고대 생물 커뮤니티 숨겨 내부를 조사하기 위해 냉동 코어의 바깥 부분에서 외인성 물질의 제거

빙권은 과거의 환경 조건 하에서 생존했던 보존된 생물체에 접근할 수 있는 기회를 제공합니다. 본 절차의 전반적인 목표는 빙하 코어에서 외래 물질을 성공적으로 수집하고 제거함으로써 숨겨진 다양성을 밝혀내는 것입니다. 이 방법은 빙하 얼음과 영구 동토층에서 회수된 생물체를 식별함으로써 특정 시대에 관한 가치 있는 역사적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

오염 물질 유입 가능성이 높기 때문에 현장에서 무균 코어를 수집하는 것은 매우 어렵습니다. 따라서 이 기술의 주요 장점은 통제된 실험실 환경에서 오염 물질 제거가 이루어진다는 점입니다. 긁어내기 및 오염 제거 단계는 학습하기 까다로울 수 있으므로, 이 프로토콜의 시각적 시연이 매우 중요합니다.

이 작업은 실제로 두 사람이 함께 해야 하므로, 특히 많은 인내심과 팀워크가 필요합니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 두 지원 과학자인 Karen Foley와 Robert Jones가 맡아 진행하겠습니다. 이 프로토콜은 세심한 청결 유지가 필수적입니다.

450°C로 설정된 오븐을 사용하여 다음 항목들을 4시간 동안 굽습니다: 멸균된 핵산 제거 금속 랙, 유리 기구, 금속 핀셋 및 유리솜. 재오염을 방지하기 위해 두꺼운 호일로 감싸서 사용하십시오.

다음으로, 0.22 micron 필터를 사용하여 85% ethanol과 초순수를 여과 멸균합니다. 이 액체들은 4°C 이하로 유지되어야 하며, 그렇지 않으면 샘플에 균열이 생겨 오염되기 쉬워집니다. ethanol은 -20°C에서 보관하십시오.

그리고 물을 4°C에서 보관하십시오. 그런 다음, 플라스틱 자를 70% ethanol로 멸균하고, 이어서 DNA 제염 용액과 RNase 제염 용액으로 처리하십시오. 각 용액을 도포한 직후 즉시 닦아내십시오.

그런 다음 자를 멸균된 핵산 제거 Whirl-Pak 백에 보관하십시오. 다음으로, 먼저 내부의 벽, 바닥 및 금속 작업대를 1% bleach로 닦아 냉동실 공간을 준비합니다. 그 후 실내 온도를 약 -11 °C로 설정하십시오.

준비가 완료되면, 실험실이나 시료의 오염 가능성을 줄이기 위해 저온실에 들어갈 때 가벼운 작업복, 니트릴 장갑 및 마스크를 착용하십시오. 이 절차는 두 사람이 협력하여 수행해야 합니다. 재오염의 기회가 많기 때문에 이 과정이 까다로울 수 있습니다.

성공적인 실험을 위해, 서로를 모니터링하고 소통하며 장갑을 자주 교체합니다. 모든 준비가 완료되면, 멸균된 재료와 샘플을 저온실로 옮겨 표백제로 세척한 테이블 위에 준비합니다. 여기에는 미리 준비된 S.marcescens 배양액이 포함됩니다.

먼저 준비된 알루미늄 호일 시트 위에 영구동토층 코어를 놓습니다. 다음으로, 멸균 폼 플러그를 사용하여 희석된 S.marcescens 배양액을 코어 외부에 가볍게 접종합니다. 그런 다음, 트레이 위의 멸균 금속 랙에 코어를 설치합니다.

이제, 강철 마이크로톰 칼날을 70% ethanol, DNA 오염 제거 용액 및 RNase 오염 제거 용액으로 멸균 닦아냅니다. 다음으로, 연구자 A는 동일한 방식으로 니트릴 장갑을 세척합니다. 그런 다음 A는 트레이 위에서 코어를 45도 각도로 잡습니다.

A가 각 긁어내기 단계마다 코어를 회전시키는 동안, B는 멸균된 칼날을 사용하여 양 끝부분을 포함한 전체 코어 외벽에서 약 5mm를 부드럽게 긁어냅니다. 필요에 따라 칼날을 세 가지 용액으로 다시 세척해야 합니다. 다음으로, A가 코어를 회전시키는 동안 B는 여과 멸균된 95% ethanol을 코어 위에 빠르고 조심스럽게 붓습니다.

그 다음, 코어를 물로 빠르게 헹굽니다. 트레이 위의 금속 랙을 교체하고, 코어를 새 랙 위에 올립니다. 연구원은 니트릴 장갑을 세척한 후, 트레이 위의 깨끗한 랙에 코어를 놓습니다.

그동안 B는 코어 전체에 DNA 제염 용액을 분사한 후, 필터 멸균수로 헹굽니다. 다음으로, B는 코어 전체에 RNase 제염 용액을 분사하고 다시 한번 물로 헹굽니다. 마지막으로, 코어를 멸균 Whirl-Pak 백에 넣습니다.

층류 층류 작업대(bio hood) 내의 유리 접시 위에 금속 랙을 놓는 것으로 시작하십시오. 그다음 금속 랙 위에 코어를 올립니다. 약 10분 동안 코어 외면의 2~5 mm가 해동되도록 둡니다.

이 시간 동안 2분마다 코어를 90도씩 회전시킵니다. 해동 후, 핀셋으로 유리솜을 집어 코어의 표면 전체를 닦아내어 박테리아를 수집합니다. 그런 다음, 해당 유리솜을 사용하여 두 개의 플레이트에 접종합니다.

다음으로, 자를 사용하여 코어의 외부 치수를 측정하되 코어에 직접 닿지 않도록 주의하십시오. 또한, 코어 외부에 도포하는 데 사용했던 원래 배양액을 사용하여 추가로 2개의 플레이트에 접종함으로써 접종액의 생존 여부를 확인하십시오. 그 후, 코어를 커다란 멸균 백에 옮겨 -80 °C에서 보관하십시오.

접종된 플레이트를 23 °C에서 일주일 동안 배양한 후, 이 온도에서 붉은색으로 변하는 S.marcescens 콜로니가 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜에는 여러 중요한 단계가 있지만, 가장 중요한 단계 중 하나는 Serratia Marcescens의 성장을 확인하는 것입니다. 가시적인 S.marcescens 콜로니가 없다면 다음 해동 단계로 진행하십시오.

S.marcescens 군락이 확인되면, 코어에서 5mm를 더 긁어내고 동일한 절차를 반복하십시오. 저온실의 낮은 온도에 노출되었던 원래 배양물에서 S.marcescens가 성장했는지 확인하십시오. 샘플은 알래스카 Fox에 위치한 110m 터널의 얼음 및 영구 동토층에서 수집되었습니다.

터널을 통해 얼음이 풍부한 실트와 충적층에 접근할 수 있었습니다. 시료는 3반복으로 수집되었습니다. 뉴햄프셔의 시설에서 기술된 프로토콜을 수행하였습니다.

코어에서 배양된 박테리아로부터 16S rRNA 유전자의 서열을 분석하였습니다. Pseudomonas 종이 우세하게 나타났으나, Planctomycetia와 관련된 구성원들도 존재했습니다. 특히, Serratia 종이 검출되지 않았는데, 이는 오염 제거 프로토콜이 외생 DNA를 충분히 제거했음을 보여줍니다.

이 영상을 시청하고 나면 빙하 및 영구 동토층 코어를 성공적으로 오염 제거하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련된 경우, 적절한 절차에 따라 수행한다면 저온실 처리 단계는 30분에서 45분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 접촉하는 모든 물건과 장소에 각별히 주의하는 것이 매우 중요합니다.

확신이 서지 않을 때는 장갑을 교체하고 다시 멸균하십시오. 이 절차를 거친 후, 해당 기간의 종 구성은 무엇이었는지 또는 그러한 환경 조건에서 어떤 기능적 특성이 지배적이었는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 앰플리콘 시퀀싱(amplicon sequencing) 및 샷건 메타게노믹스(shotgun metagenomics)와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.