차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

인간 만능 줄기세포에 대한 이 스텐실 기반 마이크로패터닝 방법의 전반적인 목표는 줄기세포 분화 패턴을 제어하는 공간적 환경 구배를 생성할 수 있는 간단하고 강력한 수단을 제공하는 것입니다. 이 방법은 세포 간 및 세포 매트릭스 접착력의 공간 구배가 줄기 세포 분화 운명을 구성하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지와 같은 인간 줄기 세포 모델을 사용하여 조직 패터닝의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 장점은 세포가 부착할 셀 접착 ECM 패턴을 생성하기 위해 추가 표면 변형이 필요하지 않다는 것입니다.

이는 이 Method가 각 세포주에 특정한 다양한 ECM 및 기질 구성과 호환된다는 것을 의미합니다. 이 방법의 시각적 시연은 마이크로 패터닝 단계를 배우기가 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 스텐실과 세포를 정확하고 세심하게 다루어야 하기 때문입니다.

이 절차를 위해서는 PTMS 스텐실이 이미 설계 및 제작되어 있어야 합니다. 마찬가지로, 인간 EFC 세포가 기저막 매트릭스에서 자라도록 하여 콜로니가 나중에 절차에서 파종할 준비가 되도록 합니다. 시작하려면 초순수에 700마이크로리터의 70% 분석 등급 에탄올을 접시에 넣습니다.

그런 다음 PDMS 스텐실을 용액에 놓고 접시를 생물 안전 캐비닛에 넣어 밤새 건조시킵니다. 다음 날, 스텐실 아래에 기포가 생기지 않았는지 확인하십시오. 그런 다음 세포가 스텐실에 씨를 뿌릴 수 있을 때까지 접시를 덧붙입니다.

16.7ml의 DMF12를 첨가하여 인간 ESC 품질의 기저막 매트릭스의 분취액을 준비하여 1.5x 용액을 만들고 얼음 위에 보관합니다. 90초 동안 100와트의 산소 플라즈마로 기판을 처리합니다. 플라즈마 챔버 내부가 될 때까지 접시를 열지 말고 치료 후 빠르게 덮으십시오.

이 처리는 기판이 용액에 잠길 때 기포가 형성되는 것을 방지합니다. 이제 준비된 450x 기저막 매트릭스 용액 450마이크로리터로 스텐실을 덮습니다. 그런 다음 파라필름으로 접시를 밀봉하고 5시간 동안 배양합니다.

진행하기 전에 준비된 HESC 콜로니의 6개의 웰 플레이트를 확인하십시오. 전형적인 HESC 형태를 잃은 분화된 세포의 군체를 식별하고 흡인합니다. 그들은 모두 둥글게 보여야 하고, 촘촘하게 채워진 상피 형태를 가져야 하며, 두드러진 핵과 함께 높은 핵 대 세포질 비율을 가져야 합니다.

그런 다음 도금된 셀의 각 웰을 2밀리리터의 DMF12로 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 각 웰에 아큐타아제와 같은 소화 효소 1ml를 추가하고 섭씨 37도에서 8분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 플레이트를 부드럽게 두드려 기질에서 모든 콜로니를 분리합니다.

다음으로, 웰에 적용되는 소화 효소 1밀리리터당 최소 4밀리리터의 배지로 각 웰을 헹구고 세포 현탁액을 단일 15밀리리터 원추형 튜브에 모읍니다. 실온에서 200g의 세포를 3분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 그런 다음 상등액을 흡인하고 10 마이크로 몰의 암석 억제제로 보충 된 400 마이크로 리터의 HESC 유지 매체에 세포를 다시 현탁시킵니다.

세포를 세 번 부드럽게 분쇄하여 덩어리를 분해합니다. 다음으로 서스펜션의 밀도를 수정합니다. 잘 섞어 200마이크로리터 용지에 1:20 희석합니다.

혈구계를 사용하여 희석액의 세포를 계수합니다. 그런 다음 암석 억제제가 있는 매체를 사용하여 필요에 따라 메인 서스펜션을 희석합니다. 계속하려면 준비된 각 스텐실에 필요한 수의 셀을 추가합니다.

세포의 단층만 증착해야 하므로 고르게 펴십시오. 세포가 안정될 수 있도록 스텐실을 5분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 그런 다음 적재된 스텐실을 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 옮기는 동안 접시의 수평을 유지합니다.

세포가 한 시간 동안 배양하는 동안 스텐실에 부착되도록 합니다. 세포가 부착되도록 허용한 후에는 현미경으로 검사하여 제대로 부착되었는지 확인하십시오. 스텐실을 후드로 다시 옮기고 스텐실에서 부착되지 않은 세포를 흡인합니다.

다음으로, DMF12에 있는 0.5%호환 비이온 계면활성제 2밀리리터를 스텐실 주변 영역에 추가합니다. 용액을 소용돌이쳐 스텐실을 덮습니다. 그런 다음 한 쌍의 오토클레이브 집게를 사용하여 접시에서 스텐실을 부드럽게 떼어냅니다.

스텐실을 제거한 후 현미경으로 마이크로 패터엔드 세포를 검사합니다. 비이온성 계면활성제는 이러한 세포가 건조되는 것을 방지합니다. 마이크로패터엔드 세포를 계면활성제가 보충된 배지 용액에서 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.

10분 후 용액을 흡입하고 일반 DMF12 배지 2ml로 플레이트를 3회 세척합니다. 세척 후, 암석 억제제가 함유 된 2 밀리리터의 HESC 유지 매체를 첨가하십시오. 다시 한 번 세포를 검사하여 미세 패턴이 제대로 형성되었는지 확인합니다.

그런 다음 밤새 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 다음날, 배지를 흡인하고 DMF12로 세포를 한 번 세척한 다음 2ml의 보충된 분화 배지를 첨가하여 세포가 중내배엽 분화를 거치도록 유도합니다. 나중에 결과를 분석합니다.

레이저 절단기를 사용한 셀 스텐실 제작은 1000미크론 기능을 제공했습니다. 스텐실은 마이크로 패턴화된 관통 구멍이 있는 얇은 스텐실 시트와 셀을 담는 데 사용되는 PDMS 개스킷으로 구성되었습니다. 이 도구를 사용하여 중내배엽 분화 중에 미세대칭 HESC를 조사했습니다.

H9-HESC 집락 주변부는 집락 내부의 세포보다 인테그린 접착력이 더 높습니다. 따라서 세포는 activan, BMP4 및 FGF2로 유도될 때 상완 T 양성 중배엽 세포로 분화합니다. 이러한 세포가 서로 다른 기하학, 기하학적 및 등방성 직각 및 볼록 곡률의 단층으로 패턴화되었을 때 인테그린 매개 견인력의 국부적 집중으로 이어졌고 중내배엽 분화가 증가했습니다.

단일 군체 내의 다른 지역에서의 T 발현 강도는 중배엽 유도의 정도가 정사각형 및 직사각형 군체의 날카로운 모서리와 반원형 호의 볼록한 곡률에서 실제로 더 높다는 것을 보여주었습니다. 이는 세포 접착 매개 기계적 힘이 설명된 방법을 사용하여 조절될 수 있음을 보여줍니다. 절차를 시도하기 전에 작업 중인 특정 인간 만능 줄기 세포주에 대한 매트릭스 코팅 시간, 세포 소화 및 부착 시간을 최적화하는 것이 중요합니다.