음 도구, Goto Panel을 선택하고 스테이지 포인트 목록 패널을 엽니다. CRYO EXCHANGE 위치를 선택하여 스테이지를 샘플 홀더를 수용할 수 있는 적절한 좌표로 이동합니다.

깨끗한 장갑을 낀 상태에서 검체 챔버를 열고 cryostage를 현미경의 메인 스테이지에 삽입합니다. 챔버를 닫고 Vacuum(진공) 탭에서 Pump(펌프) 버튼을 클릭합니다. 다음으로, 현미경 듀어에 액체 질소를 채워 현미경을 냉각합니다.

스테이지의 온도가 섭씨 영하 120도 이하로 떨어지면 극저온 전사 장치의 열 기능을 활성화하여 스테이지를 섭씨 영하 120도까지 예열합니다. 이제 극저온 이송 셔틀을 현미경에 부착하고 후퇴 암을 사용하여 시료 홀더를 현미경 극저온 스테이지로 옮깁니다. 조이스틱을 사용하여 표본 홀더를 대물 렌즈 가까이로 조심스럽게 이동합니다.

조리개 탭에서 10미크론 조리개를 선택합니다. 그런 다음 Gun 탭에서 EHT Target 필드를 두 번 클릭하고 EHT Target에 10kW를 입력한 다음 OK를 클릭합니다. 그런 다음 가속 전압을 켜려면 하단 EHT 탭을 클릭하고 EHT를 선택한 On.In Detectors 탭에서 드롭다운 목록에서 InLens를 선택합니다. 그런 다음 스캔 탭을 클릭하고 빔 손상을 최소화하기 위한 빠른 스캔인 1과 동일한 스캔 속도와 1024 x 768 픽셀의 저장 해상도를 선택합니다.

노이즈 감소 드롭다운 목록에서 라인 평균을 선택하고 검색을 위해 n의 값을 20에서 30라인으로 조정합니다. 그런 다음 키보드에서 Control 키와 Tab 키를 클릭하여 centerpoint 기능을 사용하여 샘플을 관심 영역으로 이동하는 동시에 확대하여 파쇄된 세포가 있는 영역을 식별할 수 있습니다. 파쇄된 세포가 있는 영역을 확인한 후 확대하면서 샘플을 스캔하여 파쇄된 엽록체를 찾습니다.

그런 다음 노이즈 감소를 위해 라인 평균 n 값을 100보다 크게 변경합니다. Scanning(스캔) 탭에서 Freeze(고정)를 눌러 스캔을 중지합니다. 키보드에서 Control Shift Tab을 누르면 중앙 기능 기능을 사용하여 흥미로운 엽록체 파괴 면을 확대할 수 있습니다. 그리고 고배율 이미지는 이전과 동일한 매개변수를 사용하여 획득됩니다.

마지막으로 TIFF 저장 버튼을 눌러 이미지를 저장합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미지 분석을 수행합니다. 이 그림은 골절된 세포의 넓은 영역이 있는 고압 동결 파쇄 Craterostigma Pumilum 잎 조각을 포함하는 혈소판의 cryo-SEM 이미지를 보여줍니다.

이 예에서는 나뭇잎 조각이 없습니다. 그러나 일부 잎 조직은 혈소판의 칼 홈에 붙어 남아 있었습니다. 성공적인 파괴가 발견되면 세포의 저배율 이미지를 획득하여 골절된 엽록체와 같은 관심 영역을 식별합니다. 틸라코이드 막 파괴 면을 식별하기 위해 단일 골절 엽록체의 이미지를 획득합니다.

이 예에서 볼 수 있는 것은 C.Pumilum 잎에 있는 틸라코이드 막의 고배율 이미지입니다. 4개의 서로 다른 파괴면을 구별할 수 있습니다. 적층 및 적층되지 않은 막의 외플라질 파괴면, 각각 EF 및 EFu, 적층 및 쌓이지 않은 막의 원형질 면, 각각 PF 및 PFu.

Photosystem II 또는 PS2는 EFs 적층 grana 막 영역과 EFu stromalamellar 막 영역 모두에 있습니다. 수화되었을 때 PS2 밀도는 EFu보다 EF에서 약 3배 더 높으며, 이는 두 면을 구별합니다. C.Pumilum이 탈수되는 동안 EF의 PS2 밀도는 점차 감소하여 수화 조건에서 밀도의 약 절반에 도달합니다.

특히, 수분 함량이 5%에서 10%까지 더 탈수되면 PS2 복합체가 행과 배열로 구성됩니다. 동결 파괴 복제 기술의 개발은 막 단백질 복합체의 크기와 생물학적 막 내 배열을 연구하기 위한 길을 열었습니다. cryo-SEM에서 동결 파괴와 고압 동결의 결합을 통해 조직 및 세포 수준에서 거의 네이티브 상태의 고분자 수준에 이르기까지 여러 크기 규모에서 다양한 종류의 샘플을 조사할 수 있습니다.

여기에 표시된 기술 외에도 에너지 분산 X선 분광법, EDS와 같은 방법도 cryo-SEM에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 바이오 미네랄을 알칼리화하기 위해.