Name: 쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 쥐 배아 조직에서 혈원성 내피 세포와 조혈 줄기세포를 FACS를 이용해 분리하는 방법을. 이 기술은 생존 세포의 신뢰할 수 있는 분리를 가능하게 하여 후속 분석과 배양에 활용됩니다.

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

윤리 정책 아래에 설명 된 프로토콜을 검토하고, 예일 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 가이드 라인을 준수하고있다. 1. 항목의 배아 노 른 골목 연구 전 V IVO 문화 (선택 사항) <ol><li> E7.0에서 임신 댐을 안락사 - E7.5과 (2.4 단계 - 2.7)보다 더 상세하게 설명 된 바와 같이, 무균 조건 하에서 자궁 뿔을 제거합니다. </li><li> 별도의 전체 주변 탈락에서 (난황 (12)을 그대로 포함) 배아, 50 ml의 폴리스티렌 튜브에 50 ㎖ 전체 쥐의 혈청에서 일시 중지합니다. </li><li> 5 % CO 2와 3 분 가스 배아 병은 바로 앞서 12, 18, ​​20, 22을 설명했다. 48 시간 - 24에 대한 배아를 배양하는 경우 24 시간에서이 단계를 반복합니다. </li><li> 최대 48 시간 동안 37 ℃로 문화를 압연에 품어. 주 : 배아 (약리학 적 약제와 생체 외 치료 될 수있는, 즉 노치 억제제 DAP.T 12) 또는 수용성 단백질 (즉, 같은 요소를 포함하는 배지에서 최대 2 시간 동안 배아 전 배양을 통하여 피브로넥틴 19) 또는 생체 외에서 배양의 전체 길이에 대한 롤링 배지에 이들 인자를 첨가 내지 기간. 유전자 발현은 2 시간 12 최적 렌티 바이러스 역가 배아 프리 인큐베이션 배아 조작 할 수있다. 난황 혈관 및 조혈 개발은 트랜스 제닉 리포터 생쥐 광학 이미징 기술을 이용하여 실시간으로 모니터링 할 수있다. </li></ol> 마우스 배아에서 노 른 골목 (YS) 또는 대동맥 - 생식선 - mesonephros (AGM) 2. 해부 <ol><li> 살포 이후 세포 배양 물에 오염을 감소시키기 위해 70 % 에탄올에 모든 표면을 닦아 실험실 벤치를 소독. 실험실 벤치 표면에 흡수 underpad를 놓습니다. </li><li> 70 % 에탄올과 수술 도구를 소독. 추천 수술 도구는 두 개의 # 5 직선 힘이다추신, 한 8.5 cm 직선 위. </li><li> 체외 배양에서 배아로 작업하는 경우,주의 50 ㎖ 팔콘 튜브에서 전체 배아를 제거하고 2.8 단계로 바로 진행합니다. 그렇지 않으면,이 단계를 건너 뛰고 2.4 단계로 진행합니다. </li><li> 적절한 배아 나이에 임신 댐을 안락사 (E8.5 경우 수확 YS, E10.5 수확 AGM 경우). 참고 : 설명 된 기술은 듀얼 방식 안락사 방식 채택 - 기계 자궁 경부 전위 다음에 휘발성 마취제의 치명적인 복용량 - 동물의 고통과 고통을 최소화하기 위해, 동물 과목의 최소 침습 및 인도 종료를 보장합니다. 훈련과 숙련 된 조사원 (2013 판 동물의 안락사에 대한 AVMA 지침)에 의해 수행 할 때 작은 설치류의 안락사에 대한이 결합 된 기술은 미국 수의학 협회가 권장됩니다. <ol><li> 5 분 - 3 이소 플루 란의 치사량 (&gt; O이 5 %)를 사용하여 마우스를 마취. (CAUTION : 아이소 플루 란은 독성 흡입이다 적절한 호흡 개인 보호 장비와 화학 물질 흄 후드를 사용합니다.) </li><li> 바로 잡고 반사 손실, 발가락 핀치 반사 손실, 호흡 속도의 감소 - - 이소 플루 란에 쥐의 노출 후, 마취 수준의 적어도 세 가지 징후 확인 과목을 보장하기 위해 기계적 안락사를 진행하기에 앞서 깊은 마취 비행기를 달성했다. </li><li> Cervically 신속하게 죽음을 유도하기 위해 댐을 탈구. </li></ol></li><li> underpad에 안락사 댐 부정사를 놓고 자유롭게 70 % 에탄올로 복부를 스프레이. </li><li> 낮은 복부 벽의 중간 선을 따라 수직 절개를합니다. ~ 추가로 1 인치 수평 절개를 잘 수직 절개의 중간 지점에서 왼쪽으로 연장 확인하고 완전히 오른쪽과 왼쪽 자궁 뿔이 각각 포함 된 여러 gestating 배아를 노출하는 복벽을 멀리 해부하다. </li><li> 집게를 사용하여 두 자궁 뿔 중 하나를 보유그리고 mesometrium에서 분리 가위를 사용합니다. 60mm 폴리스티렌 조직 배양 접시에 무균 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에서 얼음에 절개 자궁을 놓습니다. 다른 자궁 경적을 반복합니다. </li><li> 표준 광 해부 현미경, 기본 임신 낭과 탈락을 나타 내기 위해 자궁 주머니의 근육 층을 멀리 당겨 집게를 사용합니다. 부드럽게 동봉 된 배아에서 주머니를 제거하여 YS (그림 2A)를 분리합니다. 난황 혈관의 배아 기원에서 적절한 배아에서 YS 조직을 제거합니다. </li><li> 주주 총회를 분리하려면 YS을 제거하고 심장과 앞다리의 수준 아래 배아를 가로로 쪼개다하고 흉부와 머리 영역을 폐기합니다. 다음으로, 그냥 뒷다리의 수준 이하로 배아를 가로로 쪼개다 및 제거하고 꼬리 조직을 폐기합니다. 주주 총회 (그림 2B)가 포함 된 나머지 섹션에서 뒷다리 과잉 복부 조직을 제거합니다. </li><li> 여러 개의 배아 및 저장소에서 풀 YS 또는 AGM 조직HBSS + 얼음에 깨끗한 1.5 ㎖의 튜브 (HBSS 10 % (v / v)의 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 0.3 ㎎ / ㎖의 L 글루타민). </li></ol> 단일 세포 현탁액에 기본 조직 3. 소화 <ol><li> 4 ° C에서 2,000 XG에서 5 분 동안 수확 YS 또는 AGM 조직을 포함하는 원심 분리기 튜브. </li><li> 1 ml의 하나 (YS 용) 0.05 % HBSS + 희석 콜라겐 타입 II (AGM에 대한) 0.2 %에 뜨는 및에 resuspend 조직을 제거합니다. 튜브를 혼합하는 매 5 분 반전 37 ° C의 물을 욕조에 30 분 동안 품어. </li><li> 부드럽게 기계적 P1000 피펫을 통해 샘플 10 번 전달하여 조직을 떼어 놓다. 어려움 부분적으로 소화 조직을 흡인을 갖는 경우, 피펫 팁 구멍은 가위로 끝 ~ 5mm를 절단하여 확대 될 수있다. </li><li> 4 ° C에서 2,000 XG에 5 분 원심 분리기 샘플. 1 ml의 얼음처럼 차가운 HBSS +에 뜨는 및에 resuspend를 제거합니다. </li><li> 70 &amp;를 통해 샘플을 전달# 956; m의 셀 스트레이너. </li><li> 수동 또는 자동 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 4 ° C에서 2,000 XG에 5 분 원심 분리기 샘플. DMEM에 재현 탁 샘플 + 사전 (4.5 g는 / L 글루코스 둘 베코 변형 이글 중간 10 % (v / v)의 소 태아 혈청, 100 U가 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 0.3 ㎎ / ㎖의 L 글루타민) 세포를 1 × 106 세포 / ml의 최종 농도이되도록 37 ℃로 가온. </li></ol> 찬란 복합 항체와 핵산 염료 및 라벨링과 세포의 4. 치료 <ol><li> 분취 항체 인큐베이션 신선한 1.5 ㎖의 튜브에 시료 100㎕ 이상 (1 × 105 세포). </li><li> 다음 샘플과 필요한 제어 튜브 포함 : 흠을; cKit-APC 만; CD45-FITC 만; CD31-PE 전용 Flk1 - PECy7 만; 훽스트 33342 만; 훽스트 33342 만 베라파밀을 +; 샘플 (모든 색상을 수신, 베라파밀을받을 수 없습니다). 1 × 최소 사용 <sup&gt; 제어 튜브 100 μl의 5 세포. 주 : 셀의 큰 볼륨 정렬 Hemogenic EC 및 HSPC의 수율을 최대화하기 위해 동일한 농도의 샘플 튜브에 첨가 될 수있다. </li><li> 베라파밀은 &quot;훽스트 33342 만 + 베라파밀&quot;50 μM의 최종 농도 제어 튜브에 95 % 에탄올 (이론적 근거에 대한 토론 참조)에 희석 추가. 37 ° C에서 5 분 동안 모든 튜브를 품어. (주의 : 베라파밀은 강력한 칼슘 채널 차단제이며 매우 독성이 장갑으로 처리합니다.). </li><li> 5 μg / ML의 최종 농도로 훽스트 33342 + 베라파밀 만 제어하려면 &quot;훽스트 33342 만&quot;컨트롤에 훽스트 33342를 추가하고 &quot;샘플&quot;관. 빛으로부터 보호 37 ° C에서 1 시간, 모든 튜브를 품어. 조심스럽게 15 분마다 반전시킴으로써 섞는다. (주의 : 훽스트 33342은 독성이 핵 염료와 장갑으로 취급한다). </li><li> 원심 분리기 모든 SAMP4 ° C에서 2,000 XG에 5 분 레. 상등액을 제거하고 차가운 HBSS + 1 × 105 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁 펠릿. </li><li> 2 μg / ML의 최종 농도를 적절한 항체 전용 제어 튜브 및 &quot;샘플&quot;튜브 형광 항체 컨쥬 게이트를 추가한다. 빛으로부터 보호 된 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 2,000 XG에 5 분 동안 모든 튜브. 상층 액을 제거하고 500 μL 얼음처럼 차가운 HBSS에 세포 펠렛을 재현 탁. 5 ml의 즉시 FACS에 대한 빛으로부터 보호 얼음에 둥근 바닥 폴리스티렌 FACS 튜브 및 저장, 메쉬 필터 캡을 통해 스트레인 샘플. </li></ol> FACS 5. 식별 및 Hemogenic 내피 세포의 분리 및 HSPC 주 :이 프로토콜은 100 MW 355 400nm의 자외선 레이저를 구비 한 BD FACSAria 5의 레이저 시스템, 200 MW 405 nm의 바이올렛 레이저, 200 MW 488 nm의 청색 레이저, 200 MW 532 나노 미터 녹색 레이저를 이용하여 최적화하고 있던 150 MW 637 nm의 레드원자 램프. 세포는 시스 액으로하고 무균 조건 하에서 멸균 PBS에 정렬되었고 샘플 압력 설정 유량 100㎛의 노즐을 통해 하나 1500의 최대되도록 - 2000 이벤트가 세포 스트레스를 최소화하기 위해 초당 취득한다. <ol><li> 상술 이러한 설정에서 FACS 셀 소터 레이저 강도를 최적화하고, 제조자의 지시에 따라 멀티 컬러의 스펙트럼 보정 제어를 수행하는 &quot;흠&quot;단일 색상 제어 튜브를 사용한다. (자세한 내용은 제조업체의 지침을 참조) 앞으로 사용 및 측면 산란 라이브 셀을 수행하고, 전체 사건에서 차별을 이중 항 수 있습니다. 참고 :이 프로토콜은 일반적으로 ~ 70 결과 - 80 % 가능한 세포. 문제는 낮은 세포 생존에 발생하는 경우, 조직은 처음에는 냉담한 미디어에 신속하게 해부하고 있는지 확인하고, 그렇지 않으면 지정을 제외한 모든 단계는 전단 및 세포 사망을 최소화하기 위해 부드러운 피펫으로, 얼음에서 수행되는(세포 생존 능력을 보존에 더 상세히에 대한 토론을 참조). </li><li> 측면 인구 (SP) 이벤트 (그림 3A)를 식별하기 위해 훽스트 블루 형광 대 헥스 레드 차동 선형 규모의 플롯을 사용합니다. 문이 제대로 샘플 그려되었는지 확인하기 위해 음성 대조군으로 &quot;훽스트 33342 만 + 베라파밀&quot;컨트롤을 사용합니다. SP는 비 SP 셀의 왼쪽 어깨로 나타나고 베라파밀 처리 제어가 감소 될 것이다. 비 SP 인구가 비 hemogenic EC (도 3b)을 식별하는 데 사용된다. </li><li> 추가 차동 형광 플롯 (로그 스케일 축)을 만들고 hemogenic 내피 세포 (그림 3C-E)를 식별 할 수있는 SP의 딸 게이트를 그립니다. 참고 : Hemogenic 내피 세포는 Flk1 + / cKit + / CD45- SP 세포 (그림 3D)으로 프로파일 및 HSPC는 Flk1- / cKit + / CD45 + SP 세포 (그림 3E)되어있다. Hemogenic 내피 다학습 학생은 CD31 + / CD45- 비 SP 세포 (도 3b) 등이 방법에서 식별 비 hemogenic 내피 세포와 병렬로 분석 될 수있다. </li><li> hemogenic 내피 세포 또는 HSPC 분획 조혈 문화 플레이트를 포함하는 메틸 상 (아래 참조), 또는 후속 처리 및 분석을위한 다른 버퍼로를 검색합니다. </li></ol> 문화 6. 조혈 차별화 <ol><li> 0.5 ㎖ (135 μL / cm 2)을 실온에서 24 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 원하는 번호 메틸 조혈 계의 배양 배지를 추가한다. 증발을 최소화하기 위해 사용하지 않는 우물에 0.5 ml의를 멸균 물을 추가합니다. 신선한 준비하고 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. </li><li> 정렬 1-10 세포 클론 분석을 위해, 또는 최대 1,000 hemogenic 내피 세포 (Flk1 + / cKit + / CD45- SP 세포)의 각 웰에 직접 일괄 확장과 분화 또는 HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP 세포)판 메틸 셀룰로오스를 포함. 20 % - 콜로니 형성은 약 10에서 검출된다. </li><li> 거품의 생성을 방지하기 위해주의하면서, 3 회 - 무균 조직 배양 후드에서 부드럽게 시드 메틸 미디어의 2를 각각 잘 재현 탁하기 위해, 그 구멍을 넓혀 손질 팁과 P1000 팁을 사용합니다. 이것은 최적의 성장을위한 반고체 메틸 셀룰로오스로 분류 세포 현탁액을 보장합니다. </li><li> 최대 2 주 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 시간이 지남에 따라 차별화 된 조혈 세포 집락 형성 (그림 4)에 대한 단일 세포 배양을 모니터링합니다. 일 1, 3, 7시에 번호와 차별화 된 조혈 식민지의 유형에 대한 우물을 점수 및 단계 6.7에서 아래에 설명 된 방법 (들)에 의해 14. <ol><li> 1 일에 점수 판은 정렬 된 세포의 포화 상태와 지속적인 생존을 확인합니다. </li><li> 3 일으로, &quot;시대에 부착 hemogenic 내피 세포 콜로니의 조기 형성을 확인톤 &quot;형태 (3 일 형태의 표현에 대한 골디 등. (11)와 마르셀로 등. 12 참조). </li><li> 일 5 - 7, 분류 hemogenic EC를 포함하는 우물에 둥근 HSPC 클러스터의 형성을 확인합니다. HSPC은 &quot;조약돌&quot;내피 세포 형태를 표시 hemogenic EC를 평평하게 인접 관찰해야한다. 참고 : Hemogenic 내피 세포 (조혈 식민지의 수에 의해 결정) 조혈 식민지를 형성해야하고, (단일 셀에서 여러 식민지 종류의 관찰에 의해 결정) 멀티 혈통 분화 능력을 입증해야한다. 우리는 이전에 FACS에 의해 검색 hemogenic EC 또는 HSPC의 20 %가 차별화 및 메틸 셀룰로오스 11 조혈 식민지를 증식 형성 생존 ~ 관찰했다. </li></ol></li><li> 위상 현미경에 의한 식민지 형성을 평가하기 : <ol><li> 시각화 및 낮은 배율 싶게에서 식민지를 계산골디 등의 알에 의해 설명 된대로 어 위상 광학 현미경, 그리고, 식민지 형태로 BFU-E, CFU-GM과 CFU-GEMM 식민지를 식별합니다. 11. </li></ol></li><li> 세포 형태에 의한 식민지 형성을 평가하기 : <ol><li> 말과 P1000 팁에 메틸 셀룰로오스 표면에서 대기음 개별 식민지 구멍을 넓혀 손질. 이 점성 메틸 매체의 흡입을 용이하게하고, 식민지의 성공적인 검색을 보장합니다. </li><li> 를 Resuspend 5 분 동안 28 XG에 cytocentrifuge를 사용하여 유리 슬라이드에 200 ml의 HBSS에 식민지 스핀을 들었다. </li><li> 5 분 동안 100 % 메탄올에 슬라이드를 수정 (주의 : 메탄올은 독성이 만 적절한 환기 및 개인 보호 장비와 화학 후드에서 사용되어야한다). </li><li> 20 분 (주의에 대해 0.04 % 김사 염색 슬라이드 잠수함 :. 김사 염색 메탄올이 포함되어 적절한 환기와 사람과 화학 후드에서 사용등 보호 장비). </li><li> 탈 이온수에 슬라이드를 씻어. </li><li> 마운트 고전 메틸 미디어에서 배양 성인 골수에서 조혈 세포에서 관찰 된 것과 세포 형태를 비교, 표준 광 현미경 고배율로 된 커버 및 이미지 슬라이드. 예를 들어, 제조업체의 지침을 참조하십시오. </li></ol></li><li> FACS에 의한 조혈 계통 마커의 세포 발현에 의해 식민지 형성을 평가하기 : <ol><li> 0.5 ㎖의 메틸 셀룰로스 배양 콜로니를 함유하는 24- 웰 플레이트의 각 웰을 HBSS 2 ㎖을 추가 (즉, 시판 스톡 메틸 한 희석 : 4). 최대 피펫 아래로 혼합하고, 신선한 튜브 (들)에 전송할 수 있습니다. </li><li> 표준 테이블 탑의 microcentrifuge를 사용하여 4 ° C에서 5 분 2,000 XG에 원심 분리기 샘플. </li><li> 원하는 경우 샘플을 풀링, 1 ml의 HBSS +에 뜨는 및에 resuspend 세포 펠릿 (들)를 제거합니다. </li><li> Centrifu4 ℃에서 5 분 동안 2,000 XG에 GE의 샘플. </li><li> 400 ㎕의 HBSS +에 뜨는 및에 resuspend 세포 펠릿 (들)를 제거합니다. </li><li> 네 1.5 ml의 튜브로 나누어지는 샘플은 다음과 같이 흠을; B220-FITC 만; GR-1-FITC 만; Ter119-FITC 만. </li><li> 2 μg / ML의 최종 농도에 적합한 튜브 형광 항체 컨쥬 게이트를 추가한다. 15 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기 샘플. 상층 액을 제거하고 얼음처럼 차가운 0.5 ml의 HBSS에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 각각의 조혈 계통 마커의 발현을 FACS에 의해 각각의 샘플을 분석 : B220은 B 세포 (20)을 표시; GR-1마르크 골수 세포 (21); Ter119은 적혈구 세포 (22)을 표시합니다. 참고 : 원하는 경우 다른 조혈 계통 마커를 대상으로 추가 항체는이 방법으로 통합 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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이 작품은 보조금 HL128064 byNIH 지원, HL096360, EB017103 및 CT 혁신은 15 RMB-YALE-04 KKH에, 그리고 NICHD / NIH T32HD007094을 부여합니다.

때문에 특정 발달 창 중에 만 등장 과도 작은 세포 집단을 연구에 내재 된 기술적 인 문제로 아직 초기 단계 필드 - hematovascular 개발 분야에서 많은 대답없는 질문이 남아있다. 위에서 설명한 기술은 심지어 싱글 hemogenic 내피 세포에서 세포와 일반적으로 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 시약 및 장비를 사용하여 중요한 발달 시점에서 배아 조직에서 HSPC 인구의 격리를 허용함으로써 이러한 어려움의 많은 개선. 우리의 프로토콜은 후속 분석에서 hemogenic 내피 세포의 일부분에 대한 제어를 독립적 인 분석을 위해 사용, 또는 할 수있는 YS와 AGM에서 비 hemogenic 내피 세포 분획의 병렬 분리 수 있습니다. 이 다색 FACS 기반 방법을 사용 hemogenic 내피 세포의 분리에 중요한 점은 적절한 스펙트럼 공동mpensation 및 단일 색상 게이트의 정확한 도면. 이와 같이, 강하게 염색과 단색 제어가 모든 실험 타점을 포함하는 것이 권장되며, 이들은 해당 - 함께 이소 정합 제어 항체로 처리 한 샘플 - 초기 적절한 스펙트럼 보상 게이트 도면을 확립하기 위해 사용될 수. 그러나, 비특이적 염색 따라서 염색 및 단색 컨트롤 FACS 분류기 설정이 최적화 된 후 게이트 확인 루틴을 충분이 프로토콜에 의해 최소화된다. 부정확하게 그려 SP 문이 보고서에 기술 된 방법과 특정 문제입니다. 이전의 연구는 다 능성 줄기 세포를 FACS로 SP의 모양에 대한 생리 학적 근거를 형성 훽스트 레드 17 우선적 유출을 나타내는 것을 보여 주었다. 우리는 hemogenic 내피 세포를 표시하고 HSPC 마찬가지로 SP 세포 분획 5,11에서 발견된다. 이러한 칼슘 채널 같은 약물hibitor 베라파밀은 트랜스 약제 내성 컨베이어의 다양한 방해물 통해 SP 셀이 훽스트 염료 유출 동작 블록. 조혈 줄기 및 전구 세포를, 이는 주로 ABCG2 / BCRP1 수송 체 (24)를 통해 발생한다. 일반적 베라파밀은 SP의&gt; 50 %의 막힘을 유발하지만, 본 베라파밀 의해 훽스트 유출 전체적인 과정과 후속 막힘 아마도 인해 차동 훽스트 여러 다제 내성 트랜스 형의 발현의 변화에​​ 발달시기 영향을받는 것으로 밝혀졌다 베라파밀 5 유출 능력과 감성. 따라서 강력 베라파밀 처리 것을 권장 훽스트 염색 음성 대조군 표준 적 적절한 SP 게이팅을 위해 포함될 일 : SP 게이트가 제대로 그려진 경우, SP 세포 수의 현저한 감소가에 훽스트 염색 표본에서 검출되어야 베라파밀의 존재. 우리는 이전에 보여 분류하는E9.5의 쥐의 난황에서 SP 세포가 ~ 80가 - E9.5 미분 획의 일치 수에 비해 메틸 셀룰로오스 기반의 조혈 문화에 HSPC를 생성하는 90 배 더 큰 능력을, 비 훽스트는 전체 YS의 조직 세포 5 스테인드. 은 SP의 또 다른 특성은 초기 조혈 및 E8.0에서 혈관 개발하는 동안 쥐의 난황에서 그것을 보여 주었다, VE-cadherin의 및 FLK-1의 뚜렷한 표현하지만, 줄기 (C-키트) 및 조혈 마커의 낮은 표현이 (CD45). 따라서, + / CD45- 비 SP 세포 우세 FLK-1 + / CD31로 정의이 발달 평가시기, 원시 (비 hemogenic) EC에서. 내피 세포 마커의 발현이 감소하고 CD45와 형 c-Kit 발현 증가, E9.5 및 E11.5 (5) 사이의 시험 관내 HSPC를 생성하는 능력이 증가 병용 등이 발현 프로파일 이행한다. 이 YS 조직의 조혈 활동이 E9.5과 E11.5 및 occurr 사이의 가장 명백한지고의 SP에 포함되어 제안내피 특성과 조혈 능력의 점진적 획득의 시간 초과 손실을 보내고. 이와 같이, SP 표현형을 야기주는 약제 내성 트랜스 포터의 발현이 내피 hemogenic 5의 중요한 표현형 마커이고; 사실, AGM에서 비 SP 세포는 혈액 형성 가능성 (12)를 나타내지 않는다. 따라서, YS와 AGM 모두 훽스트 염색 통해 SP 성공적 격리 (세포가 hemogenic의 차별을 허용이 분획 내의 특정 조직의 조혈 줄기 세포 구획과 세포의 후속 항체 염색에서 정렬되도록 FLK 보장 -1 + / C-키트 HSPC 대 + / CD45-) (Flk1- / C-키트 + / CD45 +) 인구 5,11,12. 또한, 이전 된 난황과 AGM 조직의 SP 내에서 CD41 + 세포가 메틸 셀룰로오스 기반의 문화 (11, 12)에 멀티 혈통의 콜로니 형성 할 수 있음을 지적하고있다. 우리는 Flk1 +의 형 c-Kit + CD45- SP 세포로 hemogenic 내피 세포를 정의조혈 계통의 지정된 마커로 CD45을 사용하기보다는 CD41 우리가 Flk1 및 CD45의 발현을 찾는 제공함으로써들 5,11 실질적으로 상호 배타적입니다. 이 두 내피가있는 SP 내에서 세포의 순수 분리 할 수​​ 있습니다 (FLK-1) 및 조혈 전환에 내피에 필요한 특성 (C-키트) 줄기 그러나 이들의 CD45의 유무에 의해 결정되는 아직이 변경을 시행하지 않은 세포. 최근 고메즈와 동료들에 의해보고 된이 Csf1r + (조직 대 식세포) 및 Csf1r- (HSC) 부분에 FLK-1 / C-키트 + / CD45 + / SP 세포로 정의 HSPC 인구의 하위 분류를 고려하는 것이 유용 할 것이다 25 일이 조직의 대 식세포의 전구 인구 대비 실제 HSPC의 높은 해상도를 제공 할 것이다, 그러나 이것은 고립 우리가 Csf1r부터 설명했다 식세포 전구 세포 (26)의 마커 인 hemogenic 내피 세포 분획의 무결성에 영향을 미치지 않습니다있다. Hemogenic 내피 세포는 YS와 (1 포함 - 내피 세포의 3 %) AGM 모두에서 드문 하위 집단이다, 따라서 그들의 연구의 주요 과제는 다음 응용 프로그램에 대한 불충분 한 세포 수율이다. 이 프로토콜은 일반적으로 10-20 %의 경우에도 최적의 조건에서 단지 몇 백 세포를 얻을 수있다 정렬의 시간 및 여러 배아에서 얻은 풀링 조직에서 전형적인 hemogenic 내피 세포의 종류에 의해 실행 가능한 나머지 셀 70 ~ 80 %가 결과 의 메틸 셀룰로오스 생산 식민지에 포함 된 셀을 검색. 조직이 빠르게 해부 및 풀링되어야하고, 샘플을 가능한 한 얼음에 보관해야합니다 : 정렬 된 세포의 수를 최대화하기 위해서는 강력 수사관이 절차의 모든 단계에 걸쳐 조직과 세포 생존을 보장하기 위해 조치를 취할 것을 권장합니다. 샘플은 직전 FACS 정렬에 신선한 준비 및 기술로 메틸 문화에 직접 높은 혈청 콘텐츠 또는를 포함 수집 튜브로 정렬되어야한다위 거라고. 생존의 문제가 지속되면, 수집 튜브는 더 정렬 된 세포 생존을 향상시키기 위해 혈청 미리 코팅 될 수있다. hemogenic 내피 세포의 수율을 낮게 유지하면, 성인 골수 또는 시판되는 형광 접합 된 비드를 본 명세서에 설명 된 배아 조직 유래 단색 제어 대신 스펙트럼 보정을 위해 사용될 수있다. 분류 세포를 배양하기위한 것입니다 경우, hemogenic 내피 세포 및 HSPC은 조직 배양 우물에 직접 정렬해야합니다. 정렬 세포가 DNA 또는 RNA 관련 유전자 발현 분석, hemogenic 비 hemogenic 내피 세포 HSPC위한 경우 세포의 손실을 최소화하기 위해 샘플 용해 완충액을 함유하는 수집 튜브에 직접적으로 정렬 될 수있다. 개설 된 기술 같은 태아 조직으로부터 성공적으로 (동시) hemogenic 비 hemogenic 내피 세포의 분리뿐만 아니라, HSPC 성숙한 혈액 세포 분획을 허용한다. 이 방법은 더 스터드 수 있습니다내피 세포는 혈액을 생성으로 발생하는 중요한 전환의 분자 토대의 Y. 이러한 연구 개발에서 얻은 통계는 능성 hemogenic에서 인간 내피 세포 및 HSPC 자손의 생성을 최적화 할 수 있으며, 잠재적으로자가 널리 알려진 조혈 장애의 치료에 줄기 세포를 수있다.

기능성 순환계 혈관 및 혈액 세포의 병렬 개발을 필요로한다. 혈액 개발 (원시 조혈)의 초기 단계에서, 적혈구 모세포의 기원은 적극적으로 일을 토론 상태를 유지합니다. 반면, 혈액 세포 개발 (최종 조혈)의 나중 단계에서, 그것은 멀티 혈통 HSPC 전문 혈관 내피 난황, 태반 내 혈액 형성 가능성 (hemogenic 내피 세포)를 취득 세포 및 AGM에서 발생하는 것이 점점 명백 해졌다 2-5뿐만 아니라 난황 제대 혈관 내막 배아 6, 헤드 혈관 7인치 이러한 별개 조직 내의 내피 세포 hemogenic의 명세는 개발의 특정 단계에서 발생; 예를 들어, ~ E8.25에서 난황 내와 ~ E10 8-12에서 AGM 내. hemogenic 엔도의 그럼에도하더라도 이들 특정 발달 윈도우 동안 인구11, 12 - (난황과 AGM 내피 세포의 3 % 1) 상피 세포는 모든 내피 세포의 작은 부분을 나타냅니다. hemogenic 내피 세포 &quot;지정&quot;프로세스는 물론, 인간 조혈 같은 뮤린 중요하다. 조혈 세포는 난황낭 혈관의 내피 세포와 인간 배아 (13)의 대동맥에서 새싹 것으로 나타났다, 여러 연구소는 인간 만능 줄기 세포에서 혈액 세포 생산이 14 ~ 16 중간 내피 세포 필요함을 증명하고있다. 따라서, 쥐 hemogenic 내피 세포의 표현형을 정의하고 인간 만능 줄기 세포에서 hemogenic 내피 세포의 생성을위한 시험 관내 기술의 추구를 촉진한다이 동물 모델에서의 개발로 이어질 분자 이벤트를 이해. 차례로, 다중 계통으로 분화 HSPC 혈액 세포 유형의 대규모 생산을위한 접근 방법의 최종 개발 - 자체 DERI중간 생리 관련 hemogenic 내피 세포를 통해 인간 만능 줄기 세포에서 VED는 - 혈액, 종양 학적 및 재생 의학에 대한 놀라운 치료 가능성을 가질 것이다. 이 목표를 향해, 우리는 배아 중 최종 HSPC 생산의 11 AGM (12), 두 가지 주요 사이트 주머니 쥐의 노른자 내에서, 클론 수준에, hemogenic 내피 세포의 표현형을 정의했습니다. 따라서 성인의 골수 (17), 배아 hemogenic 내피 세포와 HSPC 전시 훽스트 (Hoechst) 염료 유출 속성 내 HSPC와 마찬가지로 &quot;쪽 인구&quot;내 (그림 3)은 FACS 플롯 5,11,12에 세포 (SP)를 나타납니다. 또한, 우리는 또한 hemogenic 내피 세포가 모두 내피 세포의 마커를 표현하고 세포 (각각 Flk1 및 cKit를) 줄기 있지만, 조혈 계통 마커, CD45 5,11,12을 표현하지 않는 것으로 나타났습니다. 따라서, hemogenic 내피 세포는 답하라 될 수 있습니다ified하게하고 FACS에 의해 격리 Flk1 + / cKit + / CD45- SP 세포로서, 우리는이 세포가 난황과 AGM 세포 5,11,12의 Flk1- / cKit + / CD45 + SP 부분에 포함 HSPC을 야기 할 것으로 나타났습니다. Hemogenic 내피 세포와 HSPC하거나 (그림 1에 도시 된 바와 같이) 생체 배아 문화에 최대 48 시간 동안 배양 한 배아에서 확인 및 난황 또는 갓 안락사 배아 중 하나에서 수확 AGM 조직에서 분리 할 수 있습니다. 예 생체 내 문화는 선택적 허용 약리 에이전트와 개별 배아의 전처리, 또한 원하는 유전자 (즉, 렌티 바이러스 전달에 의해)의 일시적 발현 수 있습니다. 본원에 기재된 방법으로 hemogenic 내피 세포 HSPC의 FACS 식별을 유 전적으로 조작 된 마우스 모델에서 최종 조혈 개발 정량적 척도로서 사용될 수있다; 세포는 혈액 FO 포함한 후속 실험 애플리케이션에 검색 될 수있다rming 분석법 발현 분석 및 이식. 동물 주제 : 용도 및 윤리적 고려 사항 문학의 성장 몸은 배아 발달의 결정적인 조혈 단계에서 HSPC 형성에 hemogenic 내피 세포의 중요한 기여를 설립했다. 그러나하는 hemogenic 운명 향해 내피 세포의 아 집단의 사양을 촉진 생리적 조건 신호가 제대로 이해 유지하며, 따라서 아직 시험 관내 환경에서 모방 할 수 없다. 사실,이 문서에 설명 된 기술은 생체 hemogenic 내피 세포 사양 및 HSPC 생산을위한 접근 방식이 언젠가는 개발 될 수 있도록 hematovascular 개발 분야의 이해를 개선하기 위해 우리의 실험실과 다른 그룹에서 현재 사용합니다. 때까지, 그러나, 필드는 기본 야생형에서 조직 (유전자 의존 유지학적으로 변형 된) 마우스 배아는 추후 연구 hemogenic 내피 세포와 HSPC를 지정 구하십시오. Hemogenic 내피 세포와 HSPC 확실하게 식별하거나 E8.5에서 고립 될 수있다 (10-12 체절 쌍) 난황 또는 E10.5 (35-40 체절 쌍) 11, 12 AGM. 때문에 hemogenic 내피 세포의 상대적 부족에 (일반적으로 1 나타내는 - 총 내피 세포 이러한 조직 내에서 11, 12의 3 %) 여러에서 조직의 풀링 (~ 8-10) 하나의 샘플로 한배 새끼 강하게하기 위해 권장 후속 실험에 대한 충분한 세포를 얻을 수 있습니다. hemogenic 내피 세포 HSPC 성공적으로 식별되고 격리되었는지 검증 조혈 분화 유도 조건으로 검색 한 세포 배양에 의해 달성 될 수있다. 이러한 조건에서, 내피 세포 및 hemogenic HSPC는 ERY 함유 콜로니의 출현을 초래 다중 조혈 계통의 분화를 나타낼 것이다throid 전구 세포 (BFU-E), 과립구 대 식세포 전구 세포 (CFU-GM)와 과립구, 적혈구, 대 식세포, 거대 핵 세포의 전구 콜로니 (CFU-GEMM).

<table><tbody><tr><td>DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td>독성 자극제: 취급 시 보안경, 마스크, 장갑을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>흡수 벤치 언더패드</td><td>Covidien</td><td>7134</td><td></td></tr><tr><td>#5 직선 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>8.5 cm 스트레이트 사이</td><td>언스 툴</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Isothesia)</td><td>Henry Schein&nbsp;</td><td>50033</td><td>독성 흡입제: 흄 후드에 사용하십시오.</td></tr><tr><td>100x 페니실린 스트렙토마이신 글루타민 (10,000 U/ml 페니실린, 10,000 mg/ml 스트렙토마이신, 29.2 mg/ml L-글루타민)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>유형 II 콜라겐 분해 효소</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &#956; M 나일론 셀 스트레이너</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD31 - PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-81</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Flk-1 PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen 561259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td>독성: 자극성. 취급 시 보안경과 장갑을 착용하십시오. 증류된 H2O에 25mg/ml의 원액을 준비하고 -20 &#176에서 부분 표본을 보관합니다. 사용할 준비가 될 때까지 C.</td></tr><tr><td>베라파밀 하이드로클로라이드</td><td>시그마</td><td>1711202&nbsp;</td><td>독성: 자극성. 취급 시 보안경, 마스크, 장갑을 착용하십시오. &nbsp; 95% 에탄올에 5mM(100x)의 원액을 준비합니다. -20 &#176에서 저장; C 사용할 준비가 될 때까지&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml 라운드 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 포함 Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>제조사의 지시에 따른 해동 및 분취</td></tr><tr><td>수정된 Giemsa Stain</td><td>Sigma</td><td>GS500</td><td>독성: 메탄올 함유 - 배기 후드에서 사용하고 취급 시 장갑을 착용하십시오. 증류수에 0.02% 용액으로 희석합니다.</td></tr><tr><td>Cytospin 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Clipped Funnel 스타터 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120110</td> Cytospin 원심분리기 Anti-Mouse B-220<td>과 함께 사용하기 위한 cytofunnels, filter paper, cytoslides 및 cytoclip이 포함되어</td></tr> 있습니다 <tr><td>- FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Gr-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-85</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter-119-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5 g/L)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>행크의 완충 소금 솔루션</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴 코팅 24웰 조직 배양 플레이트</td><td>EMD Millipore</td><td>PIFB24P05</td><td></td></tr><tr><td>IgG2A-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>IgG2B-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>556923</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 배아 hemogenic 내피 세포의 분리

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

배아 혈관 내피 세포에서 hemogenic 내피 세포의 사양은 별개의 조직 내에서 짧은 개발 기간 동안 발생하며, (쥐 여분의 배아 난황, 태반, 제대 혈관 및 배아 대동맥 - 생식선 - mesonephros에서 최종 HSPC의 출현에 필요한 AGM) 지역. 이 세포 인구의 일시적인 자연과 작은 크기주의 정량 및 실험 응용 프로그램에 대한 재현 분리가 기술적으로 어려운 렌더링합니다. 우리는 난황과 AGM에서의 피크 발생 시간 동안 hemogenic 내피 세포와 HSPC의 동시 분리를위한 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 기반의 프로토콜을 설립했다. 우리는 난황 및 마우스 배아에서 AGM 조직의 절개하는 방법을 보여, 우리는 사전 FACS를 통해 식별 및 검색에 최대한의 세포 생존에 최적화 된 조직 소화와 항체 결합 조건을 제시한다. 대표 FACS 아나용해 플롯은이 hemogenic 내피 세포와 HSPC의 표현형을 식별하고, 클론 수준에 혈액 형성 가능성을 평가하기위한 메틸 셀룰로오스 기반의 분석을 설명 표시됩니다.

전방 및 측면 산란 (도시하지 않음)에 의해 표준 라이브 셀과 이중 차별 다음에 그림 3. 제시 대표 플롯과 유사 FACS 분산 플롯을 얻을 것입니다 배아 YS 또는 AGM에서 hemogenic 내피 세포와 HSPC의 성공적인 라벨, 측면 인구 (SP) 이벤트가 &quot;숄더&quot;로 베라파밀의 부재하에 선형 훽스트 레드 훽스트 대 청색 차 곡선의 시각화 (비 SP) 이벤트 (도 3A)의 대부분에서 왼쪽 시프트. YS 총 생존 세포의 3 %, 3 - - 총 생존 AGM 이벤트 5 % SP에 게이트가 제대로 그릴 때, SP 세포가 약 1을 대표한다. 베라파밀 처리에 관계없이 조직 소스 (그림 3A, 상단 패널)의 SP 이벤트 50&gt;에 % 억제를 초래한다. 우리는 이전에 SP 어깨의 바깥에 표시뿐만 아니라, 베라파밀에 의해 차단되어 다른 인구 Ter119 양성 erythr있는 것으로 확인되었습니다oblasts하고, 따라서 우리의 SP 인구 5에서 제외됩니다. SP에 비해, 비 SP 셀은 SP &quot;숄더&quot;(도 3a)에 인접하는 셀의 고밀도 클러스터로 식별된다. 이 인구는 CD45-FITC 딸 플롯 (그림 3B) 대 CD31-PE를 사용하여 구별 될 수 비 Hemogenic EC, CD31 등 + / CD45- 이벤트가 포함되어 있습니다. 다시 비교적 쉽게 정렬 할 수 AGM (도 3b) 또는 난황 (도시 생략), 이들 세포의 높은 번호로부터 비 SP 세포의 5 % - 비 Hemogenic EC는 일반적으로 2이다. HSPC 및 Hemogenic EC의 식별을 위해, 딸 게이트는 CD45 + 세포가 전형적으로 CD45 + 및 CD45- 세포를 식별의 SP 분획에서 작성한 &lt;AGM (그림 3C) 또는 YS 모두에서 전체 사건의 20 % (도시하지 않음). Hemogenic EC는 이후 Flk1-PECy7 딸 p를 대 차동 cKit-APC에서 CD45- 세포에서 확인된다많은 이중 양성 이벤트로, 전형적으로 한 대표 - AGM (도 3 D) 또는 YS 하나로부터 분리 될 때 CD45- 이벤트 3 % (도시하지 않음). HSPC는 Flk1- / cKit + 세포와 같은 Flk1-PECy7 딸 플롯 대 별도의 cKit-APC에서 CD45 + 분획에서 확인하고, 또한 일반적으로 약 25 표현된다 - (중 YS에서하지 얻을 때 CD45 + 세포의 작은 인구의 30 % 표시) 또는 AGM (그림 3 E). 이 프로토콜은 여러 개의 배아 조직을 모으고하더라도 각 세포 유형의 수백을 반환 할 따라서 Hemogenic EC 및 HSPC 모두 매우 드물다 (~ 총 세포 사건의 0.01 %)에서, 그리고 전형적이다. 딸 플롯에서 게이츠는 음성 대조군 그룹을 참조하여 수립되어야한다. 특이 및 비 - 특이 적 항체 염색을 구별하기 위해서, 게이트는 모두 초기 흠 컨트롤 참조 (도 3에 그려 져야형광 이소 공액 정합 (의 IgG2a 또는 IgG2b의) 대조군 항체로 처리 한 C)뿐만 아니라, 샘플 (도시하지 않음). 후자의 제어는 비특이적 염색 우리 이소 타입 정합 제어 항체 (예.,의 IgG2a-PE 또는 IgG2b에-FITC)는 초기 FACS 분류기 설정을 최적화하는 게이트의 경계를 결정하는 데 사용되는 것을 권장 따라서 동안이 프로토콜에 의해 최소한임을 보여 주었다 우리는 또한 흠없는 컨트롤이 정렬 루틴 FACS 동안 게이트의 경계와 실험 품질을 확인하기에 충분하다는 것을 찾을 수 있습니다. 문이 제대로 그려 경우 흠 또는 이소 - 대조군에서 녹음 할 때, 최소한의 양의 분산이 단일 또는 이중 양성 게이트에서 관찰되어야한다. 주주 총회 및 HSPC에서 Hemogenic 내피 세포는 메틸 (그림 4A) 문화 14 일 조혈 차별화를 받다. 콜로니 형태의 상대적 비율은 전형적으로 이러한 관찰문화는 조직 소스에 따라 달라집니다. E10.5 AGM에서 격리 hemogenic 내피 세포가 상승 CFU를 주로에 제공하는 반면 BFU-E, CFU-GM, 거의 CFU-GEMM 5 E8.5-E9.5을주고 상승에 난황 조직에서 분리 Hemogenic 내피 세포, 그림 (b) (맨 왼쪽 패널)와 같이 다른 계통이 여전히 관찰되지만 -GEMM 12. HSPC이 세포는 또한뿐만 아니라 다른 조혈 식민지 유형으로 구분됩니다 있지만 또한, 메틸에 문화에 CFU-GEMM에 주로 상승 (그림 4B, 상단 가운데 패널)을 얻었다 E10.5 AGM에서 격리입니다. 비 hemogenic 내피 세포 (CD31 + / CD45- 비 SP)도 (그림 4B, 오른쪽 상단 패널) 도금되어있다. 이 셀은 14 일 후 조혈 문화에는 성장을 보여 없다. 와 조혈 A의 발현 세포를 포함하지 않고 개별 표면 마커를 발현하는 세포 유형의 조혈 용량의 분석법차 내피 세포 마커는 CD31, Flk1, C-키트, VE-CAD E10.5에서 AGM의 SP 분획 내에서, CD41 및 CD45을 제한 수행하고 E10.5 AGM에서 해당 멀티 혈통 식민지 형성 활동을 보여왔다 CD31 +로, VE-cadherin의의 +, C-키트 +, CD41 + 및 CD45 + SP 세포 12. 흥미롭게도, 식민지 형성 활동은 모두 FLK-1 + 및 FLK-1 SP 세포에서 관찰되었다,하지만 Flk1 +의 형 c-Kit + CD45- SP 세포는 모두 &quot;조약돌을 특징으로 중간 내피 단일 층을 통해 멀티 혈통 식민지에 상승했다 &quot;내피 세포 형태 (그림 4B, 왼쪽 하단 패널) 및 DIL-AcLDL 흡수 (12)에 의해. 또한, C-키트의 발현은 AGM SP 셀 (12)의 조혈 활동이 필요하다. 이 hemogenic 내피 세포에 비해 몇몇 골수 전구 세포가 유사한 형태 학적 특성을 갖는 것으로 도시 하였지만, 골수 전구 세포는 CD45을 발현하고 다중 계통 콜로니를 생성 할 수 없습니다 <e체외에서 m&gt;. HSPC 또한 멀티 혈통의 식민지를 생성하지만, 이러한 세포 CD45 있지만, 그들은 FLK-1의 발현 12,23 부족과 기초 내피 단일 층 (그림 4B, 오른쪽 아래 패널)없이 둥근 세포 클러스터에 상승을 제공합니다. 따라서, 인구는 우리를 포함하여 혈액 형성 잠재력과 강력한 hematoendothelial 유전자 발현과 내피 세포를 나타냅니다 (FLK-1 + / C-키트 + / CD45-SP 세포 나)와 같은 hemogenic 내피 세포를 정의 GATA-1 / 2 Lmo2, SCL / 탈-1 Runx-1 형 c-Kit, 조혈 줄기 및 전구 세포,뿐만 아니라 비 - 내피 세포 hemogenic 대응 구별되는 CD34, CD41, CD45 및 11. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig1.jpg" /> 그림 1. 전체 워크 플로우. 간단히, 배아는 임신 댐에서 제거하고, YS 또는 AGM 조직 수확. 배아는 선택적으로 2 배양 할 수있다<html> 4-48 시간 생체 조직 수확하기 전에. 수확 YS 나 AGM 조직을 제어 및 샘플 튜브에 분주하여, 단일 세포 현탁액 분해 및 훽스트 염료 및 / 또는 형광 접합 된 항체의 존재 하에서 배양 하였다. 베라파밀, 칼슘 채널 저해제, 또한 SP 분획 정확한 게이팅 검증 필수적인 음성 대조군을 생성하는데 사용된다. Hemogenic 내피 세포를 FACS로 식별됩니다 같은 Flk1 + / cKit + / CD45- SP 세포 HSPC 세포의 Flk1- / cKit + / CD45 + SP 부분에 포함되어있는 동안; 두 세포 유형은 hemogenic 잠재력을 확인 메틸 셀룰로오스로 분류되어 있습니다. CD31 + / CD45- 비 SP 세포.로 또한, 비 hemogenic 내피 세포를 식별 할 수있다 (그리고 원하는 경우, 검색) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> igure 2 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg &quot;/&gt; YS와 AGM 조직 그림 2. 해부. 가) YS는 E10.5 배아의 줄기가 모두 앞다리와 뒷다리 싹 아래 수평으로 절개함으로써 격리) E8.5 배아에서 멀리 해부, 이후 소화. B에 대한 무균 HBSS +로 전체를 배치됩니다. 주주 총회는 다음 사지 새싹과 복부 조직을 사용하는 집게에서 분리된다. C)를 밝은 필드 이미지는 E10.5 배아 (규모 = 1mm)에서 모두 YS와 AGM의 절개를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig2large.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig3.jpg" /> 차별에 대한 게이트 계층을 입증 그림 3. 대표 플롯E8.5 YS에서 FACS로 Hemogenic 내피 세포의 (Flk1 + / cKit + / CD45- SP 세포), HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP 세포), 및 비 hemogenic 내피 세포 (CD31 + / CD45- 비 SP)의 또는 E10.5 AGM. 라이브 앞으로 의한 YS (패널 왼쪽) 또는 AGM (오른쪽 패널) 중 하나에서 세포의 세포와 이중 차별과 측면 산란 (도시하지 않음), A) 측면 인구에 따라 (SP) 게이트 그려 및 확인 베라파밀 처리 대조군에서 SP 분획의 상당한 감소에 의해. 비 SP 인구는 SP에 인접 셀의 고밀도 클러스터로 식별된다. . 제시된 그래프에서 각각 20,000 이벤트 B) 비 hemogenic 내피 세포가 아닌 SP 분획 내의 CD31 + / CD45- 세포로서 식별 표시하고,이 표현된다 - AGM 얻은 것인지 비 SP 세포의 5 % (도시 ) 또는 YS (도시하지 않음). discri하려면minate Hemogenic EC이나 딸 게이트가 하나 AGM (도시) 또는 YS (도시하지 않음), 추가 딸 게이트가 그려에서 hemogenic 내피 세포의 식별을 위해 CD45 + 및 CD45- 세포. D)를 식별하기 위해 SP 분획에서 작성한 HSPC, C) CD45- 부분에서 cKit + (cKit- 대)와 (Flk1- 대) Flk1 + 세포를 구별합니다. . E) HSPC가 cKit +와 Flk1-와 CD45 + 분수에서 확인하고, 일반적으로 20 대표되는 CD45- 이벤트의 3 % - - YS 또는 AGM 중 하나에서 Hemogenic EC는 1 ~ 전형적으로 AGM에서 분류 여부 CD45 + 세포의 30 % (도시 ) 또는 YS (도시하지 않음). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig4.jpg" /> 그림 4. Visua메틸 셀룰로오스. A) 메틸에 도금 7 일 이내에 정렬 된 각각의 세포에서 식민지 양식에 Hemogenic 내피 세포의 문화 HSPC를 다음과 조혈 차별화의 사용 효율. 멀티 계보 조혈 잠재력은 별개의 식민지 모폴로지 (11). 도시하지 않은 B) 분류 hemogenic EC 및 HSPC AGM에서 (또는 YS의 위상 현미경 영상) 멀티 계보 조혈 표시의 평가에 의해 식별 다수의 조혈 식민지 종류의 관찰에 의해 확인 될 수있다 메틸 배지에서 배양 7 일 후 콜로니 형성. 비 hemogenic AGM에서 EC (또는 도시하지 YS는) 이러한 조건 하에서 성장을 보여주지 않습니다. 높은 배율에서 고전적인 &quot;조약돌&quot;내피 세포 형태 (흰색 화살표)를 부착 세포는 막 다른에서 조혈 세포의 클러스터에 상승을 제공 볼 수 있습니다hemogenic EC의 투 레스; 이러한 내피 세포가 정렬 HSPC (규모 = 100 μm의)의 문화에서 관찰되지 않는다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

본 절차의 전체적인 목표는 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)을 통해 마우스 배아 조직에서 일차 조혈 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 배아 조혈 조직으로부터 생존 가능한 조혈 내피 세포를 신뢰성 있고 특이적으로 분리할 수 있다는 점입니다. 이렇게 분리된 세포는 이후의 분석 및 배양에 사용할 수 있습니다.이 방법을 통해 분리된 조혈내피세포와 조혈줄기 및 전구세포는 이후 이들의 발달과 기능 조절에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 활용될 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 조혈내피세포와 조혈줄기 및 전구세포를 포함하는 side population 세포군을 식별하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 배아 조직 박리 및 스캐닝 절차는 본 연구실의 전 대학원생인 Kat Marcelo가 시연할 예정입니다.현재 임상 연구 펠로우인 Emily Grits와 현재 박사 후 연구원인 Jen Fang이 함께 참여합니다. 먼저 70% ethanol로 모든 작업 표면을 닦아내고 실험대 표면에 흡수성 언더패드를 배치하는 것으로 시작하십시오.다음으로 안락사시킨 줄기를 언더패드 위에 등쪽이 위로 오도록 놓고 하복부에 70% ethanol을 충분히 뿌립니다. 하복벽 중앙선에 수직이 되도록 긴 가로 절개를 시행합니다. 이어서 가로 절개 지점의 중앙에서 위아래로 1인치 길이의 가로 절개를 두 군데 더 추가로 시행합니다.그런 다음 복벽을 절개하여 여러 개의 배아가 착상된 좌우 자궁각을 완전히 노출시킵니다. 핀셋으로 두 자궁각 중 하나를 잡고, 가위와 핀셋을 사용하여 자궁을 주변 자궁근층으로부터 분리합니다. 그리고 두 자궁각 모두를 얼음 위에 놓인 멸균된 60 millimeter 폴리스티렌 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.플레이트를 표준 광학 해부 현미경 아래에 두고, 핀셋을 사용하여 각 태아 태반 단위를 분리합니다. 각 단위마다 자궁낭의 근육층을 해부하여 제거함으로써 하부의 임신낭과 탈락막을 노출시킵니다. 난황낭을 분리하려면, 밀폐된 배아로부터 낭의 가능한 많은 부분을 조심스럽게 제거하십시오.필요에 따라 난황 혈관의 배아 기시부에서 배아 본체로부터 나머지 난황낭 조직을 제거합니다. 대동맥-생식선-중신장(aorta-gonad-mesonephros, AGM)을 분리하기 위해, 심장과 앞다리 아래쪽에서 배아를 절단하고 흉부와 머리 부위를 폐기합니다. 다음으로 뒷다리 바로 아래쪽에서 배아를 절단하고, 꼬리 조직을 제거하여 폐기합니다.그런 다음, AGM이 포함된 나머지 부분에서 뒷다리와 과도한 복부 조직을 제거합니다. 난황낭이나 AGM을 각각 수집할 때마다 배아 조직을 얼음 위의 1.5 milliliter HPSS+in 튜브에 모읍니다. 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 배아 조직을 원심 분리하고, HPSS+에 희석한 Collagenase type two 1 milliliter에 조직 펠릿을 재현탁합니다. 튜브를 37 degree celsius 항온수조에서 30분 동안 배양합니다.5분마다 도립 혼합합니다. 배양이 끝나면, P1000 피펫으로 샘플을 10회 통과시켜 조직을 부드럽게 기계적으로 분리합니다. 그 다음 샘플을 다시 원심 분리하고, 펠릿을 1 mL의 얼음처럼 차가운 HPSS에 재현탁합니다. 이제 샘플을 70 micron 세포 여과기에 걸러 세포 수를 측정합니다.세포 수를 센 후, 원심분리를 통해 세포를 다시 수집합니다. 그리고 펠릿을 37 °C의 DMN+에 재부유시켜 1×10⁶ cells/mL 농도로 맞춥니다. FACS 소팅을 위해 세포를 라벨링 하려면, 1.5 mL 튜브에 최소 100 µL의 세포를 분주하고, Hoechst 단독 처리군 및 Verapamil 대조군 튜브에 95% ethanol로 희석한 verapamil을 최종 농도 50 µM이 되도록 첨가합니다.모든 튜브를 37°C에서 5분 동안 둡니다. 그 다음, hoechst 단독 대조군 튜브, hoechst 및 verapamil 혼합 대조군 튜브, 그리고 샘플 튜브에 hoechst를 최종 농도가 5 µg/mL가 되도록 첨가하고, 빛이 차단된 37°C에서 1시간 동안 다시 보관하며 15분마다 튜브를 부드럽게 반전시켜 섞어줍니다. 배양이 끝나면 모든 샘플을 원심분리하고, 펠릿을 차가운 HPSS에 희석하여 1 × 10⁵ cells/mL 농도로 맞춥니다. 이제 적절한 항체 단독 대조군 튜브와 샘플 튜브에 형광 접합 항체를 최종 농도가 2 µg/mL가 되도록 첨가하고, 빛이 차단된 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.배양 종료 후, 샘플을 원심 분리하고 펠릿을 500 µL의 얼음처럼 차가운 HPSS에 다시 현탁합니다. 5 mL 라운드 바텀 폴리스티렌 FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 여과하고, 튜브를 빛이 차단된 얼음 위에 둡니다. 그 후 즉시 유세포 분석기로 세포를 분석합니다.전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter)을 이용한 표준적인 생존 세포 및 더블렛(doublet) 판별 후에, side population 이벤트는 linear hoechst red 대 hoechst blue 점도표(dot plot)에서 non side population 이벤트보다 왼쪽으로 치우친 숄더(shoulder) 형태로 시각화됩니다. 이 side population은 verapamil 처리 시 유의하게 감소합니다. non side population 세포는 side population에 인접한 조밀한 세포 군집으로 확인됩니다.비-사이드 팝퓰레이션(non side population) 세포 분획은 CD31+CD45- 이벤트로 추가 구분되는 비-조혈성 내피세포를 포함합니다. 조혈 줄기 및 전구세포와 조혈성 내피세포를 식별하기 위해, 사이드 팝퓰레이션 분획에서 딸 게이트(daughter gates)를 설정하여 CD45+ 및 CD45- 세포를 나타냅니다. 이후 CD45- 세포들 중에서 cKit 대 Flk1 차등 딸 플롯(daughter plot)을 통해 이중 양성 이벤트인 조혈성 내피세포를 식별합니다.조혈모세포 및 조혈전구세포는 별도의 도터 플롯(daughter plot) 내 CD45+ 분획에서 Flk1-cKit+ 세포로 식별됩니다. 이 절차 이후, 분리된 세포의 조혈 능력을 기능적으로 평가하기 위해 메틸셀룰로오스 기반 배양을 설정하거나, 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 세포를 즉시 처리할 수 있습니다. 이 기술에 숙달되면 적절히 수행했을 때 약 4~5시간 내에 완료할 수 있습니다.이 실험 절차를 수행할 때, 세포 생존율을 최대화하기 위해 별도의 지시가 없는 한 샘플을 차광 상태로 유지하고 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다. 이 기술을 통해 혈관 생물학 분야의 연구자들은 배아 발달 과정 중 내피세포의 조혈성 분화와 조혈 줄기세포 및 전구세포의 생성을 탐구할 수 있었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 유세포 분석법을 이용하여 생쥐 배아 조직에서 조혈성 내피세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 태아의 난황과 대동맥 - 생식선 - mesonephros 영역을 미세 절개하다 및 조혈 줄기 세포를 정렬 유동세포계측법를 사용하는 방법을 보여줍니다.

Murine 난황과 AGM에서 조기 조혈 줄기 세포의 분리

여기, 우리는 murine 폐동맥 내피 세포의 격리와 문화 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정비사 및 효소 폐 조직 분리뿐만 아니라 안티 - PECAM - 1과 대부분 microvascular 원산지 순수한 내피 세포 인구를 생산 자성 비즈에 복합 백신 ICAM - 2 항체를 사용하여 2 단계 정화 과정으로 구성됩니다.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

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배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

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차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

Microvascular 내 피 세포 골격 근육 (MMEC)의 근육 모세 혈관의 안 벽을 형성 하 고 둘 다 조절 근육 조직과 혈액 사이 (면역) 세포의 마이그레이션 및 체액/분자의 교환. 기본 murine MMEC의 격리, 여기에 설명 된 대로 "myovascular 단위"의 종합 체 외 조사 수 있습니다.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

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배우세요 쥐 배아 조직에서 혈원성 내피 세포와 조혈 줄기세포를 FACS를 이용해 분리하는 방법을. 이 기술은 생존 세포의 신뢰할 수 있는 분리를 가능하게 하여 후속 분석과 배양에 활용됩니다.

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