Name: 박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 학습하세요 HSV 감염 세포에 박테리아와 균류의 부착을 평가하는 방법을 통해 다중 미생물 상호작용을 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 만성 바이러스 감염이 기회주의적 병원체의 바이오필름 형성에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 프로젝트는 미드웨스턴 대학교, 일리노이 연구 및 후원 프로그램 사무국(ORSP) 및 미드웨스턴 대학교 치과 대학-일리노이(CDMI)의 지원을 받았습니다.

1. HSV 균주 및 취급 참고 : 재조합 비 확산 HSV-1 (KOS) gL86과 HSV-2 (KOS) 333gJ을 - V. Twiari (36, 37)에 의해 제공되었다 사용되는 베타 - 갈 락토시다 아제 리포터 활동. <ol><li> 1에서 -80 ° C에서 단일 많이 매장에서 바이러스를 사용하여 둘 베코의 변형 이글의 중간 20 % 소 태아 혈청 (FBS)와 (DMEM)의 1의 비율로 사용 할 때까지 우유를 탈지. 바이러스 많이 저장하기 전에 입출력 -nitrophenyl-β-D-갈 락토 (ONPG) 및 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 β-D-갈 락토 (X-GAL) 분석으로 바이러스의 농도를 결정한다. </li><li> 이전에 (그림 1) 14 설명한 바와 같이, 기자 바이러스 항목 분석을 사용하여 각 실험 분석 실행을 위해 X-걸 염색에 의한 바이러스의 생존과 감염 (MOI)의 다양성을 결정합니다. </li><li> 원하는 MOI로 바이러스 (수신 거부 MEM)을 희석. 단일 층 (파라 포름 알데히드를 0.5 ㎖ / 웰) 수정 염색 전합니다. 별도의 microti에서 바이러스의 생존 컨트롤을 배치polymicrobial 분석 플레이트와 병렬 터 플레이트. </li></ol> 2. 헬라 299 셀 처리 <ol><li> 4.5 g / L 글루코스, 10 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS), 겐타 마이신 (50 μg의 / ml) 및 L- 글루타민으로 DMEM에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 성장한다. 트립신 용액과 80 %의 합류 통로 세포 (0.05 % 트립신, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산, 0.53 M EDTA 5 ㎖ / 플라스크). </li></ol> 3. C. 알비 칸스 처리 참고 : C를 임상 실험에서 얻어진 소스 알비 매체 2X 탈지 우유 Remmel에서 -80 ° C에 저장된다. <ol><li> 문화 사부로 포도당 중간 (37 ° C)에 주식을 동결. 24 시간 배양 C. 후 Fungisel 매체에 알비 칸스 (37 ° C, 48 시간) 사용. </li><li> 세균 튜브 (GT) 형태의 생성 (3 ML의 FBS를, 대표적인 식민지를 선택 3 시간 37 ° C, 복근 600, 0.3). 배양 후, 세척 GT (HBSS를, 배, XG 4000 참조). (37 예열 HBSS로 세척 GT 추가# 176; C; 0.32 복근 600). GT 양식은 혈구 수에 의해 결정되는 관찰 세포의 99 %이어야한다. </li><li> 대표 Fungisel 식민지를 선택하여 효모 형태 (YF) 주식 현탁액을 (HBSS, 3 ㎖를, 0.32 복근 600). YF 형태의 수를 카운트 / 혈구 현미경을 사용 ㎖로. YF 양식은 혈구 수에 의해 결정되는 관찰 세포의 99 %이어야한다. </li><li> 곰팡이 주식을 작동합니다 (25 ml의 HBSS에 GT 또는 YF 주식의 250 μl를 37 ° C, 10 5 CFU / ㎖) </li></ol> 4. S. 구균 처리 <ol><li> 스토어 S. 구균 ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel 우유의 2 배를 탈지). 양 혈액 아가 상 배양 (5 %, 37 ℃, 24 시간). 대표적인 식민지를 선택하고 재고 2 일 이내에 매체 염을 만니톨로 전송 (37 ° C, 18 시간을). </li><li> S.합니다 구균 재고 서스펜션 (3 ml의 HBSS, 1.32 복근 600 10 8 CFU / ㎖) <ol><li> S. 작업 확인 구균 재고 (100 μL25 ml의 HBSS의 재고; 105 CFU / ㎖). </li></ol></li></ol> 5. 칸디다 및 S. 구균 현탁액 <ol><li> 혼합 C. 확인 알비 칸스 및 S. 구균 현탁액 (250 μL의 YF 또는 GT 재고 및 25 ml의 HBSS 100 μL S. 구균 주). </li></ol> 6. Polymicrobial 바이오 필름 분석 <ol><li> 2 × 105 HeLa 세포 / ㎖의 200 μL (85 % 합류 레벨)와 종자를 96 웰 플레이트. 락 플레이트 (30-45 분 37 ° C) 배양 전 (37 ° C, 5 % CO 2 배양기 18 시간). 워시 단일 층 (1 배, 수신 거부 MEM) 다음 HSV와 시드 (HSV-1 (KOS) gL86 또는 HSV-2 (KOS) 33 GJ - 100 μL에서 탈퇴 MEM, MOI 50, 10). 판을 품어 (37 ° C, 3 시간 5 % CO 2). 하루에 단 하나의 바이러스 균주를 사용합니다. </li><li> 감염 단일 층을 씻으 (1 배, 인산염 완충 생리 식염수 마그네슘이와 칼슘이와 (PBS) 100 μL). 25 &amp; # 떠나는 따뜻한 HBSS와 PBS를 교체(181) 각각 잘 리터. <ol><li> YF, GT 및 / 또는 S. 추가 (, 셀 비율 = 5 100 μL 대상 : 1; N = 16) 작동 구균 현탁액. 표 1에 나타낸 바와 같이 판 부화 (정적를 30 분, 37 ° C, 5 % CO 2). </li></ol></li><li> 배양 후, 한 번에 흡인 한 열은 즉시 마그네슘이와 칼슘이 300 ㎕의 PBS로 보충. (시 50 분 희석 200 μL; 필터 살균 RIPA)는 무선 면역 분석 용해 버퍼를 추가 한 다음 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 빠르게 헬라 세포 용 해물 후 만니톨 염 (MS) 및 / 또는 Fungisel (F) 미디어 (그림 2)에 50 μl를 배치 ​​씹다. 90 ° 각도로 유리로드 절곡하여 분해물을 확산. (37 ° C에서 18 시간) 번호판을 품어. 수동 접시 당 콜로니의 수를 계산합니다. 컨트롤 S. 구성 구균 및 / 또는 C. HSV-감염되지 않은 HeLa 세포에 albicans에 부착. </li></ol> 7. 이미징 연구 &lt;/ P&gt; <ol><li> 각 라운드 유리 커버 슬립을 씻으 (12mm, 50 ml의 아세톤 비이커 100). 건조하고 소독 된 커버 (매직 잉크를 킴 와이프, 유리 페트리 접시). 알코올 불꽃 소독 집게로 멸균 24 웰 플레이트의 우물에 건조 멸균 된 커버를 놓습니다. </li><li> 세척 멸균 라운드 커버 글라스를 포함하는 24 웰 플레이트의 웰에, HeLa 세포 (96 웰 플레이트에 사용되는 5 배 볼륨 1 ml)에 추가합니다. 위의 단계 6.4 6.2.1에 설명 된대로 다음 부화 및 프로세스, 5 배 96 웰 플레이트에 사용되는 볼륨의 템플릿 (표 2)에 따라 바이러스, 세균 및 곰팡이를 추가합니다. </li><li> 최종 세척 한 후, 메탄올 슬라이드를 범람하고 증발 할 수 있도록하여 현미경 세포를 고정합니다. 염색 할 때까지 실온에서 접시를 저장합니다. </li><li> 밝은 필드 현미경 (1000 배 최종 원래 배율)의 경우 탈 이온수로 메탄올 고정 된 커버를 포함하는 우물을 입력합니다. 즉시 물을 대기음. 그램 크리스탈 바이올렛 각 커버 슬립 커버. 워시가 아닌 바운드 얼룩 (탈 이온수)의 무료 된 커버. 현장에서 건조 된 커버는 레이블 슬라이드 매체를 장착 하드 세트 (그림 3)로를 준수합니다. </li><li> 형광 현미경 (100 배 대물, 1000 배 최종 원래 배율)의 경우 단계 7.4에 설명 된대로 세척은 본질적으로 메탄올 무료로 된 커버. 우물에서 커버 슬립을 건조. <ol><li> 건조 후, 커버 전표를 제거하고 표시된 슬라이드에 배치합니다. (- 5 μL 1) 다음 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 공역 계 단순 포진 바이러스 유형의 1시 20분 희석의 커버 슬립을 커버하는 1 + 2 GD 항체를 충분한 양을 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ℃에서 습도 챔버에 슬라이드를 부화. 부화 후, PBS의 4 변화에 커버 슬립을 씻는다. </li><li> 최종 세척 후, 표시된 슬라이드에 커버 슬립을 반환합니다. 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (; 수분 챔버에서 30 분 동안 37 ° C DAPI)로 염색. 부화 후 4 찬으로 된 커버를 세척PBS의 GES 후 하드 세트 장착 매체와 표지 슬라이드에 부착합니다. </li><li> 설치 매체가 어둠 속에서 실온에서 24 시간 동안 치료하도록 허용합니다. 밝은 필드 현미경 또는 FITC와 DAPI 차단 필터 형광 현미경 중 하나에 기름 목표 아래 커버 슬립을 검사합니다. 공동 현지화 (그림 4) 적어도 50 분야 (생물 최소 100 세포) 사진을 검사합니다. </li></ol></li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

현재 어떤 정보는 원핵 생물 진핵 세포 및 바이러스 성 즉, 다수의 분류 학적 영역을, 교차 호스트 마이크로 바이 옴의 준 상임 이사국에 영구적 인 사이의 복잡한 상호 작용에 사용할 수 없습니다. 그러므로 우리는 S.으로 생물막 개시를 연구하기 위해 체외 모델 시스템에서 새로운 개발 구균 및 C. HSV-1 또는 HSV-2에 알비 칸스는 헬라 229 (헬라) 세포 (38)을 감염 시켰습니다. 헬라 세포 모델 시스템은 고유 한 장점을 제공한다. 이것은 두 S.위한 수용체로서 작용 표면 피브로넥틴 발현의 부족에 기인 구균 및 C. 알비 칸스 39-41. 점막 상피의 정점 (42) 표면은 일반적으로 더 밀접하게 자연 감염과 식민지 43-47에서 관찰 모방을 피브로넥틴,이 시스템이 부족하기 때문이다...

<html> 인간 마이크로 바이 옴 몸에 지리적 영역을 공유하는 여러 분류 학적 왕국에서 다양한 생물이 포함되어 있습니다. 세포 표면에 준수는 마이크로 바이 옴의 식민지화 과정의 일부입니다 생물막 형성에 필수적인 첫 번째 단계입니다. 마이크로 바이 옴에 포함 된 만성 및 지속적인 감염의 원인 바이러스가 될 수 있습니다. 이 바이러스에 의한 만성 세포 감염이 추정되는 수용체의 가용성에 변화를 일으킬 수 있습니다. 또한 1, 2, 세포 내 병원균에 의한 세포 항목도 차례로 박테리아와 곰팡이를 포함한 다른 마이크로 바이 옴 회원의 첨부 파일을 변경할 수 있습니다 호스트 막 유동성 / 소수성에 영향을 미칠 수 . 인간 숙주의 동일한 지리적 영역에서 - 지역화 공동이 여러 병원체 사이에서 발생할 수있는 상호 작용을 이해하기 위해, 우리는 점막 표면에 존재하는 분류학 왕국의 스펙트럼을 나타내는 병원체의 상호 작용을 연구 할 수 있어야한다. t &quot;&gt;는 헤르페스는 마이크로 바이 옴의 상임 이사국으로 인간의 100 %에 존재하는 미생물의 가족은 3,4. 또한 그들은 또한 지속적으로 증상의 유무에 모두 흘려 될 수있다. 특히, 단순 포진 바이러스 1 및 단순 헤르페스 바이러스 -2 (HSV-1, HSV-2, 각각)는 oronasopharynx 및 생식기의 마이크로 바이 영구 부재이다. 면역 능력이 개인, 두 HSV-1, HSV-2 원인 gingivostomatitis은 물론 음부 포진 5-8.이 사이트에서 HSV는 만성 지속적 nectins, 헤파 란 황산, 지질 뗏목 및 헤르페스 바이러스 항목 중재자의 표면 발현의 변화 세포 결과로 HSV 9. 항목 흘리기 바이러스 증상 / 종양 괴사 특징으로하는 잠재 감염의 원인 인자 수용체 (HVEM / TNFR) 10-25. 일부 박테리아와 곰팡이, 예를 들면 황색 포도상 구균과 C. albicans에 대한이 잠재적으로 공유 나타냅니다 수용체있는 기회 병원균 동안,또한 oronasopharynx (26, 27)의 점막 마이크로 바이 옴의 구성원으로 상주 할 수 있습니다. oronasopharynx S. 내 구균 및 C. 알비 칸스는 식민지의 두 가지 위치를 차지한다. 자연 치아와 호스트에서 구강 점막은 HSV-1과 C.에서 공유 알비 칸스, 전방 코 콧 구멍은 S.에 의해 점유하는 동안 구균 28. 그러나에도 불구하고 체외 조사 결과 그 S. 구균 입 상피 세포에 부착, 29, 30 S. 정상 조직은 29, 30 존재할 때 구균은 드물게 구강 검체에서 분리된다. 리틀는 임상 연구 결과 그 이상 생식기 공동 식민지의 틈새 시장에 관한 알려져있다 S. 구균은 C.하면서, 생식기 염증, 방전 및 성교통 특징, 에어로빅 질염과 연관된 알비 구강 31-35에서 관찰 된 것과 유사한 점막 병변을 생성한다. 따라서, 구강과 생식기 microbi 이러한 회원하지만의 상호 작용에 관한 알려진 작은 오메 크로스 분류 학적 왕국 숙주 세포 표면 5 준수를 통해 biofilm 형성을 시작하기에 영향을 미치기 능력이있다. 이 프로토콜은 효과적으로 공동 정착 / 감염의 기능적 결과를 결정하는데 적용되었다.

<table><tbody><tr><td>C.albicans</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud 포도당</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>진균 한천</td><td>도트 사이언티픽</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>S.aureus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agary</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>양 혈액 한천</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>Hela cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco의 변형 된 독수리 배지, 4.5g / L 포도당 및 L- 글루타민, 피루브 나트륨 없음</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg / ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &micro; 전체 DMEM</td></tr><tr><td>트립신 EDTA(0.05% 트립신, 0.53M EDTA) 용액 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>내 10% 최종 농도 전체 DMEM</td></tr><<tr><td>strong>기타 배지 및 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>초순수 X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1& 2, gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>그램 크리스탈 바이올렛</td><td>트로이 생물학적 제제</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>배양 튜브 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 서클, 12mm</td><td>Deckg레이저</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

곰팡이, 박테리아와 바이러스를 포함 분류학 왕국에서 polymicrobial 상호 작용의 연구는 이전에 마이크로 바이 옴의 바이러스 성 회원이 바이러스에 감염된 숙주 세포와 후속 미생물의 상호 작용에 미치는 영향에 대해 조사되지 않았다. 세균 및 진균과 바이러스의 공동 주거 구강 및 생식기의 점막 표면에 주로 존재한다. 점막 세포, 지속적인 만성 또는 지속적인 잠재 바이러스 감염 특히이 표현 수용체의 상당수에서 바이러스 변경을 통해 마이크로 바이 옴의 구성원에 미치는 영향과 유형을 가질 수있다. 숙주 세포의 막 구조의 변형이 바이오 필름의 형성, 즉 부착하는 첫 번째 단계를 개시하기 위해 상주하고 기회 병원균 후속 부재 변형 기능을 초래할 것이다. 이 연구는 biofil의 시작에 HSV의 효과의 정량 및 육안 검사하는 방법을 설명합니다S. m의 형성 (부착) 구균 및 C. 알비 칸스.

이 보고서에 설명 된 시스템에서 얻을 수있는 데이터의 안정성의 수준은 그림 2 AF (38)에 표시됩니다. 이 시스템의 사용을 통해 바이러스로 감염된 세포와의 상호 접착에 미치는 효과 포도상 진균 작용의 조절을 묘사 할 수있다. polymicrobial 상호 작용은 동일한 세포에서 발생되는지 여부를 결정하기 위해도 3 및도 4에 도시 된 바와 같이 38 연구 이러한 유형의 상호 작용에 대한 현미경 검사를 필요로한다. 본 연구에서는 차등 세포 상호 작용은 특정 바이러스 종이다 포도상 진균 순응도 HSV 변조의 결과로서 관찰된다. 황색 포도상 구균 및 C. 동일한 HSV-헬라 비감염 대조군 세포에 부착 ...

바이러스에 감염된 HeLa 세포 단층의 부착을 위한 왕국 간 연관성 및 경쟁(박테리아 및 진균)을 결정하기 위한 방법이 본원에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 원핵생물, 진핵생물 및 바이러스의 여러 조합으로 확장될 수 있습니다.

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

본 실험의 전반적인 목표는 HSV에 사전 감염된 세포가 Staphylococcus aureus 및 Candida albicans와 같은 세균 및 진균성 기회감염균의 후속 부착에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 이 방법은 만성 바이러스 감염이 호스트 마이크로바이옴의 각 구성 요소 조절에 어떤 역할을 하는지에 대한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 생물체 간의 상호작용을 바이오필름 형성의 시작 단계인 부착 단계에서 검토하고 정량화할 수 있다는 점입니다.무증상 배출을 동반한 HSV 감염의 전제 조건이 인류 대부분에게 나타나므로, 이 기술의 함의는 정착하는 기회감염성 병원균의 제어까지 확장될 수 있습니다. 이 방법은 이후의 미생물 부착에 대한 HSV의 제어 기전을 파악하는 데 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, CMV 감염 및 아데노바이러스 감염과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 우선, 리포터 바이러스 침입 분석법(reporter virus entry assay)을 사용하여 각 실험 분석 실행 시 x-gal 염색을 통해 HSV1 또는 HSV2 바이러스의 생존력과 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)를 결정하십시오.바이러스를 원하는 MOI로 희석하고, 다중 미생물 분석 플레이트와 병행하여 별도의 마이크로타이터 플레이트에 바이러스 생존력 대조군을 배치합니다. 그 다음, 염색 전 단일층을 고정하기 위해 100 µL의 파라포름알데히드 글루타르알데히드 완충액을 사용합니다. HeLa 세포를 유지하려면 4.5 g/L의 glucose, 10% 열 불활성화 FBS, 50 µg/L의 gentamisin 및 l glutamine이 포함된 DMEM에서 배양하십시오.세포의 밀도가 80%에 도달했을 때 Trypsin 용액을 사용하여 세포를 계대 배양합니다. C.albicans를 처리하려면, 동결 보관된 스톡을 dexterous 배지에서 37°C로 배양합니다. 24시간 후, C.albicans를 fungicell 배지로 계대 배양하고 사용 전 48시간 동안 배양합니다.대표적인 fungicell 콜로니를 채취하여 37 °C의 FPS 3 mL에서 3시간 동안 배양함으로써 C.albicans의 발아관 또는 GT 형태를 생성합니다. 배양 후, 배양액을 4,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 그 다음 HBSS를 사용하여 세포를 2회 세척합니다.헤모사이토미터로 세포 수를 센 후, 세척된 GT를 37 °C의 HBSS에 추가하여 OD 600을 0.32로 맞춥니다. 효모형(YF) 스톡 현탁액을 만들려면, 대표적인 fungicell 콜로니를 선택하여 3 mL의 HBSS에 접종합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 배양액의 OD 600이 0.32가 될 때까지 배양하고, mL당 YF 형태의 수를 측정합니다. 이때 현미경으로 관찰된 세포의 99%가 YF 형태여야 합니다.GT 또는 YF 스톡 250 µL를 37 °C의 HBSS 25 mL에 옮겨 작동성 진균 스톡을 만듭니다. 이를 통해 mL당 10⁵ CFU가 됩니다. SRES ATCC 25923을 준비하려면, 냉동 스톡을 5% 양 혈액 한천 배지에 스트리킹하고 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다.2일 이내에 대표 콜로니를 선택하여 mannitol salts 배지에 옮기고 37 °C에서 18시간 동안 배양합니다. SRES 스톡을 만들려면, 대표 콜로니를 37 °C의 HBSS 3 mL에 현탁하여 OD 600을 0.132 또는 10⁸ CFU/mL로 맞춥니다. 워킹 스톡을 준비하려면, 스톡 현탁액 100 µL를 HBSS 25 mL로 옮깁니다.그 결과 밀리리터당 10⁵ CFU가 됩니다. 이 방법을 다른 유기체나 미생물 균주에 적용할 때의 첫 번째 핵심 단계는, 계수 가능한 충분한 수의 콜로니가 형성되도록 추가할 박테리아와 진균의 적절한 수를 결정하는 것입니다. 다종 미생물 바이오필름 분석을 수행하려면, 96웰 플레이트에 밀리리터당 2 × 10¹⁵개의 HeLa 세포가 포함된 용액 200 µL를 분주하십시오.플레이트를 37 °C에서 30분에서 45분 동안 흔들어준 후, 5% CO₂ 환경의 37 °C 인큐베이터에서 18시간 동안 배양하십시오. 1X optimum을 사용하여 단층 세포를 세척한 다음, 단일 HSV 균주를 접종하십시오. 한 번에 한 가지 균주만 테스트하십시오.플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 3시간 동안 배양합니다. 마그네슘과 칼슘이 포함된 37 °C PBS 100 µL를 사용하여 감염된 단층 세포를 세척합니다. 그 후, PBS를 37 °C HBSS로 교체합니다.각 웰에 HBSS 25 µL를 남겨둡니다. 다음으로 YF, GT 또는 SRES 작업 현탁액을 첨가하고, 5% CO₂ 조건의 37 °C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트의 한 열씩 흡입하여 제거합니다.마그네슘과 칼슘이 포함된 PBS 300 µL를 사용하여 웰을 즉시 다시 채웁니다. 이 세척 단계를 두 번 반복한 후, 필터 멸균된 RIPA 용해 버퍼를 1:50으로 희석하여 각 웰에 200 µL씩 첨가합니다. 다른 균주나 진균을 사용할 때는 사용되는 RIPA 농도가 세포 용해에는 충분하되, 미생물 생존력 테스트가 가능하도록 설정되었는지 확인하십시오.HeLa 세포 용해물을 빠르게 희석한 후, mannitol salts 또는 fungicell 배지에 50 µL를 피펫으로 분주합니다. 그다음 90도 각도로 구부러진 유리 막대를 사용하여 용해물을 플레이트 표면에 도말합니다. 플레이트를 18시간 동안 배양한 후, 플레이트당 콜로니 수를 수동으로 측정합니다.대조군은 HSV에 감염되지 않은 HeLa 세포에 부착된 SRES 또는 C.albicans로 구성됩니다. 이미징 연구를 수행하려면, 멸균 전 각 원형 유리 커버슬립을 아세톤으로 세척하십시오. 그런 다음 알코올과 화염으로 멸균한 핀셋을 사용하여 건조된 멸균 커버슬립을 멸균된 24웰 플레이트의 웰에 넣으십시오.커버슬립이 포함된 플레이트의 웰에 HeLa 세포를 분주합니다. 그 다음, 바이러스를 세포에 감염시킵니다. 감염 후, 템플릿에 따라 박테리아와 진균을 첨가하고, 앞서 96-웰 플레이트로 시연한 것과 동일하게 세포를 배양 및 처리합니다.마지막 세척 후, 커버슬립에 메탄올을 충분히 부어 세포를 고정한 다음, 메탄올이 증발하도록 둡니다. 명시야 현미경 관찰을 위해, 고정된 커버슬립이 들어 있는 웰에 탈이온수를 채웁니다. 즉시 물을 흡입하여 제거하고, 각 커버슬립이 잠길 정도로 충분한 양의 crystal violet을 첨가합니다.크리스탈 바이올렛으로 염색된 커버슬립을 탈이온수로 세척한 후, C2에서 건조시키고 표시된 슬라이드에 하드셋 마운팅 매질(hard set mounting medium)을 사용하여 부착하십시오. 형광 현미경 관찰의 경우, 메탄올로 커버슬립을 세척한 후 웰(well) 내에서 건조시키고 하드셋 마운팅 매질을 사용하여 표시된 슬라이드에 마운팅하십시오. 커버슬립을 덮기에 충분한 양의 1:20 희석 FITC 결합 HSV1 plus 2GD 항체를 첨가하십시오.슬라이드를 습도 챔버에서 37 °C로 30분 동안 배양합니다. 배양 후, PBS를 사용하여 커버슬립을 4회 세척합니다. 마지막 세척 단계 이후, 슬라이드를 다시 습도 챔버로 옮깁니다.dab B를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 슬라이드를 PBS로 4회 세척합니다. 마운팅 용액을 암실 내 실온에서 24시간 동안 경화시킵니다.그 다음, 명시야 또는 형광 현미경의 오일 렌즈를 사용하여 최소 50개 이상의 시야에서 공국소화를 관찰합니다. Staphylococcus 및/또는 Candida albicans 부착에 미치는 HSV의 영향에 대한 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. HSV1의 존재는 HeLa 세포에 대한 Staphylococcal 부착을 억제했습니다.효모 형태가 아닌 Candida의 발아관 형태의 존재는 Staphylococcal 부착 수준을 회복시켰습니다. HSV2에 감염된 HeLa 세포에서도 유사한 결과가 측정되었습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, Candida 발아관 형태의 부착 수준은 HSV1 감염 세포보다 HSV2 감염 세포에서 훨씬 더 높습니다.Candida 효모 형태에 대해 HSV1과 HSV2의 역효과를 측정하였습니다. 박테리아와 진균 사이의 상호작용을 시각화하기 위해 단층의 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 부착 패턴을 결정하였습니다. 그 후 형광 현미경을 사용하여 다른 미생물과의 관계에서 HSV의 존재 여부를 확인하였습니다.HSV가 없을 때, Staphylococci와 Candida의 효모 및 세균성 가성균사 형태 모두 HeLa 세포상에 공국소화되었습니다. 그러나 HSV에 감염된 세포에서는 Candida만이 관찰되었습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 8~9시간 만에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라, 바이러스의 세포 진입 후 나타나는 표면 수용체의 차등 발현과 같은 추가적인 의문에 답하기 위해 차등 형광 항체 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술이 개발된 이후, 인간 마이크로바이옴 분야의 연구자들은 조직 배양뿐만 아니라 장기 배양 시스템에서 미생물 간 상호작용 이후의 과정을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 서로 다른 분류학적 계(kingdom)를 아우르는 다종 미생물 상호작용 모델을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.병원체를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 비확산성 바이러스 strain의 사용 및 차단 기술과 같은 예방 조치가 필요함을 잊지 마십시오.

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.

Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

출처: Tay, S. B. 외 조작된 쿼럼 소환 락토나제를 이용한 병원성 바이오필름의 항병원성 파괴.  J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 병원성 박테리아에서 바이오필름 생체량을 정량화하는 방법을 시연하며, 처리되지 않은 대조군과 쿼럼 소환 효소로 처리된 샘플을 비교합니다. 이 효소는 초기 배양 과정에서 박테리아의 신호를 방해하여 세포 부착을 감소시킵니다. 세척 후 추가 배양 후 대조 우물은 밀도가 높은 바이오필름을 형성하는 반면, 처리된 우물은 형성이 감소합니다. 양이온염료를 사용해 바이오필름을 염색하고, 흡수도를 측정하여 생체량을 평가합니다.

병원성 박테리아에서 효소 유도 바이오필름 억제의 정량화

출처: Schlafer, S, Frost Kristensen, M. 교차 생물막에서 공초점 현미경을 이용한 세포외 pH 모니터링. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 구강 환경에서 Streptococcus mutans 와 Candida albicans 교차 생물막을 배양하여 박테리아-곰팡이 상호작용을 모델링하는 과정을 시연하며, 구강 병인에서 미생물 시너지, 글루칸 매개 부착, 산성 병원성 연구를 가능하게 합니다.

구강 병원 연구를 위한 박테리아-곰팡이 교차 생물막 구축

출처: 미켈 게녹, C. 외. 공초점 및 전자현미경을 이용한 섬유성 곰팡이 군락의 박테리아 바이오필름 정성적 다척도 분석에 관한 새로운 방법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 콜로판 형성과 방사형 성장을 지원하기 위해 처리된 셀로판 막 위에 곰팡이 배양물을 준비하는 과정을 보여줍니다. 그 후 상호작용 분석에 대한 토양 박테리아 세포의 배양 및 준비 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 박테리아 세포가 곰팡이 집락에 어떻게 부착하여 바이오필름을 형성하는지를 보여주어 박테리아-곰팡이 간 상호작용 연구를 가능하게 합니다.

바이오필름 형성을 위한 곰팡이-박테리아 공동 배양 확립

이 비디오는 박테리아와 곰팡이에 의해 바이러스에 감염된 세포에서 다미생물 생물막 형성이 시작되는 것을 보여줍니다. 단순 포진 바이러스 감염은 세포에 대한 박테리아 부착을 방해하여 박테리아-진균 공동 국소화를 방지합니다. 대조적으로, 감염되지 않은 세포는 박테리아-진균 공동 국소화 및 생물막 형성 시작을 나타냅니다.

바이러스에 감염된 세포에서 다미생물 생물막 개시를 결정하기 위한 분석

이 비디오는 현미경을 사용하여 곰팡이 균사에서 박테리아 생물막을 성장시키고 정성적으로 분석하는 방법을 설명합니다. 박테리아 생물막은 곰팡이 표면에 자주 형성되며 대사 협력, 경쟁 또는 포식과 같은 수많은 박테리아-곰팡이 상호 작용 과정을 포함합니다.

진균균사에서 박테리아를 형성하는 생물막을 시각화하기 위한 시료 전처리 방법

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

이 프로토콜에서는 호스트 생리 적 조건 하에서 Candida albicans 에 biofilm 형성을 시각화 하는 사용자 지정 가능한 자동화 된 미세 장치를 사용 하 여를 설명 합니다.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

이 프로토콜 사용 장 병원 체 부착, 세포 외 고분자 물질 매트릭스 형성, 평가 하 여 박테리아 biofilms의 동적 특성을 잡으려고 다각적인 접근을 사용 하 여 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 분석 리더 그리고 분산입니다.

담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술

이 프로토콜은 접종물의 준비, 크리스탈 바이올렛 염료를 사용한 마이크로타이터 플레이트의 생물막 정량화, 생물막의 생존 가능한 수 및 아시네토박터의 생물막 시각화에 대해 설명합니다.

Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략

학습하세요 HSV 감염 세포에 박테리아와 균류의 부착을 평가하는 방법을 통해 다중 미생물 상호작용을 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 만성 바이러스 감염이 기회주의적 병원체의 바이오필름 형성에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정

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