Name: 체세포 재 프로그래밍의 운동 측정 및 실시간 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 체세포 재프로그래밍의 실시간 운동 측정 및 시각화 방법을 흐름 세포측정법과 이미징을 활용하여 iPSC 생성 과정을 추적하는 기술입니다. 이 프로토콜은 줄기세포 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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저자는 도움이 토론 차드 맥아더 감사합니다.

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저자 [RHQ, JSTA, KS 및 UL] 모두는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기의 일부를 생산 써모 피셔 사이언 티픽의 직원입니다.

이 연구는 유세포 분석과 실시간 이미징 기반 분석을 사용하여 재프로그래밍 프로세스를 모니터링하고 추적하기 위한 전략을 제공합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 재프로그래밍 시작, 마커 표현을 기반으로 재프로그래밍 진행 상황 측정 및 재프로그래밍의 실시간 모니터링입니다. 선택한 모든 재프로그래밍 방법을 사용할 수 있지만 여기서는 인간 섬유아세포의 센다이 기반 재프로그래밍에 중점을 둡니다. 이 방법의 장점은 사용 편의성과 일관된 고효율 재프로그래밍입니다. 
재프로그래밍 진행을 평가하기 위해 세포는 재프로그래밍의 개별 단계에서 수확되고 종점 유세포 분석 대상이 됩니다. 음성 PSC 마커 CD44 및 양성 PSC 마커 SSEA4를 사용하여 재프로그래밍 배양을 이중 염색하면 재프로그래밍 진행을 평가할 수 있습니다6. 보다 구체적으로, 재프로그래밍의 개별 단계에서 둘 중 하나, 둘 중 하나 또는 둘 다 마커를 발현하는 세포의 분포는 서로 다른 조건에서 재프로그래밍 동역학의 ...

환자 유래 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 세포 치료 및 약물 검사를위한 유망한 도구입니다. 그들은 치료를위한 세포의자가 소스를 제공합니다. 또한, 이들은 현재 배아 줄기 세포 (ESC) 라인이 허용하는 것 이상의 유전 질환의 상세한 시험 관내 분석을 가능 유전 배경의 매우 광범위한 세트를 포함한다. 최근의 진보는 센다이 바이러스, 플라스미드 또는 에피 솜의 mRNA 1,2- 함께 프로그래밍 포함 iPSCs를 생성하는 여러 가지 방법의 개발을 이끌어왔다. 특히, 다양한 프로그래밍 방법은 효율성 및 안전성의 레벨 변화와 연관된 다양한 애플리케이션에 자신의 적합성에 영향을 미치는 다른 방법과 다를 가능성이있다. 프로그래밍 기술의 다양한 가용성, 상기 프로그래밍 프로세스를 평가하기위한 방법을 개발하는 것이 중요하게되었다. 대부분의 기존 방법은 형태 나 염색의 정성 검사에 의존줄기 세포 특이 염료 및 항체. 하나는 최근에 개발 된 방법은 PSC 별의 miRNAs 또는 분화 된 세포 고유의 mRNA 3에 민감한 렌티 바이러스 형광 기자를 사용합니다. 이러한 모니터링 방법은 선택과 다른 상황에 대한 재 프로그래밍 기술의 최적화를 용이하게한다. 예를 들어, 재 프로그래밍 CDy1 조절제 4 스크리닝하기 위해 초기 iPSCs하는 형광 프로브로서 사용되었다. 관찰하고 다른 프로그래밍 실험을 비교하는 기능은 프로세스 자체의 이해를 얻는데 중요하다. 예를 들어, 이제 일부 체세포 유형이 다른 5보다 쉽게 재 프로그래밍 것으로 알려져 있으며, 셀 6-8 재 프로그래밍 동안에 중간 상태를 끝까지. 불행하게도, 재 프로그래밍 절차의 기초가되는 메카니즘은 아직 완전히 이해되지 않으며, 따라서, 리 프로그래밍 방법의 정확한 차이 교리되도록 유지efined. 따라서, 모니터링 방법, 평가 및 재 프로그래밍 이벤트를 비교는 줄기 세포 분야에 대한 중요 할 것을 계속한다. 이 프로토콜에서 설명하는 방법은 모니터링을 허용하고, 프로그래밍 프로세스를 평가하고 이들 기술은 프로그래밍 시약의 상이한 세트를 비교하는 방법을 도시한다. 첫 번째 방법은 유세포 포함 양 및 음의 다 능성 줄기 세포 (PSC) 마커에 대한 항체의 조합을 사용하여 분석한다. 두 번째 방법 커플 실시간 영상 및 총 합류 (셀 적용 비율 표면적)와 마커 신호 (형광 신호에 의해 덮여 %의 표면적)의 합류 측정.

<table><tbody><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAXSupplement, 피루브산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 배아 줄기세포 인증, 미국 원산지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>마우스(ICR) 불활성화 배아 섬유아세포</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>부착 인자 단백질(1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 혈청 대체품</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-메르캅토에탄올 (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소, IV형, 분말</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x), 페놀 레드 없음&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, hESC 인증, 저성장 인자 기저막 매트릭스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) 재조합 인간 단백질</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>소 알부민 분획 V (7.5% 용액)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS Sendai 리프로그래밍 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai 리프로그래밍 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC 인간 포피 섬유아세포, 신생아</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 성인 인간 피부 섬유아세포</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG 세포 변이체 hESC hOct4-GFP 리포터 세포</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 항체, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 항체, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 항체 (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 항체 (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (클론 IM7), PE-Cy5 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live</td><td>Cell Imaging Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700 (더 이상 사용할 수 없음)</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor 488 접합체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11029</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-쥐 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor 594 접합체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11007</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소 생염색</td>제 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 생세포 이미징용 접합체 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>beta-2 Microglobulin 항체, FITC conjugate (B2M-01)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326 항체, FITC conjugate (VU-1D9)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E 항체 (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1 microscope&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 데이터 분석 소프트웨어</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune 음향 포커싱 사이토미터, 블루/레드 레이저</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>사용 Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e \ 세포 분류기 (488/561 nm)</td> <td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm 튜브 (셀 스트레이너 캡 포함</td>) <td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, 고선명도, 돔 씰 나사 캡</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 플라스크</td><td>코닝</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175 플라스크</td><td>코닝</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6웰 디쉬</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 롤링 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free 마이크로분리 튜브, 1.5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer 시료 주입</td><td></td>기 <td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

체세포 재 프로그래밍의 운동 측정 및 실시간 시각화

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

체세포 재프로그래밍은 성체 세포를 다양한 유전적 배경과 질병 표현형의 유도 만능 줄기세포(iPSC)로 전환할 수 있게 했습니다. 최근의 발전으로 재프로그래밍 요인을 도입하기 위한 보다 효율적이고 안전한 방법이 확인되었습니다. 그러나 재프로그래밍의 진행 상황을 모니터링하고 추적할 수 있는 도구는 거의 없습니다. 리프로그래밍을 모니터링하는 현재의 방법은 형태학의 정성적 검사 또는 줄기세포 특이적 염료 및 항체를 사용한 염색에 의존합니다. iPSC 생성의 진행 과정을 해부하는 도구는 다양한 세포 소스의 다양한 조건에서 프로세스를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 
이 연구는 유세포 분석을 사용하여 재프로그래밍 진행의 kinetic 측정과 이미징을 통한 실시간 모니터링을 위한 주요 접근 방식을 제시합니다. 재프로그래밍의 동역학을 측정하기 위해 양성 및 음성 만능 줄기 세포 마커에 대한 항체를 사용하여 개별 시점에서 흐름 분석을 수행했습니다. 실시간 시각화와 흐름 분석의 결합을 통해 여러 단계에서 재프로그래밍에 대한 정량적 연구를 수행할 수 있으며 다양한 시스템과 방법을 보다 정확하게 비교할 수 있습니다. 실시간 이미지 기반 분석은 섬유아세포가 피더가 없는 배지 시스템에서 재프로그래밍될 때 섬유아세포를 지속적으로 모니터링하는 데 사용되었습니다. 콜로니 형성의 동역학은 SSEA4 또는 TRA-1-60에 대한 살아있는 알칼리성 인산가수분해효소 염료 또는 항체로 염색한 후 위상차 또는 형광 채널의 합류를 기반으로 측정되었습니다. 그 결과, 합류점 측정은 재프로그래밍의 진행을 모니터링하기 위한 반정량적 메트릭을 제공한다는 것을 보여주었습니다.

유동 세포 계측법을 사용하여 재 프로그래밍의 속도론을 모니터링 SSEA4는 PSC 마커 6,10 동안 CD44는 섬유 아세포 마커입니다. 이 표현식 패턴에서 예상대로, 세포 계측법 BJ 섬유 아세포의 흐름 SSEA4 보여줍니다 - 흠 샘플과 함께 사분면 게이트의 생성을 촉진 CD44 + 인구. SSEA4 천천히 표현하면서 센다이 바이러스와 DF1 섬유 아 세포의 리 프로그래밍 동안, CD44은 점차 소실된다. CD44 + 세포와 7 일 (그림 1)에서 더 두드러진다 SSEA4 + CD44 + 세포의 작은 인구 ​​- 센다이 바이러스에 전달 후 3 일에서, SSEA4의 많은 인구가...

본 연구에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 이용하여 양 및 음의 다 능성 줄기 세포 마커의 운동 측정을 통해 프로그래밍 진행의 실시간 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 또한 IPSC 생성시 형태, 마커 또는 기자의 표현의 영상 기반의 평가를 포함한다.

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

이 절차들의 전반적인 목표는 체세포가 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍되는 과정을 시각화하고 추적하는 것입니다. 이 방법은 사용된 체세포 조직, 적용된 재프로그래밍 기술, 그리고 함께 사용된 매트릭스 및 배지 조합에 따라 재프로그래밍 역학과 효율이 어떻게 변화하는지와 같은 iPSC 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 세포 표면 마커를 이용하여 체세포가 iPSC로 전환되는 과정을 관찰함으로써, 재프로그래밍 사건들을 실시간으로 모니터링할 수 있다는 점입니다.형질도입 7일 후, 웰당 2 mL의 DPBS로 섬유아세포를 세척하고, 각 웰에 37 °C의 0.5% EDTA 0.5 mL를 첨가하여 37 °C에서 3~5분 동안 배양합니다. 세포가 둥글게 변하면 웰당 37 °C의 섬유아세포 배지 2 mL를 넣어 반응을 중단시키고, 배지를 각 웰의 바닥면에 부드럽게 피펫팅하여 세포를 떼어냅니다. 각 웰의 섬유아세포를 개별 15 mL 원추형 튜브로 옮긴 후 원심분리를 통해 수집합니다.펠렛을 2 mL의 신선한 37 °C 섬유아세포 배지에 재현탁하고 각 배양 조건의 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 1 × 10⁵개의 세포를 미리 준비된 6-웰 조직 배양 플레이트의 피더-독립적 조건화 웰에 분주하고, 형질도입된 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 각 웰의 배지를 세포 응용 분야에 적합한 배지로 교체합니다.그런 다음 플레이트를 이미저에 넣고, 향후 14일 동안 6~8시간마다 각 웰의 전체 위상차 및 형광 이미지를 연속적으로 캡처하도록 소프트웨어를 설정합니다. 리프로그래밍 실험이 끝나면, 37 °C DMEM/F12 배지 2 mL로 웰을 한 번 세척합니다. 세척액을 버리고, 신선한 DMEM/F12 배지에 희석한 적절한 1차 항체를 웰당 1 mL씩 넣어 인큐베이터에서 37 °C로 45분간 세포를 염색합니다.배양 종료 후, 37 °C의 DMEM/F12 배지로 세포를 2회 세척합니다. 그런 다음 세척액을 제거하고, 37 °C의 DMEM/F12 배지에 희석된 적절한 2차 항체 1 mL를 처리하여 37 °C에서 30분 동안 반응시킵니다. 배양이 끝나면 DMEM/F12 배지로 세포를 2회 더 세척합니다.그 후 각 웰의 세척액을 37 degree celsius의 신선한 DMEM/F12 배지 2 mL로 교체합니다. 디쉬를 이미저에 넣고 이미징 소프트웨어를 실행합니다. 이미징 시

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

경두개 자기 자극, 근전도 검사 및 3D 모션 캡처는 인간의 신경근 기능을 조사하기 위해 일반적으로 사용되는 비침습적 기술입니다. 이 백서에서는 이러한 세 가지 도구 모두에서 생성된 데이터를 동기식으로 샘플링하는 프로토콜과 가상 현실 자극 프레젠테이션 및 피드백의 고유한 추가에 대해 설명합니다.

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생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

당사는 밀접한 루프에서 인체와 심장 신호를 스트리밍, 매개 변수화, 분석 및 수정하는 공동 적응 인터페이스를 구축하기 위한 프로토콜 및 분석 방법을 제시합니다. 이 설정은 생물 물리학 변화를 추적하는 데 도움이 외부 감각 입력을 가진 사람의 말초 및 중추 신경계에서 파생 된 신호를 인터페이스합니다.

닫기 루프 인터페이스를 사용하여 재매개 변수화된 주변 신호의 실시간 프록시 제어

이 원고는 수축력 및 칼슘 취급 분석을 포함하여 기능분석에서 3D 인간 골격 근 미세 조직 및 최소 침습 다운스트림의 배열을 생성하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 골격 근육 미세 조직에서 골격 근육 건강의 기능 메트릭 평가

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

여기서, 광학 기반 플랫폼을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 수축성 및 칼슘 측정을 수행하는 확립된 방법이 설명되어 있습니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 돌연변이의 효과와 다양한 자극에 대한 반응을 빠르고 재현 가능한 방식으로 연구할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 칼슘 및 수축성 매개변수의 실시간 측정

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

배우세요 체세포 재프로그래밍의 실시간 운동 측정 및 시각화 방법을 흐름 세포측정법과 이미징을 활용하여 iPSC 생성 과정을 추적하는 기술입니다. 이 프로토콜은 줄기세포 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

체세포 재 프로그래밍의 운동 측정 및 실시간 시각화

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