Name: 표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 배우세요 만성 바이러스 감염 마우스에서 분리한 조절 T 세포의 표현형과 체외 억제 기능을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 면역 반응 조절 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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본 연구는 교육부 지원(2015R1A6A3A01020610)의 한국연구재단(NRF)의 기초과학연구사업과 대한민국 보건복지가족부 한국보건기술R&D사업(HI15C0493 to SJH)의 지원으로 이루어졌다.

본 연구에서는 마우스는 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 특정 병원균이없는 시설에서 유지 하였다. 모든 동물 실험은 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 국제 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 한국 식품 의약품 안전청 지침에 따라 실시 하였다. 솔루션 1. 준비 <ol><li> RPMI 1 % 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신에 소 태아 혈청 (FBS)을 희석하여 2 % RPMI 배지를 준비 </li><li> 전체 RPMI 미디어를 준비합니다. RPMI 미디어는 FBS의 10 %, 페니실린 - 스트렙토 마이신의 1 %, L- 글루타민의 1 %, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다. </li><li> 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 버퍼를 준비합니다. FBS의 2 %에 그래서, 보충 인산 완충 식염수 (PBS)를 수행합니다. </li><li> T 세포 분리 버퍼를 준비합니다. 이렇게하려면, FBS의 2 %, 2 MM의 ethylenediaminetetraa와 PBS를 보완cetic 산. </li></ol> 비장 림프구 2. 분리 <ol><li> 이전 19 설명 된 바와 같이 순진 또는 LCMV CL13에 감염된 마우스에서 비장을 제거하고 2 % RPMI 배지 10 ㎖를 포함하는 X 15mm 배양 접시 60mm에 배치합니다. 참고 :이 연구의 실험에서, 5 ~ 6 주령에 C57B1L / 6J 암컷 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사를 통해 LCMV CL13의 2 × 10 6 플라크 형성 단위 (PFU)를 받았다. 16 일 후 감염 (16 D 파이) (25)에 쥐를 희생. 분석 GE의 일치 순진 마우스는 같은 날이었다. </li><li> 50 ㎖의 튜브에 세포 여과기를 넣고 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 씻어. 70 μm의 셀 스트레이너에 비장를 놓고 주사기의 플런저를 사용하여 분쇄. 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 셀 스트레이너를 씻어 50 ML 튜브에서 제거합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 뜨는을 취소하고를 재현 탁ACK 용균 완충액 1 ㎖의 세포 펠렛. 5 분 동안 실온 (RT)에서 샘플을 인큐베이션. 참고 : 위의 표시 ACK 용균 버퍼의 볼륨이 하나의 비장입니다. 풀링 비장 샘플 따라 볼륨을 확장 할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 1 × 107 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. 참고 : 트리 판 블루 만 혈구를 사용하여 염색되지 않은 세포를 살고 카운트 라이브 셀 카운팅, 얼룩 세포하십시오. </li></ol> 지라 기존의 T (T의 전환) 세포와 T의 등록 세포의 3 표현형 참고 : T의 등록 세포 분리하기 전에 다양한 항체와 세포를 염색 및 유동 세포 계측법에 의해을 분석하여 순진하거나 감염된 마우스에서 분리 된 비장 림프구의 표현형을 검사합니다. <ol><li> 세포의 50 μl를 전송새로운 U 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 전체 비장 림프구 중 (5 × 105 세포) 및 웰 당 FACS 완충액 150 μL를 추가한다. 4 ℃에서 2 분 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 세포 펠렛을 선동하고 잘 당 FACS 버퍼의 200 μl를 추가합니다. 4 ° C (2 회)에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 다음 항체 및 시약 잘 당 FACS 버퍼의 50 μL에 염색 세포 표면 마커에 대한 항체 칵테일을 준비합니다. 안티 CD4 보라색 염료, 항 CD25 녹색 염료, 항 PD-1 바이올렛 염료 항 CD8를 PerCP-Cy5.5 염료 및 세포 생존 검출 시약 근적외선 (IR​​) 형광 반응성 염료. 주 : 상기 활성화 된 T 등록 세포의 표현형을 분석은 항 CD103 (23, 25)은 세포 표면 마커 염색을 첨가 할 수있다. </li><li> 웰 당 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 로 두 번 세포를 씻으4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 FACS 버퍼입니다. </li><li> 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 가만히 따르다 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 제조 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 (제조사의 프로토콜에 따라 제조)을 permeabilization 세척 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> Foxp3의 세포 내 염색 용 항체 용액을 제조하고, 반대로 Foxp3의 항체 용액 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 주 : 상기 항 CTLA이 단계에서 첨가 될 수있다 T 전환율 및 T의 등록 세포의 표현형을 분석. </li><li> 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어 및 단계 3.6를 반복합니다. 최종 세척 단계 후, FACS 완충액 200 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계수기 (25)에 의해 세포의 표현형을 조사한다. </li><li> 게이트 살아있는 세포의 popula기. CD4 + 또는 CD8 + T 세포 중에서 PD-1 + 세포 - LCMV CL13 감염 동안 전환율 T 세포의 표현형 분석을 위해 Foxp3의 빈도를 조사한다. 주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 비율 - PD-1 +는 LCMV CL13 16 D 파이에서 CD4 + 및 CD8 + T 세포 집단을 모두 50 % 이상이다. <ol><li> T의 등록 셀의 주파수 및 표현형을 분석, CD4 + T 세포 사이 Foxp3의 + 또는 + Foxp3의 PD-1 + 세포의 빈도를 조사한다. 주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 + 또는 + Foxp3의 PD-1 + 세포의 비율은 각각, CD4 + T 세포 집단에서 20 % 이상이다. </li></ol></li></ol> CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 4. 분리 참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된위한1 × 10 (7) 총 비장 세포의 세포 수를 시작. <ol><li> 순진하고 LCMV 만성적으로 감염된 마우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 격리 완충액 10 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 자기 세포 분리 장치를 사용하여 CD4 + T 세포 농축을 위해, 바이오틴 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 버퍼의 30 μL, 비 CD4 + T 세포의 라벨링에 대한 안티 - 비오틴 마이크로 비드의 20 μL와 CD25 + 세포의 형광 라벨에 대한 CD25-PE 항체의 10 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 어둠 속에서 15 분 동안 품어. </li><li> 완충액 2 ㎖를 첨가하고 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 새로운 50 ㎖ 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 셀을 통과한다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻으십시오.완전히 뜨는을 취소하고 최대 1.25 × 10 (8) 세포의 밀도로 500 μL 버퍼에 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 버퍼와 원심 분리기 2 ㎖를 추가하여 열을 씻으십시오. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 90 μL에 고립 된 CD4 + T 세포를 재현 탁. </li><li> CD25 + 세포의 자기 표시를 들어, 안티 - PE 마이크로 비즈의 10 μl를 추가 잘 혼합, 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 품어. </li><li> 버퍼 2 ㎖를 추가하고 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻는다. 완전하게 상층 액을 제거하고 최대 1 × 108 세포의 밀도로 완충액 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> CD4 + CD25 + T의 등록 세포를 풍부하게하기 위해, 긍정적 인 선택을위한 칼럼에 세포를 적용하고, 콜 럼을 씻어완충액 2 ㎖를 첨가하여 N. 세탁 세 번 반복합니다. </li><li> 열이 최종 세척 단계 후 비면 컬럼 상 완충액 1 mL를 넣어 자화 표지 CD4 + CD25 +, 플런저를 사용하여 세포 플러시. </li><li> 반복 고립 된 CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 순도를 향상시키기 위해 4.8-4.9 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 2 × 106 세포 / ml의 농도로 격리 CD4 + CD25 + T에 등록 세포를 재현 탁. </li><li> 단리-CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 순도를 확인하려면 총 격리-CD4 + CD25 + T의 등록 세포에서 2 × 10 5 세포를 사용합니다. FACS 완충액 50 μL 안티 CD4 FITC를 함유 세포 생존율이 거의 IR 형광 반응성 염료 시약을 검출하여 세포를 염색. 참고 : CD25는 이미 분리시 PE로 표지 하였다. </li><li> 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의해 순도를 확인한다. </li><li> 게이트 라이브 세포 인구. T의 등록 세포의 순도를 분석, CD4 + CD25 + 세포의 비율을 확인. 주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD4 + CD25 + 세포의 비율은 약 80 % 이상이다. </li></ol> CD8 + T 세포와 CD8 + T 세포의 라벨링 5. 분리 참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된 1 × 10 (7) 총 비장의 시작 세포 수에 대한 것입니다. <ol><li> 순진 마​​우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 분리 버프 10 ㎖를 첨가하여 세포를 씻어어. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 폐기하고, 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 자기 세포 분리 시스템을 사용하는 CD8 + T 세포의 분리를 위해, 비 CD8 + T 세포 비오틴 표지 용 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 5 분 동안 품어. </li><li> 버퍼의 30 μL 및 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. 잘 믹스 4 °​​ C에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 버퍼 세번 2ml를 첨가하여 열을 씻는다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼 2 ㎖에 고립 된 CD8 + T 세포를 재현 탁. </li><li> 분리 된 세포의 순도를 확인하려면, FACS 버퍼에 항체 용액 50 μl를 준비합니다. 절연 CD8 + T의 CEL 중에서 2 × 105 세포를 재현 탁항체 용액 50 μL에 LS. 참고 : 안티 - CD8 FITC 추가, 항체 용액을 제조하고, 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료) FACS 버퍼로합니다. </li><li> 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 유세포 분류법으로 세포의 순도를 확인한다. </li><li> 게이트 라이브 세포 인구. CD8 + T 세포의 순도를 확인하기 위해, CD8 + T 세포의 비율을 확인. 주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD8 + 세포의 비율은 약 90 % 이상이다. </li><li> 격리 된 CD8 + T 세포에 PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. PBS에 1 × 107 세포 / ml의 농도로 단리 CD8 + T 세포를 재현 탁. </li><li> CD8 + T 가전에 레이블을 지정하려면시험 관내 억제의 분석을위한 LLS은 RT에서 5 μM의 농도를 얻기 위해 PBS에 세포 증식 추적 바이올렛 염료 희석. 참고 : 본 연구에 사용 된 세포 증식 추적 바이올렛 염료의 대략 여기 및 발광 피크는 각각 405 및 450 나노 미터이다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 세포 증식 추적 보라색 염료 (5 μM) 세포 현탁액 (CD8 + T 세포를 1 × 107 세포 / ml)의 균등 한 양을 혼합하고 37 ° C에서 20 분간 인큐베이팅 하였다. 튜브마다 10 분을 소용돌이. </li><li> 감기 전체 RPMI 미디어와 튜브를 입력하고 실온에서 10 분 동안 튜브를 둡니다. 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전하게 상층 액을 제거하고 예열 된 완전한 RPMI 배지로 2 × 106 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. RT에서 15 분 동안 세포를 인큐베이션. </li></ol> 6. CD4 + CD25 + T를 &lt;사용하여 체외 억제 분석 설정서브&gt; 등록 번호 및 CD8 + T 세포 <ol><li> 항 CD3 / CD28 코팅 구슬을 준비하려면, 관의 15 ㎖ (2.5 μL / 1 × 10 5 세포)에 자석 구슬의 적절한 볼륨을 전송합니다. PBS의 동일한 볼륨을 추가하고 혼합한다. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세척하고 상층 액을 버린다. 전체 미디어의 자기 구슬을 (50 μL / 웰) 희석. </li><li> CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 나누어지는 50 μL U-바닥 96 웰 플레이트의 웰 당 (1 × 10 5 세포 / 웰). 응답자 T (T의 RESP)와 같은 CD8 + T 세포 세포 물론 당 (1 × 10 5 세포 / 웰)의 50 μl를 추가합니다. 물론 당에 희석 항 CD3 / CD28 코팅 구슬의 50 μl를 추가합니다. 참고 : 다음과 같이 제어 우물을 설정할이 단계, 레이블 및 : 없음 항 CD3 / CD28 코팅 구슬 &quot;만 자극되지 CD8 + T 세포를&quot;; &quot;CD8 + T 세포 만&quot;항 CD3 / CD28 코팅 구슬; &quot;CD8 + T 세포 만&quot;항 CD3 / CD28 코팅 구슬;&quot;. T의 등록 세포 만 &quot;항 CD3이 / CD28 코팅 구슬 T의 등록 세포는 T의 서로 다른 비율로 전체 미디어와 공동 배양 T의 인공 호흡기 세포에 의해 희석 될 수있다 RESP 세포 : T 세포의 레지 (1 : 0.25-1 : 1). </li><li> 200 μL의 총 부피에 대한 모든 우물에 50 μL 또는 미디어의 적절한 볼륨을 추가합니다. 호일로 접시를 덮고 72 시간 동안 37 ° C에서 CO 2 배양기에서 배양한다. </li></ol> CD8 + T 세포 7. 분석 CD8의 + T 세포 증식 및 사이토 카인 생산 <ol><li> 사이토 카인 생산 분석을 위해, 문화 3 일 후, 물론 다른 플레이트에 각각의 상층 액을 분리하여 효소 면역 분석법 (ELISA)을 수행합니다. 주 : 상등액을 분취하고 -70 ℃에서 저장 될 수있다. 이 실험에서, 항 마우스 IFN-γ 항체 - 코팅 된 플레이트는 IFN-γ 생산 일치를 검출하는 데 사용제조 업체의 프로토콜에 보내고. 단일 세포 수준에서 CD8 + T 세포 증식의 IFN-γ 생산을 결정하기 위해, 세포 내 사이토 카인 염색법을 행할 수있다. </li><li> 각 우물에서 뜨는을 분리 한 후, 4 ° C (3 회)에서 2 분 동안 300 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기로 세포를 포함하는 접시를 씻으십시오. </li><li> 세척 후, 상층 액을 버린다. 증식 된 CD8 + T 세포의 염색 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 참고 : FACS 버퍼에 방지 CD4 FITC, 안티 - CD8를 PerCP-Cy5.5 및 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료)를 추가, 항체 칵테일을 준비합니다. 참고 사항 : CD44 또는 CD69 각종 마커에 대한 항체는 CD8 + T 세포의 활성화를 확인하는 다른 항체와 결합 될 수있다. CD8 + T 세포가 이미 증식 추적 V로 표지 된 기억단계 5.10에서 iolet 염료. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 제거하고, 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. FACS 완충액 200 μL로 세포를 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의한 세포 증식 추적 바이올렛 염료 표지 된 CD8 + T 세포의 증식을 측정한다. <ol><li> 게이트 생균 중 CD8 + T 세포 집단. 세포 증식 추적 바이올렛 염료 및하기 식에있어서 CD8 + T 세포 희석액의 희석에 따른 분할 전적인 세포의 비율을 측정한다. 억제 % = [(T의 등록 세포의 부재하에 증식 된 CD8 + T 세포의 % - T에 등록 세포의 존재 하에서 증식 된 CD8 + T 세포의 %) / (%에서 증식 된 CD8 + T 세포T 세포의 등록의 유무)] X (100)는 또한 소프트웨어 (25) 유동 세포 계측법을 사용하여 데이터를 분석한다. </li></ol></li></ol>

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<li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+infection+with+respiratory+syncytial+virus+impairs+regulatory+T+cell+function+and+increases+susceptibility+to+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma.</a> Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).</li>
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<li>Tai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basis+of+CTLA-4+function+in+regulatory+and+conventional+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells.</a> Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).</li>
<li>Rushbrook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+suppress+in+vitro+proliferation+of+virus-specific+CD8%2B+T+cells+during+persistent+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).</li>
<li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+orphan+receptor+Nr4a2+induces+Foxp3+and+regulates+differentiation+of+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22T+cells.+Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4.</a> T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).</li>
<li>Merianos, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li>
<li>Allakhverdi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD103+identifies+human+regulatory+T-cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets.</a> J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).</li>
<li>Camisaschi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAG-3+expression+defines+a+subset+of+CD4%28%2B%29CD25%28high%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+that+are+expanded+at+tumor+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites.</a> J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li>
<li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5%2B+natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li>
</ol>

S.-JH는 특허를 보유하고 있으며 PD-1 경로와 관련된 특허 로열티를 받습니다. 다른 저자들은 재정적 이해 상충이 없습니다.

T 세포의 레지 단지 소수 쥐와 인간에서 존재하지만, 그들은 면역 반응을 조절하고 면역 관용을 유지하는데 중요한 역할을 그들의 기능을 이해하는 것이 중요하다. T의 수와 억제 기능은 만성 바이러스 감염 15-20뿐만 아니라 암의 진행 도중 13,14 세포 증가 REG. 이것은 아마도 계속 항원 자극에 기인한다. 레지 세포 항원 지속성 및 질병 개발 함수 T를 평가하기 위해, 자신의 억제 활성을 측정 할 필요가있다. 여기서는 T에 등록 세포의 생체 표현형 분석 및 CD8 + T 세포와 T에 등록 세포의 시험 관내 공동 배양 시스템을 사용하여 억제 활성을 측정하는 프로토콜을 기술한다. 현재 프로토콜의 중요한 단계는 분석 및 T의 등록 세포의 분리이다. 라이브 갓 절연 T <...

규제 T (T의 REG) 세포는 개발 및 기능 1 전사 인자로 forkhead 상자 P3 (Foxp3의)을 표현한다. 또한, T의 등록 세포는 CD25이 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3) (3), 글루코 코르티코이드 - 유도 된 종양 괴사 인자 수용체 (4) 및 세포 독성과 같은 다양한 분자를 발현 T 림프구 회합 단백질 4 (CTLA-4) (5) 그 표면 또는 세포 내 영역에. 바이러스 6,7, 8,9 박테리아, 기생충 10-12 또는 암 13,14 개발 과정에서 병원체 각종 만성 감염 동안 T에 등록 셀은 향상된 억제 기능을 표시 활성화 세포로 분화 될 대상 이펙터 CD4 +와 CD8 + T 세포. 많은 논문 확장 활성화 T에 등록 세포가 손상된 CD8 + T 세포 응 답에 기여한다고 제안했다친구 레트로 바이러스 (FV) 감염 15 ~ 17시 전자. FV 유발 T에 등록 셀은 IFN-γ 또는 그랜 자임 B 발현 및 CD8 + T 세포의 세포 독성 15-17 반응성을 억제한다. 또한, 단순 포진 바이러스 감염 모델에서, 이는 바이러스 - 특이적인 CD8 + T 세포 및 immunopathogenic CD4 + T 세포를 18-20의 침윤 심각한 조직 손상의 확대 결과 CD4 + CD25 + T에 등록 세포의 고갈을보고 하였다. 림프 구성 맥락 수막염 바이러스의 복제 13 균주 만성적으로 감염된 마우스 (LCMV CL13) 21-24 널리 만성 바이러스 감염 동안 효과기 T 세포 (T의 EFF) 및 T의 등록 세포의 표현형 및 기능을 특성화하는데 사용되어왔다. 영구 LCMV 감염시 바이러스 관련 T EFF의 세포는 점차적으로 자신의 이펙터 기능을 잃고 지쳐 T (T의 배기) 세포가된다. 한편, T에서레지 세포는 바이러스 특이 적 T 세포 반응 (25)을 억제하는 능력을 강화한다. T 개의 EFF 셀의 작동 능력의 감소는 이러한 T EFF 세포 억제 성 수용체의 상향 조절, 항원 제시 세포의 변경 기능, 면역 조절 사이토 카인의 생산 및 증가 된 주파수 또는 T의 등록 향상된 기능 등 여러 가지 요인들에 의해 설명 될 수있다 세포 26. T 세포 억제에 관여하는 요소 중에서, 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1) 발현 T의 배기 세포와 T에 등록 세포 널리 항원 지속성 및 억제 환경의 특징으로 간주되어왔다. 최근에는 T의 등록 셀의 PD-1 경로의 폐색 및 제거를 향상 T 세포의 기능을 야기한다는보고 LCMV 만성 감염시 바이러스로드 (27)가 감소 하였다. 또한, T의 등록 세포는 LCMV (23, 25)와 쥐의 만성 감염시 활성화 </s업&gt;과 억제 기능 (25)을 강화한다. PD-1은 높은 T에 등록 세포뿐 아니라 T의 배기 세포 발현되며, PD-1 T에 등록 세포에 의해 발현 수준은 T 세포의 증식 (25)을 억제하는 그들의 억제 기능의 강도와 상관 관계. 여기서는 LCMV CL13 및 나이브 마우스로부터 단리 휴지 T에 등록 세포 감염 쥐로부터 분리 활성화 T 등록 세포의 특성을 비교하는 방법을 설명한다. 더욱이, 우리는 활성화 된 T 세포의 레지 분리 및 표현형 생체 검사뿐만 아니라 시험 관내에서의 억제 활성을 측정하기위한 일련의 처리를 설명한다.

<table><tbody><tr><td>FITC 쥐 안티 마우스 CD4</td><td>RM4-5</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td></tr><tr><td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>353077</td></tr><tr><td>고정 완충액</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td></tr><tr><td>FITC 쥐 안티 마우스 CD25</td><td>7D4</td><td>BD Biosciences</td><td>553072</td></tr><tr><td>세포 여과기, 70 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td></tr><tr><td>세포 여과기, 40 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)</td><td>29F.1A12</td><td>BioLegend</td><td>135217</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td><td>RM4-5</td><td>Biolegend</td><td>100547</td></tr><tr><td>APC Anti-Mouse/Rat Foxp3&nbsp;</td><td>FJK-16s</td><td>eBioscience</td><td>17-5773</td></tr><tr><td>Foxp3/전사 인자 염색 완충액 세트</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-5223</td></tr><tr><td>PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a</td><td>53-6.7</td><td>eBiosicence</td><td>45-0081</td></tr><tr><td>마우스 IFN-gamma Platinum ELISA</td><td></td><td>eBiosicence</td><td>BMS606</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td>GE 생명 과학</td><td>SH30256</td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td></td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td></tr><tr><td>L-글루타민, 200 mM 용액</td><td></td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25030</td></tr>년<tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 10,000 U/ml</td><td></td><td>Gibco&nbsp;</td><td>제10378-016</td></tr>호<tr><td>LIVE/DEAD 고정성 근적외선 데드 셀 염색 키트</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>L-34975</td></tr><tr><td>CD8a+ T 세포 분리 키트, 마우스</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-104-075</td></tr><tr><td>CD4+ CD25+ 조절 T 세포 분리 키트, 마우스</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-091-041</td></tr><tr><td>MACS 분리 컬럼, LD 컬럼</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-901</td></tr><tr><td>MACS 분리 컬럼, LS 컬럼</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-401</td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M (pH 8.0)</td><td></td><td>Promega</td><td>V4231</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td></td><td>Sigma Life Science</td><td>M7522</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30919.03</td></tr><tr><td>CellTrace 바이올렛 세포 증식 키트</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34557</td></tr><tr><td>BD Canto II 유세포계</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td></td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>혈구분석기</td><td></td><td>Marienfeld superior</td><td></td></tr></tbody></table>

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 t 세포의 기능 분석

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

전사 인자로서 Foxp3를 표현 규제 T (T의 REG) 세포, CD4 + T 세포의 서브 세트이다. T의 등록 세포는 면역 반응을 조절함으로써 면역 관용과 항상성 유지에 중요한 역할을한다. T의 등록 세포의 주요 역할은 효과기 T (T의 EFF) 세포의 증식 및 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2와 같은 사이토 카인의 생성을 억제하는 것이다. EFF는 T 세포의 기능을 억제하는 T 세포의 레지 능력 영구 병원체 감염, 암 개발 중에 향상된 것이 증명되었다. 휴식 또는 염증 상태에서 T 세포에 등록하는 기능, 마우스 또는 인간 T 등록 세포를 이용한 시험 관내 억제 분석 다양한 고안되었다을 명확히한다. 본 연구의 주된 목적 표현형과 휴식 사이 억제 기능의 차이와 활성화 T의 등록과 비교하는 방법을 개발하는 것이다세포. 활성화 된 T 레지 세포를 분리하기 위해, 마우스, 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 클론 13 (CL13)을 LCMV 만성 피로를 감염시켰다. LCMV CL13 감염된 마우스의 비장으로부터 분리 된 T 세포는 등록 나이브 마우스로부터 단리 된 T 세포를 등록 쉬고 비하여 활성화 된 표현형 향상된 억제 활성을 모두 나타내었다. 여기서는 등록 된 T 세포 휴식에서 활성화 된 T 세포를 등록 구별 생체 표현형 분석을위한 기본 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 우리는 완전히 활성화 T에 등록 세포의 억제 활성의 측정을위한 프로토콜을 기술한다.

우리는 정맥 LCMV CL13의 2 × 10 6 PFU로 주입함으로써 지속적인 바이러스 감염 쥐를 생성합니다. T의 등록 세포 및 만성 바이러스 감염시 T 전환 세포의 표현형 변화를 조사하기 위해, 순진 감염된 마우스에서 얻은 비장 림프구는 다양한 항체로 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. CD4 + T의 전환 (그림 1A, 상단 패널)와 Foxp3의 - - CD8 + T의 전환 (그림 1B, 상단 패널) 셀 (16) 라 파이에서, PD-1은 Foxp3를 모두 상향 조절했다. Foxp3의 + CD4 + T 세포의 레지의 주파수는 나이브 마우스 (도 1...

여기에서는 바이러스에 감염된 미성숙한 림프구성 융모수막염 마우스에서 분리된 조절 T(Treg) 세포의 표현형을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한, Treg cell의 억제 활성을 평가하는 프로세스를 제공합니다.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

본 절차의 전반적인 목적은 만성 바이러스 감염 마우스에서 분리한 조절 T 세포의 인 비트로(in vitro) 억제 기능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 만성 바이러스 감염 동안 활성화된 조절 T 세포의 표현형과 인 비트로 억제 기능에 관한 의문점을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 인 비트로에서 T 세포에 양성 반응을 보이는 개체에 대한 조절 T 세포의 직접적인 효과를 평가할 수 있습니다.이는 이 기술의 큰 장점입니다. 먼저 새로운 U형 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 µL의 FACS 버퍼에 희석된 5 × 10⁵개의 총 비장 림프구를 옮긴 후, 150 µL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 플레이트를 원심 분리하고 상층액을 제거하십시오.그런 다음 세포 펠릿을 교반하고 웰당 200 µL의 facs buffer로 세포를 두 번 더 세척합니다. 두 번째 세척 후, 4 °C의 암소에서 20분 동안 웰당 50 µL의 항체 칵테일로 펠릿을 재부유시킵니다. 그 후 facs buffer로 세포를 두 번 세척하고 상층액을 제거합니다.다음으로, 100 µL의 고정 버퍼를 사용하여 4°C의 암조건에서 20분 동안 세포를 고정하고, 투과성 세척 버퍼로 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 세포를 50 µL의 anti-FOXP3 항체에 재현탁합니다. anti-CD3 CD28 코팅 비드를 준비하려면, 적절한 부피의 자성 비드를 15 mL 튜브로 옮기고 동일한 부피의 PPS를 추가합니다.피펫팅으로 용액을 부드럽게 섞고, 자성 비드를 원심분리합니다. 세척 단계가 끝나면 상층액을 제거하고, 웰당 50 µL의 완전 배지로 비드를 희석합니다. 다음으로, 96웰 U-bottom 플레이트에 웰당 1×10⁵개의 CD4+ CD25+ 조절 T 세포 50 µL를 분주한 후, 웰당 1×10⁵개의 CD8+ 반응 T 세포 50 µL를 이어서 분주합니다.모든 세포의 분주가 완료되면, 희석된 anti CD3 CD28 코팅 비드 50 microliters를 각 웰에 추가하고, 각 웰의 총 부피가 200 microliters가 되도록 배지를 최대 50 microliters까지 추가합니다. 그 다음 플레이트를 호일로 덮고 37 degrees Celsius의 이산화탄소 배양기에 72시간 동안 보관합니다. CD8 양성 T 세포의 사이토카인 생성을 분석하려면, 3일간의 배양 후 상층액을 다른 96 웰 플레이트로 옮기고 제조사의 지침에 따라 ELISA로 상층액을 분석합니다.CD8 양성 T 세포의 증식을 분석하려면, 세포가 담긴 플레이트를 facs buffer로 세 번 세척하십시오. 그 다음, 펠렛을 증식된 CD8 양성 T 세포에 적합한 항체 칵테일 50 µL에 재현탁하여 4 °C의 암소에서 20분 동안 반응시킵니다. 배양이 끝나면, 세포를 facs buffer로 두 번 세척하고 fixation buffer 100 µL를 사용하여 4 °C의 암소에서 20분 동안 고정하십시오.마지막으로, FACS 버퍼로 세포를 두 번 더 세척하고 펠렛을 200 µL의 FACS 버퍼에 다시 현탁합니다. 그 후 유세포 분석법을 통해 phylate di-labeled CD8 양성 T 세포 증식 비율을 측정합니다. 미감염 및 감염된 마우스에서 얻은 비장 림프구의 경우, LCMV clone 13에 감염된 마우스의 일반적인 FOXP3 음성 CD4 양성 세포와 FOXP3 음성 CD8 양성 세포 모두에서 PD-1이 특이적으로 상향 조절됩니다.LCMV clone 13에 감염된 마우스에서는 나이브 마우스보다 FOXP3 양성 CD4 양성 조절 T 세포의 빈도가 2배 더 높게 나타나며, FOXP3 양성 CD4 양성 세포의 대부분은 활성화된 PD-1 high 표현형을 동시에 보입니다. CD8 양성 반응 T 세포는 다른 면역 세포의 상당한 오염 없이 성공적으로 분리될 수 있습니다. 조절 T 세포 분리 후, 80% 이상의 순도로 CD25 양성 CD4 양성 T 세포의 우세한 집단을 얻을 수 있습니다.anti CD3 CD28 코팅 비드로 분리된 조절 T 세포와 반응 T 세포를 자극하면 CD8 양성 반응 T 세포의 억제가 용량 의존적 방식으로 나타납니다. 실제로 CD8 양성 반응 T 세포를 만성 조절 T 세포와 1:1 비율로 공동 배양했을 때, CD8 양성 반응 T 세포의 증식이 유의하게 억제되었습니다. 또한, 나이브 마우스의 휴지기 조절 T 세포와 공동 배양했을 때와 비교하여, 만성 감염 마우스의 활성화된 조절 T 세포와 CD8 양성 반응 T 세포를 공동 배양했을 때 CD8 양성 반응 세포의 Interferon gamma 생성이 유의하게 억제되었습니다.본 기법을 적절하게 수행한다면 80시간 이내에 완료할 수 있음을 확인하였습니다. 이 절차를 시도할 때, 분리 직후의 신선한 조절 T 세포를 사용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이러한 발전을 통해, 본 기법은 의학 분야의 연구자들이 만성 염증성 질환에서 조절 T 세포의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청하신 후에는 조절 T 세포와 반응 T 세포의 공배양 시스템을 사용하여 인 비트로(in vitro) 조절 T 세포 억제 실험 절차를 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T - 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을...

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

우리는 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 분비의 조절에 면역 경로의 역할을 조사하기 위해 시험 관내 분석을 개발 하였다.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

많은 실험 시스템은 면역 반응의 T 세포의 발달 및 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하는 데에 이용되고있다. 여기 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전 적 접근 경로를 규정하는 식별 경제적 시간 효율적이고, 무엇보다도 매우 유익하다 설명한다.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

이 논문은 인플루엔자 바이러스 감염의 마우스 모형에 있는 Tfh 및 GC B 반응을 평가하는 프로토콜을 기술합니다.

인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

이 연구는 표피(EC) 면역을 통해 생쥐의 면역 반응을 조절하는 피부의 역할을 보여줍니다. 단백질 항원을 사용한 EC 면역은 병원체 관련 분자 패턴과 결합할 때 접촉 과민증 또는 피부 유도 억제에서 면역 반응을 억제할 수 있습니다. EC 면역은 면역 요법에 대한 효과적이고 주사 바늘이 없는 접근 방식으로서 가능성을 보여줍니다.

표피 유도 면역조절의 쥐 모델(Murine Model of Epicutanely-Induced Immunomodulation)

이 프로토콜은 조절 T 세포가 이펙터 T 세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 조사하기 위한 시험관 내 공동 배양 전략을 제공합니다.

시험관 내 조절 T 세포의 기능 분석: 증식과 분화에 초점을 맞춘다

배우세요 만성 바이러스 감염 마우스에서 분리한 조절 T 세포의 표현형과 체외 억제 기능을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 면역 반응 조절 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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