양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

이 절차의 전반적인 목표는 siRNA와 같은 저분자 약물을 뇌에 전달할 수 있는 전달 시스템을 설계하는 것입니다. 이 방법은 다음과 같은 신경 퇴행 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다: siRNA는 단백질 잘못 접힘 질환에 대한 실행 가능한 치료 옵션입니까? 그리고 뇌에 대한 신뢰할 수 있는 약물 전달 시스템을 설계할 수 있습니까?

리포솜 약물 전달 시스템을 만드는 것의 주요 이점은 siRNA를 신경 조직을 통해 직접 전달하지 않고 정맥 주사 또는 혈류를 통해 전달할 수 있어 신경 세포 손상을 초래할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 신경 퇴행성 질환의 치료 및 진단으로 확장되는데, 그 이유는 이 기술이 혈액 뇌 장벽을 가로질러 특히 아세틸콜린 발현 뉴런에 특정 전달을 허용하기 때문입니다. 쥐 꼬리 정맥 주사는 쥐 꼬리 정맥의 크기가 작기 때문에 배우기가 어렵기 때문에 이 기술의 시각적 시연이 중요합니다.

대일 DOTAP 대 콜레스테롤 비율을 준비하는 것으로 시작하십시오. 외래 동물 리포좀 제제의 경우, 2 나노 몰의 DOTAP과 2 나노 몰의 콜레스테롤을 10 밀리리터의 일대일 클로로포름 대 메탄올 용액에 혼합합니다. 그런 다음 질소 가스를 사용하여 클로로포름과 메탄올 용액 9ml를 증발시킵니다.

가스 없이 밤새 흄 후드에서 마지막 1ml의 용매를 증발시킵니다. 다음 날, 플라스크 바닥에 얇은 지질막이 보일 것입니다. 이 플라스크를 지질막과 10% 자당 용액 10밀리리터로 섭씨 55도까지 가열합니다.

그런 다음 가열된 자당 용액을 얇은 지질 필름에 천천히 피펫팅하면서 플라스크를 부드럽게 휘젓습니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 1미크론 필터로 압출기를 조립합니다. 그런 다음 가열된 리포좀 현탁액 1ml를 압출기의 주사기 중 하나에 추가합니다.

그런 다음 두 주사기 사이에 현탁액을 11회 통과시킵니다. 더 쉬운 크기 조정을 위해 리포좀 현탁액을 가열된 상태로 유지하면서 45미크론과 2미크론 필터를 통해 리포솜 크기를 조정하여 큰 단층 소포를 생성하려면 다음으로 4개의 나노몰 리포좀 현탁액 200마이크로리터에 20마이크로리터의 20마이크로몰 스톡 siRNA 용액을 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 500마이크로몰의 RVG-9R 표적 펩타이드 80마이크로리터를 siRNA 리포좀 용액에 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

2.2 나노몰의 DSPE 또는 DOTAP을 10 밀리리터의 2 대 1 클로로포름 대 메탄올 용액에 1.6 나노몰의 콜레스테롤과 2 나노몰의 DSPE 페그를 혼합하여 외래 동물 립소모 현탁액을 준비합니다. 그 후, 질소 가스를 바르고 대부분의 용매가 증발하면 플라스크를 흄 후드에 밤새 그대로 두십시오. 그런 다음 섭씨 75도로 가열된 1X PBS 10밀리리터를 얇은 지질 필름에 천천히 첨가합니다.

크기를 조정하기 전에 최소 1시간 동안 섭씨 75도에서 지질이 재수화되도록 합니다. 이전과 같이 압출기를 사용하여 리포좀 현탁액의 크기를 측정한 후, 4개의 나노몰 리포좀 현탁액 각각을 20마이크로리터씩 일회용 부분 표본으로 피펫팅하고 벤치탑 동결 건조기를 사용하여 30분 동안 동결건조합니다. 다음으로, 1.4 마이크로 리터의 프로타민 설페이트 26.6 마이크로 몰 용액을 200 마이크로 리터의 20 마이크로 몰 스톡 siRNA 용액 200 마이크로 리터에 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양하여 siRNA를 응축합니다.

배양 후 DSPE 팔레트를 201.4마이크로리터의 siRNA 프로타민 용액으로 재수화합니다. 200마이크로리터의 siRNA의 외래 동물 스톡 용액으로 DOTAP 팔레트를 재수화합니다. 각 리포좀 siRNA 용액을 실온에서 10분 동안 배양합니다.

다음으로, 10마이크로리터의 60밀리몰 EDC 용액을 재수화된 리포좀의 각 튜브에 추가합니다. 그런 다음 DOTAP 및 DSPE palets 모두에 대한 리포좀 siRNA 용액에 10마이크로리터의 150 millimolar sulfo-NHS 용액을 추가합니다. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

마지막으로, 80마이크로리터의 RVG-9R 펩타이드 500마이크로몰 스톡을 siRNA 리포좀 가교 결합 용액에 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 산소에 2-3%의 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취한 후 압탈 연고로 마우스의 눈을 덮고 발가락 꼬집기를 수행하여 마취를 확인합니다. 반응이 없는 경우에만 진행하십시오.

마취를 유지하는 동안 꼬리 정맥에 접근할 수 있도록 마우스를 뒤쪽이나 옆으로 눕힙니다. 70% 에탄올로 꼬리를 닦은 다음 26게이지 인슐린 주사기를 사용하여 300마이크로리터의 LSPC 또는 팔레를 꼬리 정맥에 주입합니다. 원위부로 주입을 시작하고 정맥이 무너지거나 파열되면 근방으로 움직입니다.

흉골 누운 자세가 유지될 때까지 마우스를 깨끗한 케이지에 넣습니다. 주사 후 몇 시간 동안 동물을 모니터링하여 마취가 사라지고 치료의 부작용이 없는지 확인합니다. LSPC나 팔렛이 최소 24시간 동안 순환하도록 한 다음 마우스를 안락사시킨 후 뇌의 반구의 절반을 해부합니다.

그런 다음 반구와 2.5밀리리터의 팩스 버퍼를 40미크론 메쉬 셀 스트레이너에 놓고 주사기의 플런저를 사용하여 필터를 통해 조직을 페트리 접시에 밀어 넣습니다. 셀 스트레이너와 페트리 접시를 2.5ml의 팩스 버퍼로 헹굽니다. 그런 다음 단일 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.

다음으로, 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 350 회 G로 5 분 동안 원심 분리기를 피펫하고 상등액을 버린 후 세포 펠렛을 1 밀리리터의 팩스 버퍼에 재현탁시키고 다시 원심 분리기를 실시한다. 그런 다음 또 다른 밀리리터의 팩스 버퍼를 추가하고 세포 현탁액을 얼음 위에 놓습니다. 이제 100 마이크로 리터의 쥐 안티 마우스 Fc 블록에서 얼음 위에서 30-60 분 동안 팩스 버퍼에 세포를 배양합니다.

이전과 같이 펠릿화하고 세척한 후 형광 1차 항체 용액 100마이크로리터를 넣고 얼음 위에 30-60분 동안 놓습니다. 최종 세척 후 1mililit의 RVC lysis buffer에 세포를 1분 동안 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 펠릿으로 만듭니다.

버퍼를 버린 후 1ml의 팩스 버퍼에 다시 부유시키고 얼음 위에 놓습니다. 이제 셀을 팩스로 분석할 준비가 되었습니다. LSPC를 통해 전달된 siRNA로 처리된 마우스는 PBS 대조군에 비해 세포 프리온 단백질 수치가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다.

LSPC를 처리한 마우스는 프리온 단백질 녹아웃 마우스와 유사한 세포 프리온 단백질 수준을 보여주었습니다. 세 가지 실험에서 LSPC를 투여한 마우스는 유형 대조군 동안 PBS에 비해 세포 프리온 단백질 수치가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. 이 절차를 시도하는 동안 리포솜은 냉장고에 몇 달 동안 보관할 수 있지만 완전한 LSPC는 조립 후 24시간 이내에 사용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후 LSPC 또는 palets의 생성은 연구자들이 신경퇴행성 질환 분야에서 더 많은 치료 옵션을 탐색할 수 있는 길을 열 것입니다.