RNA 결합 단백질의 검출에 의해 체외 RNA 풀다운

이 실험의 전반적인 목표는 갈색 지방 조직에서 RNA 전사체의 RNA 결합 단백질을 검색하는 것입니다. 이 방법은 longlife coding RNA 및 관련 RNA 단백질의 조절 메커니즘이 무엇인지와 같은 이 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 전술의 주요 장점은 수행하기 쉽다는 것입니다.

이 절차를 입증하는 데 사용된 RNA는 항원 수용체 3-프라임 번역되지 않은 영역(Antigen Receptor 3-Prime Untranslated Region)의 단편으로, 이하 AR 3-프라임 UTR이라고 합니다. 먼저 T7 AR 올리고와 psiCHECK-2 플라스미드에서 반딧불이 루시페라제 DNA의 부분 염기서열을 증폭합니다. 사용된 프라이머와 파라미터는 함께 제공된 문서에 자세히 설명되어 있습니다.

증폭 후 제조업체의 지침에 따라 in vitro transcription kit를 사용하여 PCR producs를 템플릿으로 사용하여 biotinylated RNA를 합성합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. in vitro 전사 후 반응에 1마이크로리터의 Dnase를 첨가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 템플릿 DNA를 분해합니다.

그런 다음 물로 총 부피를 최대 60마이크로리터까지 가져옵니다. 비오틴화된 RNA를 정제 컬럼에 적용하여 염과 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거합니다. 그런 다음 RNA 농도를 측정한 후 후속 풀다운 분석을 위해 RNase를 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

분석 당일, 얼음에서 동결된 비오틴화된 RNA를 해동합니다. 그런 다음 관심 RNA가 적절한 2차 구조를 갖도록 하기 위해 50마이크로리터를 섭씨 90도에서 2분 동안 가열합니다. 얼음에 2분 동안 식힙니다.

다음으로, 50마이크로리터의 2X RNA 구조 완충액을 추가하고 RNA가 실온에서 30분 동안 접히도록 합니다. 다음으로, 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 비드를 잠시 와류로 처리하여 원래 바이알에 다시 매달아 놓습니다. 그런 다음 150마이크로리터의 현탁액 비드를 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 놓아 마그네틱 비드와 상층액을 분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 폐기합니다. 비드 펠릿을 보관하십시오.

제조업체에서 권장하는 1X 바인딩 및 세척 버퍼의 1밀리리터에 비드 펠릿을 다시 현탁시켜 비드를 한 번 세척한 다음 튜브를 실온에서 5분 동안 회전기에 놓습니다. 버퍼 A와 버퍼 B로 두 번 세척합니다. 배양 후 상등액을 버리고 비드 펠릿을 보관하십시오.

다음으로, 비드 펠릿을 300마이크로리터의 2X 세척 및 결합 완충액에 재현탁합니다. 비드를 튜브당 100마이크로리터의 비드가 있는 3개의 1.5ml 튜브로 균등하게 나눕니다. RNase-free 물 100마이크로리터, 비오틴화된 반딧불이 루시퍼라제 RNA 100마이크로리터, 비오틴화된 AR 3-Prime UTR RNA 100마이크로리터를 추가합니다.

각 비드 혼합물을 실온에서 교대로 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 자석에 1분 동안 놓습니다. 상층액을 제거하고 폐기합니다.

비드 펠릿을 보관하십시오. 다음으로, 비드를 두 번 세척하고, 매번 400마이크로리터의 1X 세척 및 결합 버퍼로 비드 펠릿을 재현탁시킨 다음 실온에서 5분 동안 회전기에 놓습니다. 튜브를 자석에 1분 동안 놓습니다.

그런 다음 상층액을 모두 제거하고 버립니다. 각 비드 펠릿을 50마이크로리터의 핵 분리 버퍼에 재현탁합니다. 프로토콜의 다음 부분을 준비하기 위해 모든 버퍼와 dounce glass homogenizers를 얼음 위에서 냉각해야 합니다.

세포 용해물 준비는 얼음에서 진행해야 합니다. 수행할 각 RNA 풀다운 분석을 위해 3주 된 C57 Black Six 야생형 마우스에서 분화된 지방세포로 구성된 15cm 접시 하나를 준비합니다. 4-5일 후, 세포를 채취하기 위해 10-15밀리리터의 PBF를 첨가한 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 세포를 제거합니다.

50ml 튜브에 옮긴 다음 실온에서 5분 동안 200배 G로 원심분리하여 펠릿화합니다. 탈수 후 1ml 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 버립니다. 그런 다음 세포 펠릿을 2ml의 저장성 완충액에 재현탁시키고 15분 동안 얼음 위에서 세포를 배양합니다.

세포를 15 밀리리터 dounce 유리 균질화기로 옮기고 20 스트로크로 얼음 위에서 세포를 기계적으로 전단합니다. 세포핵을 3300배 G로 원심분리하여 섭씨 4도에서 15분 동안 펠렛화합니다. 탈수 후 상등액을 1.5ml 튜브로 옮기고 나중에 사용할 수 있도록 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.

상층액에 3-몰 염화칼륨을 첨가하여 150 millimolar의 최종 농도를 얻습니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 20, 000회 G로 회전합니다. 원심분리 후 상단에 지질층이 생깁니다.

1밀리리터 피펫을 사용하여 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 시토플라스믹 세포 용해물 상층액을 수집합니다. 다음으로, 1밀리리터 피펫을 사용하여 핵 펠릿을 1밀리리터의 핵 분리 완충액에 재현탁시키고 15밀리리터 도움 유리 균질기로 옮깁니다.

얼음 위에서 100번의 스트로크로 핵을 기계적으로 깎습니다. 20, 000 시간 G에 원심 분리에 의하여 핵 파편을 4 섭씨 온도에 15 분 동안 펠릿으로 만드십시오. 상층액을 핵 세포 용해물로 수집합니다.

이들은 이전에 수집된 세포질 용해물과 결합하거나 나중에 적용하기 위해 별도로 보관할 수 있습니다. 여기에서 샘플은 1:1의 비율로 결합됩니다. 분획되지 않은 세포 용해물에 RNase 억제제를 첨가하여 마이크로리터당 0.5 단위의 최종 농도를 얻습니다.

그런 다음 100마이크로리터의 세포 용해물을 얼음 위에 따로 보관하여 웨스턴 블로팅을 위한 입력 제어로 사용합니다. 세포 용해물을 각 1.5ml 튜브에 1ml의 세포 용해물이 있는 3개의 동일한 분취액으로 분할하고 빈 반딧불이 루시퍼라제 RNA 접합 및 AR 3-Prime UTR 접합 비드를 각각 섭씨 4도에서 3시간 동안 회전하면서 배양합니다. 배양 후 튜브를 자석에 1분 동안 놓습니다.

1밀리리터 피펫을 사용하여 상층액을 채취한 다음 RNA를 분리하고 첨부 문서에 설명된 대로 RNA의 온전함을 평가합니다. 비드 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. 마그네틱 비드를 6번 세척합니다.

매번 40 단위의 RNase 억제제와 0.25% 이게팔을 포함하는 1ml의 핵 분리 완충액에 비드 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 튜브를 2분 동안 회전시킵니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓아 마그네틱 비드와 상층액을 분리합니다.

1분 후 흡입하여 상층액을 버린 다음 비드 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 웨스턴 블로팅(western blotting)을 위해 비드에서 RNA 단백질 복합체를 용리시키려면, 먼저 각 비드 펠릿을 75마이크로리터의 핵 분리 완충액에 재현탁시킵니다. 그런 다음 25마이크로리터의 4X 웨스턴 블롯 로딩 버퍼를 추가합니다.

SDS를 포함하여 총 부피 100 마이크로 리터를 얻습니다. 마지막으로 이 100마이크로리터 용액에 구슬을 넣고 섭씨 95도에서 5분 동안 끓입니다. 함께 제공된 문서에 설명된 대로 RBP 검증을 위해 웨스턴 블로팅을 수행합니다.

이 실험에서는 항원 수용체 RNA 단편을 결합 단백질인 HuR을 포획하기 위한 미끼로 사용했습니다. HuR 단백질과 관련이 없는 반딧불이 루시퍼라아제 RNA 미끼와 결합되지 않은 빈 스트렙타비딘 비드의 분취량은 모두 음성 대조군으로 작용했습니다. RNA 단백질 상호 작용은 핵 또는 세포질에서 발생할 수 있으며, 이 풀다운 프로토콜은 전체 또는 분획된 핵 또는 세포질 세포 용해물에 적용할 수 있습니다.

웨스턴 블로팅(western blotting)에 의한 분석은 단클론 항체를 사용하여 분획되지 않은 세포 용해물 또는 입력에서 HuR 단백질을 보여주었습니다. 항원 수용체 RNA elusion fraction도 긍정적인 결과를 보였는데, 이는 RNA 풀다운 분석을 위한 항원 수용체 RNA 접합 비드를 사용하여 지방 세포 용해물에 HuR 단백질이 존재함을 나타냅니다. 반딧불이 루시퍼라제 RNA 용출 분획과 빈 비드 샘플 모두 음성 결과를 나타냈으며, 이는 이 접근 방식을 사용하여 비특이적 상호 작용을 검출할 수 없음을 나타냅니다.

종합하면, 이러한 결과는 항원-수용체 RNA 단편과 HuR 단백질 사이의 상호 작용이 특이적임을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 갈색 지방 조직에서 RNA 전사체에서 RNA 결합 단백질을 검색하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 마스터하면 제대로 수행되면 24시간 내에 완료할 수 있습니다.