표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

이 절차의 전반적인 목표는 만성 바이러스에 감염된 마우스에서 분리된 조절 T 세포의 체외 억제 기능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 만성 바이러스 감염 중 활성화된 조절 T 세포의 표현형 및 체외 억제 기능에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 in vitro에서 T 세포에 긍정적인 반응을 보이는 개인에 대한 조절 T 세포의 직접적인 영향을 평가할 수 있습니다.

이것은 이 기술의 큰 장점입니다. 50마이크로리터의 facs 완충액에 있는 5배의 총 비장 림프구를 새로운 U bottom 96 well plate의 각 well로 5배 10배로 옮기는 것으로 시작한 다음 150μl의 facs buffer로 옮깁니다. 플레이트를 원심 분리하고 상층액을 버립니다.

그런 다음 세포 펠릿을 교반하고 웰 당 200 마이크로 리터의 facs 버퍼에서 세포를 두 번 더 세척합니다. 두 번째 세척 후, 웰당 50마이크로리터의 항체 칵테일에 펠릿을 섭씨 4도의 어둠 속에서 20분 동안 재현탁합니다. 그런 다음 facs buffer에서 세포를 두 번 세척하고 상층액을 디캔팅합니다.

다음으로, 100마이크로리터의 고정 버퍼로 섭씨 4도의 어둠 속에서 20분 동안 세포를 고정한 다음 투과화 세척 버퍼로 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 50마이크로리터의 항-FOXP3 항체에 세포를 재현탁합니다. 안티 CD3 CD28 코팅 비드를 준비하려면 적절한 부피의 마그네틱 비드를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 동일한 부피의 PPS를 첨가하십시오.

피펫팅으로 용액을 부드럽게 혼합하고 자성 비드를 원심분리합니다. 세척이 끝나면 상층액을 버리고 비드를 웰당 50마이크로리터의 완전한 배지로 희석합니다. 다음으로, 96 웰 U 바닥 플레이트에서 웰 당 5 번째 CD4 양성 CD25 양성 조절 T 세포에 1 곱하기 10의 50 마이크로 리터를 파종하고, 이어서 웰 당 5 번째 CD8 양성 반응 T 세포에 1 곱하기 10의 50 마이크로 리터를 파종한다.

모든 세포가 플레이팅되면 각 웰에 희석된 안티 CD3 CD28 코팅 비드 50마이크로리터를 추가하고 최대 50마이크로리터의 배지를 추가하여 각 웰의 총 부피를 최대 200마이크로리터로 만듭니다. 그런 다음 접시를 호일로 덮고 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 72시간 동안 놓습니다. CD8 양성 T 세포 사이토카인 생산을 분석하기 위해 배양 3일 후 상등액을 다른 96웰 플레이트로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 ELISA로 상층액을 분석합니다.

CD8 양성 T 세포의 증식을 분석하려면 facs buffer로 세포 플레이트를 세 번 세척합니다. 그런 다음 증식된 CD8 양성 T 세포에 대한 적절한 항체 칵테일 50마이크로리터에 펠릿을 섭씨 4도의 어둠 속에서 20분 동안 재현탁합니다. 배양이 끝나면 세포를 facs buffer에서 두 번 세척하고 100μl의 고정 buffer로 섭씨 4도의 어둠 속에서 20분 동안 고정합니다.

마지막으로, facs buffer에서 세포를 두 번 더 세척하고 pellets를 200μl의 facs buffer에 재현탁합니다. 그런 다음 유세포 분석으로 phylate dilabelled CD8 positive T cell proliferation의 백분율을 측정합니다. 미접촉 및 감염된 마우스에서 얻은 비장 림프구에서 PD-1은 LCMV 클론 13 감염된 마우스의 기존 FOXP3 음성 CD4 양성 및 FOXP3 음성 CD8 양성 세포 모두에서 특이적으로 상향 조절됩니다.

FOXP3 양성 CD4 양성 조절 T 세포의 빈도는 LCMV 클론 13 감염 마우스에서 미숙한 마우스보다 2배 더 높았으며, 대부분의 FOXP3 양성 CD4 양성 세포도 활성화된 PD-1 높은 표현형을 나타냅니다. CD8 양성 반응 T 세포는 다른 면역 세포에 의한 심각한 오염 없이 성공적으로 분리될 수 있습니다. 조절 T 세포 분리 후, 순도가 80% 이상인 CD25 양성 CD4 양성 T 세포의 우성 집단을 얻을 수 있습니다.

항 CD3 CD28 코팅 비드에 의한 분리된 조절 및 반응 T 세포의 자극은 용량 의존적 방식으로 CD8 양성 반응 T 세포의 억제를 초래합니다. 실제로, CD8 양성 반응 T 세포가 만성 조절 T 세포와 1:1 비율로 동시 배양될 때, CD8 양성 반응 T 세포의 증식이 현저히 억제됩니다. CD8 양성 반응 T 세포를 만성 감염된 마우스의 활성화된 조절 T 세포와 공동 배양할 때, 순진한 마우스의 휴지 조절 T 세포와 공동 배양할 때, CD8 양성 반응 T 세포에 의한 인터페론 감마 생산도 유의하게 억제됩니다.

우리는 이 기술이 제대로 수행되면 80시간 안에 완료할 수 있다는 것을 발견했습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 분리 직후 새로 분리된 조절 T 세포를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 개발 이후, 이 기술은 의학 분야의 연구자들이 만성 염증성 질환에서 조절 T 세포의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 조절 및 반응 T 세포 공동 배양 시스템을 사용하여 체외 조절 T 세포 억제 절차를 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.