Name: 양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 배우세요 양이온/음이온 리포좀을 활용한 siRNA 중추신경계 전달 방법을. 혈관내 투여로 혈뇌장벽을 통과하여 신경퇴행성 질환 치료에 활용할 수 있는 효과적인 약물 전달 시스템입니다.

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CSU 감염병 중개 연구 교육 프로그램(ID:TRTP) 및 NIH 연구 보조금 프로그램(R01 NS075214-01A1)의 자금 출처에 감사드립니다. 단클론 항체 PRC5를 사용해 주신 Telling lab에 감사드립니다. 또한 DOTAP 리포좀에 대해 감사드리며, 리포솜 생성에 대한 전문 지식을 공유해 주신 Dow 연구소에도 감사드립니다.

모든 마우스는 사육과 콜로라도 주립 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 평가 및 실험 동물 관리 국제의 인증 협회의 인증을 받았으며 실험 동물 자원, 유지되었다. LSPCs 1. 준비 <ol><li> 1 DOTAP (1,2-dioleoyl -3- 트리메틸 프로판) : LSPCs을위한 콜레스테롤의 비율이 1을 사용합니다. 1 클로로포름 : 플라스크에 메탄올 용액을 4 nmol을 리포좀 제제의 경우, DOTAP 2 나노 몰과 (1) 10 ㎖에 콜레스테롤이 나노 몰을 혼합한다. </li><li> 흄 후드에서 N 2 가스를 이용하여 메탄올 용액 : 클로로포름 9 ㎖에 증발. 가스없이 밤새 흄 후드에서 용매의 마지막 1 mL로 증발시켰다. 플라스크의 바닥에 얇은 지질막을 관찰한다. </li><li> 55 ° C에 10 % 자당 용액의 열 10ml를. </li><li> / 천천히 분, 즉 1 ml에 얇은 지질 필름 상에 가열 된 10 % 자당 용액을 붓고 GE 동안ntly 플라스크를 소용돌이. 지질 분자는 겔 액상으로 유지하도록 55 ° C에서 지질과 10 %의 자당과 플라스크를 유지한다. 다중 층 소포 (MLV) 형성에 재수 결과. </li><li> 지질은 리포좀 크기를 조정하기 전에 적어도 한 시간 동안 55 ° C에서 재수 할 수 있습니다. </li><li> 1.0 μm의 필터 제조업체의 지침에 따라 압출기를 조립 또는 크기 1.0 μm의 주사기 필터를 사용합니다. </li><li> 11 번 압출기에 주사기 중 하나에 가열 된 리포좀 현탁액 1 ML을 추가하고, 두 주사기 사이의 정지를 전달합니다. 서스펜션은 (11)를 통과 한 후 시작 주사기보다 반대 주사기에 있는지 확인하십시오. </li><li> 리포좀 크기는 다시 0.45 μm의 다음으로, 0.2 ㎛의 필터는 큰 단일 층 소포 (LUVs)를 생성한다. 쉽게 크기 조정 가열 리포좀 현탁액을 유지합니다. </li><li> (4를 20 μM의 200 μL와 4 nmol을 리포좀 현탁액 (200 μM)의 20 μl를 품다nmol을 총)을 실온에서 10 분 동안 siRNA의 스톡 용액. </li><li> 500 μM 실온에서 10 분 동안의 siRNA / 리포좀 용액 (40 nmol을 총) 주식 RVG-9R 솔루션의 80 μl를 품어. LSPCs는 가능한 빨리 사용되어야하지만, 제조 후 수 시간이 사용될 수있다. 준비 후 몇 시간 동안 4 ° C에서 보관 LSPCs. </li></ol> PALETS 2. 준비 <ol><li> 40 : DSPE (1,2- 디스 테아-SN 글리세로 3 phosphoethanolamine) 중 5 몰비 : 콜레스테롤 : DSPE-PEG 또는 DOTAP : 콜레스테롤 : DSPE-PEG PALETS위한 55을 사용합니다. 1 클로로포름 : 플라스크에 메탄올 용액을 4 nmol을 리포좀의 제조를 위해, DSPE 또는 DOTAP 중 2.2 나노 몰, 콜레스테롤의 1.6 나노 몰 및 2 10 ㎖에 DSPE-PEG 0.2 나노 몰을 혼합한다. </li><li> 단계 1.1 이상 1.2에 설명 된대로 정확히 리포좀 현탁액을 준비합니다. 1X PBS 10 ㎖에 DSPE 리포좀을 재수 1 ㎖ / 분을 추가하여 75 ℃까지 가열 하였다. 지질가에서 75 ° C에서 재수 할 수 있도록 허용크기 전에 적어도 1 시간. </li><li> 크기는 리포좀 현탁액을 정확히 같은 단계 1.6-1.8에서 설명. </li><li> 피펫 DOTAP와 DSPE 리포좀 후 단일 사용 씩에 4 nmol을 (200 μM) 리포좀 현탁액의 각 20 μL은 크기되었습니다 및 벤치 탑 동결 건조기 (그림 2)를 사용하여 30 분 동안 동결 건조했다. </li><li> 20 μM DSPE PALETS 리포좀으로 캡슐화하는 siRNA를 실온에서 10 분 동안 프로타민 설페이트 26.6 μM 용액 1.4 μL (4 nmol을 총) siRNA의 스톡 용액 200 μl를 부화. </li><li> siRNA와의 4 nmol을 원액 200 μL로 PALETS DOTAP 리포좀을 재수 또는 siRNA의 / 프로타민 용액 201.4 μL와 DSPE PALETS 리포좀을 재수. RT에서 10 분 동안 리포좀 / siRNA의 용액을 인큐베이션. </li><li> 두 DOTAP 및 DSPE PALETS위한 리포좀 / siRNA의 용액에 60 mM의 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 용액 10 μL를 추가한다. </li><li> 모두 DOTAP와 DSPE PALETS의 리포좀 / siRNA의 용액에 150 mM의 N 히드 록 (설포-NHS) 용액 10 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 2 시간 동안 siRNA의 / 리포좀 현탁액과 EDC 및 NHS 술포 부화. </li><li> 500 μM 실온에서 10 분 동안 솔루션을 가교의 siRNA / 리포좀과 (40 nmol을 총) 주식 RVG-9R 솔루션의 80 μl를 품어. 참고 : EDC / 설포-NHS가 PEG 지질에 공유 결합에 RVG-9R 수 있습니다. 준비 후 몇 시간 내에 PALETS를 사용합니다. 준비 후 몇 시간 동안 4 ° C에서 보관 PALETS. </li><li> PALETS의 siRNA를 캡슐화 효율을 확인하려면 : <ol><li> 이전과 프로타민 260 nm에서 설정된 분광 광도계 리포좀의 첨가 후에 siRNA의 농도를 측정한다. </li><li> 50 kDa의 원심 필터를 사용하여 리포좀 / 캡슐화 된 siRNA의 서스펜션에서 캡슐화 된 siRNA를 필터링합니다. 20 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 농도 측정봉입 여액 siRNA를 260 nm에서 분광 광도계를 사용하여 잔류 물로 캡슐화 된 siRNA의 농도. </li></ol></li></ol> 3. LSPCs 또는 PALETS와 마우스를 주입 <ol><li> 혈관을 팽창하기 위해 가열 램프에 5 ~ 10 분 동안 쥐를 노출. </li><li> 2-3 %의 이소 플루오 란 / 산소와 마우스를 마취하여 주입 전에 주입시 5-10 분 흐른다. 동물이 더 이상 보행과 호흡이 발가락 핀치를 수행하여 감속 때 마취를 확인하지 않습니다. 꼬리 정맥에 액세스하기 위해 후면 또는 측면에 마우스를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> / 지우기 70 % EtOH로 꼬리 뿌려 26 G 인슐린 주사기를 이용하여 마우스의 꼬리 정맥에 LSPCs 또는 PALETS 300 μL를 주입. 꼬리 정맥에 주입 말단 시작하고 정맥이 붕괴 또는 파열 경우 근위 이동합니다. </li><li> 이 흉골 드러 누움을 유지 때까지 깨끗한 새장에 마우스를 놓습니다. 모 두지 마십시오완전히 회복 될 때까지 다른 케이지 동료와 함께 사용합니다. 마우스는 5 ~ 15 분에 복구해야합니다. 이들은 가열 패드 또는 회복이 오래 걸리는 경우 체온을 유지하기위한 가열 램프 아래에 배치 될 수있다. 마우스는 과열에 대한 보호하기 위해 면밀히 모니터링해야한다. </li><li> 마취 기운이 떨어지기 보장하기 위해 주사 후 동물 몇 시간을 모니터하고 치료에는 부작용이 없습니다. LSPCs 또는 PALETS은 최소 24 시간 동안 순환 할 수 있습니다. </li></ol> 유동 세포 계측법을 통해 단백질 발현 4. 분석 <ol><li> 15 분 동안 20 % CO 2 유량 쥐를 안락사. </li><li> 가위를 사용하여 마우스의 피부와 두개골을 멀리 절단하여 뇌의 반 반구를 해부하다. 껍질 멀리 반 거리에 집게 나 가위의 끝 부분을 사용하여 두개골에서 뇌의 반구. </li><li> FACS 완충액 2.5 mL로하여 40 ㎛의 메쉬 셀 스트레이너를 통해 각 마우스에서 뇌 눌러 반 구체 (1X; 주사기의 플런저 페트리 접시에 PBS, 1 % 소 태아 혈청, 10 mM의 EDTA). </li><li> FACS 버퍼의 추가 2.5 ml의 셀 스트레이너와 페트리 접시를 씻어. 얼음에 15 ml의 원뿔 관에서 단일 세포 현탁액을 넣습니다. </li><li> 피펫 350 x g에서 5 분 동안 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 5 ㎖ 단일 세포 현탁액 100 ㎕. FACS 완충액 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 세포 펠렛을 버린다. 5 분 동안 350 XG 스핀. FACS 버퍼의 또 다른 1 ㎖로 반복합니다. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li><li> (1) 100 ㎕의 세포를 품어 : FACS 버퍼에 0.5 ㎎ / ㎖ 쥐 항 - 마우스의 Fc 블록 (100) 희석을 얼음에 30 ~ 60 분. 펠렛 단계 4.5로 세포를 씻어. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li><li> 30 ~ 60 분 동안 얼음에 FACS 버퍼에 7 % 마우스 혈청에서 마우스 PRP C에 대해 20 μg의 / ㎖ 형광 항체 100 ㎕의 세포를 품어. 펠렛 단계 4.5로 세포를 씻어. 세포 현탁액을 유지얼음 에다가요. </li><li> 펠릿 1 분간 적혈구 용해 완충액 1 ㎖ (1X PBS 155 mM의 NH 4 CL, 12 mM의 NaHCO3을 0.1 mM의 EDTA)으로 세포를 재 - 보류. 단계 4.5에서와 같이 펠릿은 FACS 완충액 1 ml의 세포를 재현 탁. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li><li> 앞서 설명한 바와 같이 (10) 플로우 사이토 미터를 사용하여 C PRP 발현을 분석한다. 게이트는 총 세포 집단에서 세포를 살고 있습니다. 게이트 PRP C + 라이브 세포 집단에서 세포 MFI (평균 형광 강도)를 결정합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 보고서는 효율적으로 CNS에의 siRNA를 전송이 표적 전달 시스템을 만들 수있는 프로토콜을 설명합니다. 중추 신경계에의 siRNA를 전달하는 이전 방법은 뇌, 대상의 siRNA의 정맥 주사, 또는 비 대상 리포좀의 siRNA 복합체의 정맥 주사에​​ 직접 siRNA를 /의 shRNA 벡터를 주입 포함되어 있습니다. 중추 신경계로의 siRNA / shRNA를 벡터의 주입은 목적 단백질의 발현 수준의 감소를 야기 않는다. 그러나, siRNA를 /의 shRNA는 CNS를 통해 자유롭게 확산되지 않습니다. 또한, 이러한 주사는 인접한 신경 조직 6-9 손상. 타겟팅 된 siRNA의 정맥 내 주사는 표적 단백질의 감소를 초래한다. 그러나, siRNA의 대부분은 혈액 단백질 (20)에 의해 분해된다. 마지막으로, 단핵 식세포 시스템 (21) 간 열화 내에 포획 된 siRNA의 불특정의 siRNA를 리포좀 복합체 결과 정맥 내 주사. siRNA의 전달상기 차량 LSPCs 및 ...

프리온은 중추 신경계에 영향을 미치는 심각한 신경 퇴행성 질환이다. 프리온 질병은 PRP 해상도라는 감염 체에 의해 정상 세포 프리온 단백질 PRP C의 미스 폴딩 기인한다. 이 질병은 인간 1-3에서 소 해면상 소에 뇌증, 스크래피 양에, cervids 만성 소모성 질환, 및 크로이츠 펠트 - 야콥병 등 종의 다양한 영향을 미친다. 프리온은 시냅스 손실 시작하고, 공포 화하기 위해 진행 신경 퇴행, 신경교 증, 신경 세포의 손실 및 플라크 침착을 일으킬. 결국, 4 개인 동물 /의 죽음의 결과로. 수십 년 동안, 연구자들은 늦추거나 프리온 질병의 진행을 중지하는 것을 의미 화합물을 조사 하였다. 그러나 연구진은 성공적인 치료 또는 효과적인 전신 배달 차량 중 하나를 발견하지 않았습니다. 내인성 PRP C 발현 프리온 질병 (5)의 발전에 필요한 </s&gt;입니다. 따라서, 감소 또는 제거 PRP C 표현이 지연 또는 질병의 경감 될 수 있습니다. 몇몇 그룹은 프리온 질환 PRP C 발현 수준의 역할을 조사하기 위해 쥐 뇌 조직에 직접 shRNA를 발현 PRP C의 감소 수준 또는 주입 lentivectors와 트랜스 제닉 마우스를 만들었다. 신경 PRP C의 양을 감소 발견 이들 연구자 프리온 질병의 병리학 시브를 중지 결과 및 6-9 동물의 수명을 연장. 우리는 마우스 신경 모세포종 세포 (10)의 PRP 해상도의 틈새에서 그 PRP C의 siRNA 처리 결과를보고했다. 이러한 연구는 치료의 사용은 작은 간섭 RNA (siRNA의) mRNA의 절단 같이 PRP C 발현 수준을 감소시키기에 충분히 프리온 질병의 진행을 지연시킬 수 있다는 것을 시사한다. 그러나 프리온 질환에 대한 조사 대부분의 치료는 실용적이지 않을 것입니다 방법으로 전달되었다임상있다. 따라서, siRNA의 치료는 CNS에 정맥 내 전달을 대상으로 전신 전달 시스템을 필요로한다. 연구자들은 유전자 치료제에 대한 전달 비히클로서 리포좀의 사용을 연구 하였다. 양이온 및 음이온 모두 지질 리포좀의 형성에 사용된다. 양이온 성 지질 및 DNA / RNA 사이의 전하의 차이를 효율적으로 포장 할 수 있기 때문에 양이온 성 지질 널리 음이온 지질 이상 사용된다. 양이온 성 지질의 또 다른 장점은 그들이 다른 지질 11-14보다 용이하게 세포막을 통과한다는 것이다. 그러나, 양이온 성 지질은 음이온 지질 (13, 14)보다 면역 원성 있습니다. 따라서 연구팀은 리포좀의 지질 음이온에 양이온을 사용하여 이동하기 시작했다. 유전자 치료 제품을 효율적으로 DNA / RNA 분자 15-19 집광 양전하 펩타이드 프로타민 설페이트를 사용하는 음이온 성 리포좀 내로 패키징 할 수있다. 음이온 LIPI 이후DS는 양이온 성 지질가 순환 시간을 증가 할 수 있으며, 더 많은 동물 모델 (13, 14)에서 허용 될 수보다 면역 원성 있습니다. 리포좀은 리포좀에 부착 된 펩티드를 대상으로 사용하여 특정 조직을 대상으로한다. 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체에 결합하는 RVG-9R의 신경 펩타이드는 중추 신경계 17-20로의 siRNA와 리포좀을 대상으로 사용되어왔다. 이 보고서는 프로토콜은 세 가지의 siRNA 전달 비히클을 제조하고, 패키징하고 신경 세포 (도 1)에 siRNA를 전달하기 위해 설명. siRNA를 리포좀 - 펩티드 복합체 (LSPCs)의 siRNA를 리포좀으로 구성되는 펩티드 타겟팅 RVG-9R 정전 기적 리포솜의 외 표면에 부착. 펩티드 RVG-9R 공유 결합 지질 PEG 그룹에 결합하여 siRNA를 리포좀 내에 캡슐화 프로타민 구성되어 치료의 siRNA (PALETS)를 캡슐화 리포솜을 해결. 아래의 방법을 사용하고 LSPCs PALET를 생성S는 PRP C의 siRNA는 치료 또는 실질적으로 프리온 질병 병리학의 발병을 지연시키는 엄청난 약속을 보유하고 신경 세포의 90 %, 최대 PRP C의 발현을 감소시킨다.

<table><tbody><tr><td>DOTAP 지질</td><td>Avanti 지질</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Avanti 지질</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Avanti 지질</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Avanti 지질</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>EMD Millipore</td><td>113351</td><td></td></tr><tr><td>N2 가스</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>압출기</td><td>Avanti Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1.0, 0.4 및 0.2 &#956; m 필터</td><td>Avanti Lipids</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>프로타민 설페이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>일회용</td></tr><tr><td>분주 Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>분주</td></tr><tr><td>40 &#956; m Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PrP 항체 (PRC5)</td><td>독점 - PRC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

양이온과 음이온 리포좀을 사용 cns에 치료의 sirna 배달

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

프리온 질환은 정상적인 세포 프리온 단백질(PrPC)이 PrPRes라고 하는 비정상적인 단백질 분해효소 내성 이성질체로 잘못 접혀서 발생합니다. 야생 동물 개체군에서 프리온 질병의 출현과 인간의 건강에 대한 위협이 증가함에 따라 이러한 질병에 대한 치료법을 찾기 위한 노력이 증가했습니다. 최근 연구에서는 감염성 PrPRes 이성질체를 억제하거나 정상적인 세포 프리온 단백질을 하향 조절할 수 있는 수많은 항프리온 화합물이 발견되었습니다. 그러나 이러한 화합물의 대부분은 뇌 조직에서 PrPRes 형성을 효과적으로 억제하기 위해 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않고, 신경 세포 PrPC를 특이적으로 표적으로 하지 않으며, 종종 너무 독성이 강하여 동물 또는 인간 피험자에게 사용할 수 없습니다. 
우리는 siRNA가 혈관 내에서 전달되고 신경 세포 PrPC를 표적으로 하는지 여부를 조사했습니다. 이 보고서는 두 개의 siRNA 리포솜 전달 매개체를 생산하고 PrP siRNA를 포장하여 신경 세포에 전달하는 프로토콜을 설명합니다. 두 가지 리포솜 전달 매개체는 1) 양이온 리포좀(LSPC)을 사용한 복합 siRNA 리포좀 제형과 2) 양이온 또는 음이온 리포좀(PALETS)을 사용한 캡슐화된 siRNA 리포좀 제형입니다. LSPC의 경우, 음전하를 띤 siRNA는 양이온성 리포좀에 정전기적으로 결합되어 있습니다. 양전하를 띤 펩타이드(RVG-9r[광견병 바이러스 당단백질])를 복합체에 첨가하여 혈액뇌장벽(BBB)을 가로질러 중추신경계(CNS)의 아세틸콜린을 발현하는 리포솜-siRNA-펩타이드 복합체(LSPC)를 특이적으로 표적으로 합니다. PALETS(펩타이드, 리포솜 캡슐화 치료용 siRNA)의 경우, 양이온성 및 음이온성 지질은 PrP siRNA에 의해 재수화되었습니다. 이 절차는 양이온 또는 음이온 리포솜 내에서 siRNA를 캡슐화합니다. 다시 말하지만, RVG-9r 뉴로펩타이드는 리포좀에 결합되어 중추신경계에 대한 siRNA/리포좀 복합체를 표적으로 삼았습니다. 이러한 제형을 사용하여 PrP siRNA를 AchR 발현 뉴런에 성공적으로 전달하고 CNS에서 뉴런의 PrPC 발현을 줄였습니다.

음이온 PALETS 내의 siRNA의 캡슐화의 효율성을 증가시키기 위해, siRNA의 프로타민을 혼합 하였다. 1 (그림 3A) : 1 2 : siRNA를위한 최선의 프로타민의 농도를 결정하기 위해, siRNA를 1에서, 프로타민의 서로 다른 농도로 혼합 하였다. 프로타민을 사용하지 않고 음이온 성 리포좀에 60~65% siRNA의 캡슐화 효율이 있었다. 프로타민과 샘플 : 1 ~ 1.5 : 1에서 siRNA의 몰비 1 (133-266 nm의)는 80~90%의 siRNA를 캡슐화를했다. 1.5 위의 어금니 비율 : 1의 siRNA / 프로타민 단지의 침전 결과. 이 침전 단지는 음이온 성 리포좀으로 캡슐화되지 않았다. siRNA의 프로타민에 첨가 후에 의한 희석에 대한 siRNA의 농도에 약간의 저하가 존재 하였다; 그러나, 프로타민 농도의 첨가 (도 3b) 한 후 안정적이었다. 50 kDa의 필터, siRN...

이 프로토콜의 목표는 신경 표적 펩타이드가 있는 양이온성/음이온성 리포좀을 CNS 전달 시스템으로 사용하여 siRNA가 BBB를 통과할 수 있도록 하는 것입니다. siRNA와 같은 치료를 위한 전달 시스템의 최적화는 프리온 및 기타 신경 퇴행성 질환에 대한 더 많은 치료 옵션을 가능하게 할 것입니다.

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 siRNA와 같은 소분자 약물을 뇌로 전달할 수 있는 전달 시스템을 설계하는 것입니다. 이 방법은 "siRNA가 단백질 미스폴딩 질환에 대해 실행 가능한 치료 옵션이 될 수 있는가?" 그리고 "뇌로 향하는 신뢰할 수 있는 약물 전달 시스템을 설계할 수 있는가?"와 같은 신경퇴행성 질환 분야의 핵심 질문에 대한 답을 제시할 수 있습니다.리포좀 약물 전달 시스템을 구축하는 주된 장점은 siRNA를 신경 조직에 직접 투여하여 발생하는 신경 손상을 피하고, 정맥 또는 혈류를 통해 전달할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 혈뇌장벽(blood-brain barrier)을 통과하여 특히 아세틸콜린을 발현하는 뉴런으로 특이적 전달이 가능하므로, 신경퇴행성 질환의 치료 및 진단 분야까지 응용 범위가 확장됩니다. 마우스 꼬리 정맥은 크기가 매우 작아 주사법을 익히기가 어렵기 때문에, 이 기술에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.먼저 DOTAP와 콜레스테롤의 비율을 1:1로 준비합니다. 외래 동물 리포좀 조제를 위해, 1:1 클로로포름 및 메탄올 용액 10 mL에 DOTAP 2 nmol과 콜레스테롤 2 nmol을 혼합합니다. 그런 다음, 질소 가스를 사용하여 클로로포름 및 메탄올 용액 9 mL를 증발시킵니다.가스가 없는 흄 후드 내에서 하룻밤 동안 용매의 마지막 1 mL를 증발시킵니다. 다음 날, 플라스크 바닥에 얇은 지질 막이 형성된 것을 확인할 수 있어야 합니다. 지질 막이 있는 이 플라스크와 10% sucrose 용액 10 mL를 모두 55 °C로 가열합니다.그런 다음, 플라스크를 부드럽게 회전시키면서 가열된 sucrose 용액을 얇은 지질 막 위에 천천히 피펫팅합니다. 이어서 제조사의 지침에 따라 1 µm 필터가 장착된 익스트루더를 조립합니다. 그 후, 가열된 리포좀 현탁액 1 mL를 익스트루더의 시린지 중 하나에 넣습니다.그 다음, 현탁액을 두 개의 주사기 사이로 11회 통과시킵니다. 크기 조절을 쉽게 하기 위해 리포좀 현탁액을 가열 상태로 유지하면서, 45 micron 및 2 micron 필터를 통해 리포좀의 크기를 조절합니다. 커다란 단일층 소포(unilamellar vesicles)를 생성하려면, 4 nanomole 리포좀 현탁액 20 microliters를 20 micromolar stock siRNA 용액 200 microliters에 첨가하고 상온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음, RVG-9R 표적 펩타이드의 500 micromolar stock 80 microliters를 siRNA 리포좀 용액에 첨가하고 상온에서 10분 동안 배양합니다.DSPE 또는 DOTAP 2.2 nanomoles를 1.6 nanomoles의 cholesterol 및 2 nanomoles의 DSPE peg와 함께 2:1 비율의 chloroform 및 methanol 용액 10 milliliters에 혼합하여 이종 동물 리포좀 현탁액을 준비합니다. 그 후, 질소 가스를 가하고 용매의 대부분이 증발하면 플라스크를 흄 후드에 하룻밤 동안 둡니다. 그런 다음, 75 °C로 가열된 1X PBS 10 milliliters를 얇은 지질 막에 천천히 첨가합니다.사이징 전, 지질을 75 °C에서 최소 1시간 동안 재수화시킵니다. 이전과 동일하게 압출기를 사용하여 리포좀 현탁액의 사이징을 수행한 후, 네 가지 나노몰 리포좀 현탁액 각각에서 20 µL를 일회용 분주 튜브에 취해 벤치탑 동결건조기를 사용하여 30분 동안 동결건조합니다. 다음으로, 20 µM 스톡 siRNA 용액 200 µL에 26.6 µM 프로타민 황산염 용액 1.4 µL를 첨가하고, siRNA를 응축시키기 위해 상온에서 10분 동안 배양합니다.배양 후, 201.4 µL의 siRNA 프로타민 용액으로 DSPE 펠렛을 재수화합니다. 200 µL의 외래 동물 siRNA 스톡 용액으로 DOTAP 펠렛을 재수화합니다. 각 리포좀 siRNA 용액을 실온에서 10분 동안 배양합니다.다음으로, 재수화된 리포좀이 담긴 각 튜브에 60 mM EDC 용액 10 µL를 첨가합니다. 그런 다음 DOTAP 및 DSPE 펠렛 모두의 리포좀 siRNA 용액에 150 mM sulfo-NHS 용액 10 µL를 첨가합니다. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.마지막으로, 500 $\mu\text{M}$ RVG-9R 펩타이드 스톡 80 $\mu\text{L}$를 siRNA 리포좀 가교 용액에 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 산소 내 2~3% 이소플루레인을 사용하여 마우스를 마취시킨 후, 마우스의 눈에 안연고를 바르고 발가락 꼬집기 검사를 통해 마취 상태를 확인합니다. 반응이 없는 경우에만 다음 단계를 진행하십시오.마취 상태를 유지하면서, 꼬리 정맥에 접근할 수 있도록 마우스를 등이나 옆으로 눕힙니다. 꼬리를 70% 에탄올로 닦아낸 후, 26 gauge 인슐린 주사기를 사용하여 300 µL의 LSPCs 또는 펠릿을 꼬리 정맥에 주입합니다. 말단부터 주입하기 시작하며, 정맥이 허탈되거나 파열된 경우 근위부로 이동하여 주입합니다.마우스가 복와위 상태를 유지할 때까지 깨끗한 케이지에 넣습니다. 주사 후 몇 시간 동안 동물을 모니터링하여 마취가 풀렸는지와 처치로 인한 부작용이 없는지 확인합니다. LSPCs 또는 펠렛이 최소 24시간 동안 순환하게 한 다음 마우스를 안락사시키고, 뇌 반구의 절반을 적출합니다.그 다음 반구형 캡과 2.5 milliliters의 fax buffer를 40 micron 메쉬 셀 스트레이너 위에 올리고, 주사기 플런저를 사용하여 조직을 필터로 눌러 페트리 접시에 통과시킵니다. 셀 스트레이너와 페트리 접이를 추가 2.5 milliliters의 fax buffer로 헹굽니다. 그런 다음 단일 세포 현탁액을 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮기고 얼음 위에 둡니다.다음으로, 세포 현탁액 100 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 취해 350 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 세포 펠렛을 1 mL의 FACS buffer로 재현탁하고 다시 원심분리합니다. 그런 다음, FACS buffer 1 mL를 추가로 넣고 세포 현탁액을 얼음에 둡니다. 이제 FACS buffer에 희석한 rat anti-mouse Fc block 100 µL에서 세포를 얼음 위에 30~60분 동안 배양합니다.이전과 동일하게 펠렛팅 및 세척을 수행한 후, 100 µL의 형광 일차 항체 용액을 첨가하고 30분에서 60분 동안 얼음에 보관합니다. 마지막 세척 후, 1 mL의 RVC 용해 버퍼에 세포를 1분 동안 재현탁합니다. 그 다음, 세포를 펠렛팅합니다.완충액을 제거한 후, 1 mL의 fax buffer로 재현탁하여 얼음에 둡니다. 이제 세포를 fax 분석에 사용할 준비가 되었습니다. LSPC를 통해 siRNA를 전달하여 처리한 마우스는 야생형 세포 prion 단백질 수치를 보이는 PBS 대조군과 비교하여 세포 prion 단백질 수치가 유의하게 감소했습니다.LSPC 처리 쥐는 프리온 단백질 결손 쥐와 유사한 수준의 세포 프리온 단백질 수치를 나타냈습니다. 세 차례의 실험 전반에 걸쳐, LSPC 처리 쥐는 유형 대조군인 PBS 처리 쥐와 비교하여 세포 프리온 단백질 수치가 유의미하게 감소했습니다. 이 절차를 수행할 때, 리포좀은 냉장고에 수개월 동안 보관할 수 있으나, 조립이 완료된 LSPC는 조립 후 24시간 이내에 사용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.개발 후, LSPC 또는 palet의 생성은 연구자들이 신경퇴행성 질환 분야에서 더 많은 치료 옵션을 탐색할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

약물 캡슐화는 종양 세포 특이성을 향상시키고 신경 독성을 감소시킵니다.

대류 강화 폴리에틸렌 글리콜 코팅 하전 리포좀을 쥐 뇌 종양으로 전달

출처: Ullah, I., et.al. 중추신경계에 비강내 siRNA를 전달하는 동안 마우스를 배치하기 위한 포지셔닝 장치. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 특수 포지셔닝 장치를 사용하여 뉴런 표적 펩타이드-siRNA 복합체를 마우스 뇌에 전달하기 위한 정밀한 비강내 투여 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 폐 배액을 방지하면서 siRNA 흡입을 최적화하기 위해 머리를 아래로 향하게 하고 앞으로 고정합니다. 표적 펩타이드는 뉴런에서 수용체 매개 흡수를 촉진하여 뇌에서 표적 siRNA 전달 및 유전자 침묵을 가능하게 합니다.

포지셔닝 장치를 사용하여 마우스 뇌에 siRNA의 비강내 전달

출처: Bender, HR, et.al. 양이온성 및 음이온성 리포솜을 사용하여 CNS에 치료용 siRNA를 전달합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 리포솜 siRNA-펩티드 복합체(LSPC)를 사용하여 프리온 단백질(PrP) siRNA를 뉴런에 표적으로 전달하는 방법을 보여줍니다. 양이온성 리포좀은 PrP 표적 siRNA에 정전기적으로 결합하며, 이는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 수용체 매개 수송을 위해 RVG-9r 펩타이드에 의해 더욱 안정화됩니다. 일단 뇌 내부로 들어가면 LSPC는 뉴런에서 엔도사이토시스를 거쳐 siRNA를 방출하여 RNA 간섭을 시작하고 PrP 발현을 감소시키며 프리온 질병 진행을 방해합니다.

리포솜 복합체를 사용한 프리온 단백질 침묵을 위한 뉴런에 대한 표적 siRNA 전달

생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN - 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

우리는 카테터를 이식하거나 마우스의 오른쪽 측면 뇌실에 알약 주입을 수행하여 중추 신경계에 약물을 대상으로하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 특히 초점을 맞 춥니 다. 이 기술은 다른 약물과 쥐에 쉽게 적응할 수있다.

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

배달은 작은 간섭 RNA (siRNA의)의 치료 구현을위한 주요 과제로 남아. 이 프로토콜은 아르기닌 및 폴리에틸렌 이민 다공성 실리콘 그래프트 미립자로 구성된 다기능 및 생체 적합성의 siRNA 전달 플랫폼의 사용을 포함한다.

siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

여기서, 우리는 중추 신경계에서 효과적인 유전자 침묵이 가능하게 하는 뇌 표적화 펩티드-siRNA 제제의 비강 내 투여를 위한 마우스의 적절한 배치를 가능하게 하는 마우스 포지셔닝 장치를 이용한 프로토콜을 제시한다.

중추 신경계에 비강 siRNA 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치

화학적 성질을 준비 및 특성화 하는 방법 및 중성 충전 된, pH 반응 siRNA 나노 입자의 생물 활성이 제시 된다. 성공적인 siRNA에 대 한 기준은 크기, 형태학, 표면 전 하, siRNA 하 중 및 유전자 침묵과 같은 나노 의약품에 대해 논의 된다.

사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

여기서, 우리는 척추의 요추 내 공간에 카테터를 이식하여 쥐 중추 신경계에 약물을 전달하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 초점을 맞추고, 이 방법은 뿐만 아니라 다른 치료 양식의 전달에 적합 하지만.

쥐 중추 신경계에서 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 내 전달

배우세요 양이온/음이온 리포좀을 활용한 siRNA 중추신경계 전달 방법을. 혈관내 투여로 혈뇌장벽을 통과하여 신경퇴행성 질환 치료에 활용할 수 있는 효과적인 약물 전달 시스템입니다.

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

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