Name: RNA 결합 단백질의 검출에 의해 체외 RNA 풀다운 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 배우세요 체외 RNA 풀다운 기법을 사용하여 갈색 지방 조직에서 RNA 결합 단백질을 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 안드로젠 수용체 3-프라임 UTR을 이용하여 특이적인 단백질 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 싱가포르 NRF의 교제 (NRF-2011NRF - NRFF001-025)뿐만 아니라 CBRG (NMRC / CBRG가 / 0070 / 2014)에 의해 투자되었다.

참고 :이 연구의 맥락에서 관심의 RNA는 AR 3&#39;UTR의 단편이다. 비오틴 표지 RNA 1. 준비 <ol><li> RNA를 얻으려면, 상용 키트를 사용하여 제조 업체의 지침 (11)는 다음의 시험 관내 전사 다음 PCR에 의해 T7-AR-올리고을 증폭. 참고 : PCR 프라이머는 표 4에 나열되어 있습니다 : T7-AR-F와 T7-AR-R을. </li><li> 비특이적 결합 제어를 들어, 시험 관내 전사 하였다 psiCHECK -2- 플라스미드로부터 PCR에 의해 반딧불 루시페라아제 (FL) DNA의 부분 서열을 증폭. 참고 : PCR 프라이머는 표 4에 나열되어 있습니다 hluc (+) - T7 프로브 F 및 hluc (+) - 프로브-R 표 4 PCR 증폭을위한 템플릿과 프라이머 시퀀스... </li><li> 50 ㎕의 PCR 반응에서, 50 ng의의 DNA (올리고 또는 플라스미드)의 4 μL의 dNTPs (각 2.5 mM의 dNTP), 5 ㎕의 10 배 반응 완충액 1 ㎕를 2.5 U / &amp; # 믹스(181), 리터 DNA 중합 효소, 2 μL 10 μm의 정방향 프라이머, 2 μL 10 μm의 역방향 프라이머, 및 뉴 클레아없는 물. <ol><li> 다음 프로그램을 사용하여 열 순환기 PCR 증폭을 실행. STEP1 : 2 분, 95 ℃ 1주기; STEP2 : 30 초 동안 95 ° C의 35주기, 30 초 동안 55 ° C 및 30 초 (AR) 또는 60 초 (FL) 72 ° C; STEP3 : 10 분 동안 72 ℃에서 1주기. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침 11 다음 시험 관내 전사 키트를 사용하여 바이오틴의 RNA를 합성. 이 실험에서는, RNA 합성 템플릿으로 PCR 제품을 사용한다. 20 ㎕의 시험 관내 전사 반응에 200 ng를 PCR 증폭 된 DNA, 각 NTP 2 μL, 1 ㎕의 10 mM이 비오틴 CTP-2 배 μL 반응 완충액, 2 μL의 T7 RNA 폴리머 라제를 혼합한다. 4 시간 동안 37 ℃에서 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 37 &amp; #에서 시험 관내 전사, 1 μL 2 U / μL DNase의와 치료 반응 혼합물에 따라(176), C 15 분 주형 DNA를 분해합니다. 마지막으로, 이후의 정제하여 60 ㎕의 총 부피로 오티 닐화 RNA 희석. </li><li> 제조업체의 지침 12 다음 정화 열을 사용하여 염 및 비법 인 세포핵을 제거하기 위해 비오틴 RNA를 정화. 다음 풀다운 분석을 위해 -80 ° C에서 RNA 농도 및 저장을 측정합니다. </li><li> 2 분, 2 분 동안 얼음에 진정 90 ° C에서 RNA 단백질 상호 작용, 열 50 μL 비오틴 RNA (50 PM)에 대한 관심의 RNA에 대한 적절한 이차 구조를 보장하기 위해, 다음 50 μl의 2 배 RNA 구조 버퍼 (표와 공급 3), 13, 14 및 30 분 동안 실온에서 접는 RNA 허용한다. </li></ol> RNA 접합 비즈 2. 준비 참고 : 자기 구슬과 상등액의 분리 자기 스탠드를 사용합니다. <ol><li> 간단한 vorte하여 원래 바이알의 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 자성 비드를 재현 탁싱은 제조업체의 지침에 따라. 1.5 ML 튜브에 비즈를 재현 탁 150 μl를 전송합니다. 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 폐기 뜨는. 비드 펠렛을 유지합니다. 참고 : RNA 풀다운 분석에서, 원래 유리 병에서 재현 탁 구슬을 분취 때, MS 다음에 분석을 위해 서부 블롯 다음에 분석을 위해 50 μl의 구슬, 200 μl의 구슬을 사용합니다. </li><li> 다시 현탁 제조자의 권장 1X W 및 B의 1 ml의 비드 펠렛 (결합 및 세척) 완충액 (표 3)에 의해 회 비드 워시 회전기에 실온에서 5 분 동안 튜브를 회전 하였다. 폐기 뜨는. 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 400 ㎕의 완충액 A의 완충액 A로 비드 펠렛을 재 - 현탁하여마다, 구슬의 RNase 불 활성화 회 비드 씻어 0.1 M NaOH를 0.05 M의 NaCl (표 3)를 함유하는 알칼리성 용액이다. 회 전자에서 실온에서 2 분 동안 튜브를 돌린다. 폐기 뜨는. 비드 펠렛을 유지합니다. </li> &lt;리&gt; 회전기 실온에서 2 분 동안 튜브를 회전 뒤에 다시 현탁 400 ㎕의 완충액 B로 비드 펠렛 (표 3)에 의해 회 비드 씻어 비즈마다 NaOH를 제거한다. 폐기 뜨는. 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 300 ㎕의 2 배 W &amp; B 버퍼를 Resuspend 비드 펠렛, 분할 구슬 똑같이 세 1.5 ml의 튜브 (튜브 당 100 μl의 구슬)로 전송합니다. 100 μL의 RNase없는 물과 비드 함유 공급 튜브 100 μL는 FL의 RNA 각각 AR 3&#39;UTR RNA 바이오틴 100 μL를 비 오티 닐화. </li><li> 회전을 실온에서 1 시간 동안 각 비드 혼합물을 인큐베이션. 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 모든 상층 액을 버린다. 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 400 ㎕의 1X W 및 B 버퍼 각각 비드 펠렛을 다시 현탁 회마다 비드를 세척 회전기에 실온에서 5 분 동안 튜브를 회전 하였다. </li><li> 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 모든 상층 액을 버린다. 각 비드 PELLE를 재현 탁50 μl의 핵 분리 버퍼 (표 3)와 t. </li></ol> 3. 지방 전구 세포의 분리 및 지방 생성 유도 <ol><li> 이전 서적 5에 기재된 바와 같이, 견갑골 갈색 지방 패드로부터 전구 지방 세포 (C57BL6 야생형 마우스, 3 주)를 해부. </li><li> 성장과 체외에서 전구 지방 세포 (5) 차별화. 세포는 4~5일 분화 개시 후 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 차 지방 세포에서 세포 용 해물 4. ​​준비 주 : 파쇄 제제의 모든 절차를 확인 얼음에 만들어진 모든 버퍼 얼음에 냉각된다. 얼음 사전 냉각 다운스 유리 균질. <ol><li> 성장과 15cm 요리 (5) (3.2 절 참조) 전구 지방 세포를 분화. 각각의 요리는 하나의 RNA 풀다운 분석을위한 충분한 세포를 제공한다. 일 4 분화 폐기 세포 배양액 일 5, 세탁에서 CE한 번 1X PBS와 LLS. </li><li> RT에서 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 50 ML 튜브에 세포 및 펠렛 세포를 수집 긁어, 세포를 수확 세포에 10 ~ 15 ㎖의 1X PBS를 추가합니다. 1 ML의 피펫을 이용하여 상층 액을 버린다. </li><li> 재현 탁 셀이 용액에 펠릿 저장성 완충액 (표 3), 및 15 분 동안 얼음 위에서 세포를 배양한다. 전송 15 ml의 다운스 유리 균질에 세포 및 기계적으로 얼음에 20 스트로크와 전단 세포. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 3,300 XG에 원심 분리하여 펠렛은 세포 핵. 더 사용하기 위해 얼음에 핵 펠렛을 유지 (섹션 4.6 참조). 1.5 ml의 튜브에 뜨는을 전송, 4 ℃에서 15 분 동안 20,000 XG에서 최종 150 mm의 농도와 스핀을 얻을 수 뜨는하는 3M의 KCl을 추가합니다. </li><li> 원심 분리 후, 조심스럽게 1 ml를 피펫을 사용하여 상단 lipidlayeron 제거하고 세포질 세포 용 해물로 뜨는를 수집합니다. </li><li> 핵 펠렛을 재현 탁 1 ml의 핵 분리 버퍼 (4.4 절 참조). 티를 ransfer의 1 ML의 피펫을 사용하여 15 ml의 다운스 유리 균질에 핵, 기계적으로 100 스트로크와 얼음에 전단 핵. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 핵 파편 펠렛, 핵 세포 용 해물로 뜨는를 수집합니다. </li><li> 어느 쪽의 핵 및 세포질 세포 용 해물을 결합, 또는 다운 스트림 풀다운 응용 프로그램에 대해 개별적으로 각 부분을 사용합니다. 데모 실험에서, 세포 용 해물이 두 분획 1의 부피비로 혼합 하였다 1. </li><li> 0.5 U / μL의 최종 농도를 얻기 위해,이 분획을 세포 용 해물의 RNase 억제제를 추가한다. 웨스턴 블롯 (15)의 입력 컨트롤로 세포 용 해물의 옆 100 μl를 설정합니다. </li></ol> 5. 바인딩 및 RBP의 용출 <ol><li> 분할 셀 세 동일한 분취 량에 해물 (1.5 ML 튜브에 1 ㎖의 세포 용 해물), 빈과 부화는 FL RNA 접합 및 AR 3&#39;UTR RNA 접합 비즈는 4 °에서 3 시간 동안 각각 (섹션 2.8 참조) 기음회전. </li><li> 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. RNA의 완전성을 확인하기 위해 상층 액에서 RNA 분리에 이어 1 ml를 피펫을 이용하여 상층 액을 수집합니다. 제조자의 지시 (표 2) 다음 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 용액을 이용하여 RNA를 분리. 리보좀 RNA의 28S 및 18S 서브 유니트를 분석해서 RNA의 intactness 평가. 얼음에 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 회 전자에서 실온에서 2 분 동안 튜브를 회전이어서 40 U의 RNase 억제제 및 0.25 % IGEPAL를 함유 한 용액의 핵 차단 완충액으로 각 비드 펠렛을 재현 탁하여 자성 비드 여섯 번마다 세척 하였다. 자기 구슬과 상층 액의 분리를위한 자기 스탠드를 사용합니다. 모든 상층 액을 버린다. 얼음에 비드 펠렛을 유지합니다. </li><li> 웨스턴 블로 팅을위한 비즈에서 RNA 단백질 복합체를 용출 다음 단계를 사용하십시오. 먼저, 75 μL 핵 분리 버퍼의 각 비드 펠렛을 재현 탁; 다음, 25 ㎕의 4 배 웨스턴 블롯 로딩 버피를 추가FER은 (SDS 함유) 100 μl의 총 부피를 얻었다. 마지막 5 분 동안 95 ℃에서 100 μL이 용액에 비드를 끓인다. 참고 : 사용이 단계는 MS에 대한 비즈에서 RNA 단백질 복합체를 용출 다음과 같습니다. STEP1 : 100 μL 용출 버퍼 (표 3)의 각 비드 펠렛을 재현 탁; STEP2는 : 회전 실온에서 2 ~ 3 시간 동안 비드 샘플을 품어; STEP3 : 원심 분리기와 단백질 함유 상층 액을 수집; STEP4는 : MS에 제출하기 전에 20 ~ 30 μL에 단백질 솔루션을 집중한다. </li><li> 원심 분리기는 각각 100 4 ° C에서 30 초 동안 12,000 XG에 비드 샘플의 μL, 그리고 상층 액을 수집합니다. 웨스턴 블롯 분석 (섹션 6.1 및 6.2 참조) 나누어지는 15 μl의 상층 액. 하룻밤 (1000 희석 1) 희석 허 마우스 단일 클론 항체로 인한 막 프로브. </li></ol> RBP의 검증 6. 웨스턴 블로 팅 <ol><li> 표준 기술을 이용하여 SDS-PAGE에 의해 분리 RBPs. </li><li> 우리를 실시선미 관심의 RNA와 관련된 RBPs에 대한 프로빙에 의해 표준 기술을 사용하여 블로 팅. 주 :이 데모 실험에서 허 마우스 모노클로 날 항체 허 단백질의 면역 검출에 사용되었다. </li><li> 희석 허 항체 생성 된 막 품어 : w / V의 탈지 분유, 1 배 TBS 5 % (1 천 희석) 0.1 % 트윈 - 20 (4)에서 하룻밤, 부드러운 진탕 C를 °. 1X TBST로 막 세 번 씻으십시오. 1 시간 동안 실온에서 (항 - 마우스 IgG-HRP 염소) 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션. 워시 막. 개발 및 기록 신호. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

lncRNAs 및 RBPs 그러나 이러한 분자의 분자 메커니즘을 제대로 이해, 건강과 질병에 중요한 역할을합니다. lncRNA 분자와 상호 작용하는 단백질의 식별 규제 메커니즘을 해명을 향한 중요한 단계입니다. RNA의 풀다운 분석 시스템에 의한 RBPs의 보충은 세포 용 해물로부터 단백질을 선택적 스트렙 자성 비드에 결합 된 비오틴 RNA 베이트를 사용하여 추출 될 수 있도록 복잡한 상호 작용의 인 용액 캡쳐에 기초한다. 이러한 처프, 도표 및 RAP와 같은 여러 가지 다른 방법 그러나 이러한 방법은 RNA 풀다운 기술 16,17,18보다 설정에 더 많은 노력이 필요합니다, 같은 목표를 달성 할 수있다. RNA 풀다운의 주요 장점은 비교적 간단한 프로토콜을 수행하기 쉬운 점이다. 두 CHIRP와 RAP RNA는 단백질 복합체 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 전체 세트의 설계를 자연적으로 보존하는 가교 공정을 포함하는 (90 nuclenucleotides...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
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Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

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Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs 세포의 이중 또는 단일 가닥 RNA에 결합하여 RNA - 단백질 복합체 형성에 참여하는 단백질이다. RBPs는 mRNA의 긴 비 암호화 RNA를 (lncRNAs)를 포함하는 RNA 종의 다양한 결합 및 전사 후 수준에서 자신의 영향력을 행사할 수있다. 두 RBPs 및 lncRNAs은 지방 개발 등 새로운 규제를 신흥 1,2,3 작동된다. 이 특정 RNA 분자와 하나 이상의 RBPs 사이의 상호 작용을 검출하는 것이 필요는 RBP- 메커니즘 및 세포질 통로의 lncRNA 매개 규제를 이해하고, 때로는 RNA의 단백질 파트너의 전체 스펙트럼을 식별 할 성적 증명서. 그러나, 실험에 의한 지방 세포에서 지질의 높은 함량에 어려울 수있다. 여기에 설명 된 RNA 풀다운 프로토콜 4,5 차 배양 지방 세포의 용 해물에서 특정 RNA의 단백질 파트너를 검색하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토에 대한 이론적 근거다음 COL 요약된다. RNA를 미끼는 DNA 주형으로부터 전사 된 시험관에, 비오틴 - 표지 된 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 자성 비드 (4)과 공액. RNA를 미끼이어서 자기 스탠드에서 내려 오게되는 RNA 단백질 복합체의 형성을 허용하는 세포 용 해물과 배양된다. 구체적으로는, RNA 풀다운 프로토콜은 후술 허 단백질 일차 배양 theadipocytelysate에서의 mRNA의 3&#39;UTR 6,7 결합 보편적 RBP 발현을 검색 미끼 AR 3&#39;UTR로부터 RNA 단편을 사용한다. 이 분석의 결합 특이성을 테스트하려면, 비 관련 RNAas 아니라 빈 스트렙 타비 딘 비드 제어 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 특정 RBP의 포착을 확인하거나 캡처 RBPs 각각 8의 전체 레퍼토리를 식별하는 웨스턴 블 롯팅 또는 질량 분석기 (MS)와 호환된다. 몇 가지 기술은 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다에스. 주어진 RBP, RIP (RNA의 면역)와 CLIP (UV 가교 및 면역)에 구속 RNA를 공개하기 위해하는 것은 적용 할 수 있습니다. 반대로, 소정의 RNA의 단백질 파트너를 식별하기 위해, RNA 풀다운는 처프 (RNA 정제하여 염색질 분리) CHART (RNA 타겟 캡처 혼성화 분석)와 RAP (RNA 안티센스 정제)에 적용될 수있다. 나중에 사람과 비교하여, RNA 풀다운 기술은 설정하는 작은 노력이 필요합니다. 생체 외 및 생체 내에서 단백질을 포착하기 위해 사용될 수있다. 그 시험관 대응보다 기술적으로 더 도전 RNA 풀다운,의 생체 방법은 세포에서 가교에 의해 RNA 단백질 상호 작용을 유지, 세포로부터 관심의 앱 타머 - 태그 RNA를 캡처하고,이어서 바인딩 RBPs를 감지합니다. RNA 풀다운 낮은 풍부한 RBPs 농축 및 분리 및 세포 조절을 제어 9,10 다양한 기능적 역할이 RNA 단백질 복합체를 식별하기 위해 사용될 수있다 </s&gt;입니다.

<table><tbody><tr><td>이 연구에 사용된 주요 자료.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&nbsp; Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>비오틴-14-CTP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway 스핀 컬럼&nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 스트렙타비딘&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) 마우스 단클론 항체 (sc-5261)&nbsp;</td><td>산타크루즈 생명공학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG-HRP(sc-2005)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure 분자 생물학 등급 물 (뉴클레아제 없음)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수 (1&times; PBS)</td><td>&nbsp; HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제&nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA 중합효소&nbsp;</td><td>애질런트 테크놀로지</td><td></td><td></td>스</tr><tr><td>TRIsure</td><td>&nbsp; Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>이 연구에 사용된 주요 장비.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R 원심분리기&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 열 순환기&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나노드롭 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO 로테이터 멀티 바이오 RS-24&nbsp;</td><td>BOECO, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단백질 젤 전기 영동 및 블로팅 장치&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석&nbsp;</td><td>생명 기술</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna 결합 단백질의 검출에 의해<em&gt; 체외</em지방 세포 문화&gt; rna 풀다운

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA 결합 단백질 (RBPs)은 지방의 개발 및 기능의 규제 계층으로 부상하고있다. RBPs 대상의 mRNA의 안정성 및 병진 효율에 영향을 미치는하여 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하는 중요한 역할을한다. RNA 풀다운 기술은 널리기구 RBPs &#39;아니라 긴 비 코딩 RNA를&#39;(lncRNAs) 함수를 기초 해명 할 필요가 RNA - 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 사용되었다. 그러나, 지방 세포에서 높은 지질 풍요 로움이 실험 수행에 기술적 인 도전을 포즈. 다음은 자세한 RNA 풀다운 프로토콜은 기본 지방 세포 배양에 최적화되어 있습니다. 안드로겐 수용체의 (AR) 3 &#39;번역되지 않은 지역 지방 세포 lystate에서의 RBP 파트너, 허 단백질을 검색하는 방법을 보여주기 위해 예를 들어 사용되는 아데 닐 - uridylate 풍부한 elementwas를 포함 (3&#39;UTR)에서 RNA 조각. 여기에 설명 된 방법의 상호 작용을 검출하기 위해 적용될 수있다RBPs 및 비 암호화 RNA를,뿐만 아니라 사이 RBPs 및 코딩 RNA를.

데모 실험에서, AR RNA 단편은 결합 단백질 허 캡처 미끼로서 사용 하였다. 모두 허 단백질 비 관련있는 플로리다 RNA 미끼 ​​및 접합 빈 스트렙 타비 딘 비드의 분취 량은 부정적인 컨트롤을 제공합니다. RNA - 단백질 상호 작용은 핵 또는 세포질 중 발생할 수 있으며,이 풀다운 프로토콜 또는 총 분획 (핵 또는 세포질) 세포 용 해물 중 하나에 적용될 수있다. 웨스턴 블로 팅에 의한 단백질의 분석은 15 μl의 미분 획 세포 용 해물의 샘플이없는 구슬 입력 컨트롤로, 허 단백질을 사용하여 마우스 차 문화의 지방 세포 용 해물에서 검출 된 것을 나타내는, 긍정적 인 결과를 준, (섹션 4.8 참조)를 보여줍니다 단일 클론 항체. 아칸소 RNA 용출 분획 허 단백질은 RNA 풀다운 검정에 대한 AR RNA 접합 비드를 이용하여 지방 세포 용 해물에서 검출되었음을 나타내는 긍정적 인 결과를 주었다. FL RNA 용출 분획 및 B 둘여윈 비드 샘플뿐만 아니라 빈 구...

RNA 풀다운 프로토콜은 RNA 결합 단백질 (RBPs) 및 비 암호화뿐만 아니라 코딩 RNA를 사이의 상호 작용의 검출을 위해 여기에 최적화되어 있습니다. 안드로겐 수용체 (AR)에서 RNA 조각은 차 갈색 지방 세포의 lystate로부터 RBP를 검색하는 방법을 보여주기 위해 예로서 사용되었다.

RNA 결합 단백질의 검출에 의해<em&gt; 체외</em지방 세포 문화&gt; RNA 풀다운

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

이 실험의 전반적인 목표는 갈색 지방 조직의 RNA 전사체로부터 RNA 결합 단백질을 회수하는 것입니다. 이 방법은 긴 수명의 코딩 RNA의 조절 기전과 관련 RNA 단백질은 무엇인지와 같은 이 분야의 주요 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 전략의 주요 장점은 수행하기 쉽다는 점입니다.본 절차를 시연하는 데 사용된 RNA는 항원 수용체 3-프라임 비번역 영역의 단편이며, 이후 AR 3-Prime UTR로 지칭합니다. 우선 T7 AR 올리고와 psiCHECK-2 플라스미드로부터 유래한 반딧불이 루시페라제 DNA의 부분 서열을 증폭하십시오. 사용된 프라이머 및 매개변수는 첨부 문서에 자세히 설명되어 있습니다.증폭 후, 제조사의 지침에 따라 인비트로 전사(in vitro transcription) 키트를 사용하여 PCR 산물을 템플릿으로 biotinylated RNA를 합성합니다. 그다음, 혼합물을 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 인비트로 전사 후, 반응액에 1 µL의 Dnase를 첨가하고 37 °C에서 15분 동안 배양하여 템플릿 DNA를 분해합니다.그 다음, 물을 사용하여 최종 부피를 60 µL로 맞춥니다. 염과 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하기 위해 비오틴화된 RNA를 정제 컬럼에 적용합니다. 이후 RNA 농도를 측정한 다음, 후속 풀다운 분석(pull-down assay)을 위해 RNase를 -80 °C에서 보관합니다.분석 당일에 냉동된 biotinylated RNA를 얼음 위에서 해동합니다. 그 다음, 표적 RNA가 적절한 2차 구조를 형성하도록 50 µL를 90 °C에서 2분 동안 가열합니다. 이후 얼음 위에서 2분 동안 냉각합니다.다음으로, 50 µL의 2X RNA structure buffer를 첨가하고 실온에서 30분 동안 RNA가 접히도록 둡니다. 이어서, streptavidin-coated magnetic beads를 짧게 볼텍싱하여 원래 바이알 내에서 재현탁합니다. 그런 다음, 재현탁된 비드 150 µL를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.자기 비드와 상층액을 분리하기 위해 튜브를 자석 스탠드에 1분 동안 둡니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 비드 펠릿은 그대로 유지합니다.제조사에서 권장하는 1X 결합 및 세척 버퍼 1mL에 비드 펠릿을 재현탁하여 비드를 한 번 세척한 다음, 튜브를 회전 혼합기에 넣고 상온에서 5분 동안 반응시킵니다. 버퍼 A와 버퍼 B로 두 번 세척합니다. 배양 후, 상층액은 버리고 비드 펠릿만 남깁니다.다음으로, 비드 펠렛을 300 µL의 2X 세척 및 결합 버퍼에 재현탁합니다. 비드를 세 개의 1.5 mL 튜브에 동일하게 나누어 튜브당 100 µL씩 분배합니다. 여기에 RNase-free water 100 µL, 비오틴화된 firefly luciferase RNA 100 µL 및 비오틴화된 AR 3-Prime UTR RNA 100 µL를 각각 추가합니다.각 비드 혼합물을 상온에서 1시간 동안 회전시키며 배양합니다. 그다음, 튜브를 마그넷 위에 1분 동안 둡니다. 상층액을 제거하여 버립니다.비드 펠릿을 유지합니다. 다음으로, 비드 펠릿을 400 µL의 1X washing and binding buffer로 각각 재현탁한 후, 상온의 회전 혼합기(rotator)에서 5분 동안 반응시키는 과정을 두 번 반복하여 비드를 세척합니다. 튜브를 자석 랙에 1분 동안 놓아둡니다.그 다음, 모든 상층액을 제거하여 버립니다. 각 비드 펠렛을 50 µL의 핵 분리 완충액에 다시 현탁합니다. 프로토콜의 다음 단계를 준비하기 위해, 모든 완충액과 dounce 유리 균질기는 얼음 위에서 냉각되어 있어야 합니다.세포 용해물 준비는 얼음 위에서 진행해야 합니다. 수행할 각 RNA 풀다운 분석(pull-down assay)을 위해, 3주령의 C57 Black Six 야생형 생쥐 유래 분화된 전지방세포가 담긴 15cm 디쉬 하나를 준비하십시오. 4~5일 후, 세포를 수확하기 위해 10~15 mL의 PBF를 첨가한 다음, 세포 스크레이퍼를 사용하여 디쉬에서 세포를 제거하십시오.세포들을 50-milliliter 튜브로 옮긴 후, 상온에서 200 times G로 5분간 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 원심분리가 끝나면 1-milliliter 피펫을 사용하여 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그다음, 세포 펠릿을 2 milliliters의 저장액(hypotonic buffer)에 재현탁하고 세포를 얼음 위에서 15분간 배양합니다.세포를 15-milliliter dounce glass homogenizer로 옮기고, 얼음 위에서 20회 스트로크하여 기계적으로 파쇄합니다. 4°C에서 3300 ×g로 15분간 원심분리하여 세포핵을 펠릿화합니다. 원심분리 후, 상층액은 1.5-milliliter 튜브로 옮기고 펠릿은 추후 사용을 위해 얼음 위에 보관합니다.상층액에 3 M 염화칼륨을 첨가하여 최종 농도가 150 mM이 되도록 합니다. 4 °C에서 20,000 ×g로 15분간 원심분리합니다. 원심분리 후, 상단에 지질층이 형성됩니다.1mL 파이펫을 사용하여 이를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음, 세포질 용해물 상층액을 수집합니다. 이어서, 1mL 파이펫을 사용하여 핵 펠렛을 1mL의 핵 분리 버퍼에 재현탁하고 15mL dounce glass homogenizer로 옮깁니다.얼음 위에서 100회 스트로크로 핵을 기계적으로 전단합니다. 4°C에서 20,000 ×g로 15분 동안 원심분리하여 핵 잔해를 펠렛화합니다. 상층액을 핵 세포 용해물로 수집합니다.이는 이전에 수집한 세포질 용해물과 혼합하거나 추후 응용을 위해 분리하여 보관할 수 있습니다. 여기서는 샘플을 1:1 비율로 혼합합니다. 분획되지 않은 세포 용해물에 RNase 억제제를 첨가하여 최종 농도가 0.5 units/µL가 되도록 합니다.그 다음, 웨스턴 블로팅(western blotting)용 입력 대조군(input control)으로 사용하기 위해 세포 용해물 100 µL를 얼음 위에 따로 보관하십시오. 세포 용해물을 세 개의 동일한 분량으로 나누어 각각의 1.5 mL 튜브에 1 mL씩 넣고, 공백 파이어플라이 루시페라제(firefly luciferase) RNA 접합 비드와 AR 3-Prime UTR 접합 비드와 각각 함께 4 °C에서 3시간 동안 회전시키며 배양하십시오. 배양 후, 튜브를 자석 위에 1분 동안 놓으십시오.1mL 피펫을 사용하여 상층액을 수집한 후, 동봉된 문서에 설명된 대로 RNA를 분리하고 RNA 무결성을 평가하십시오. 비드 펠릿은 얼음 위에 보관하십시오. 자성 비드를 6회 세척하십시오.매회, 40 units의 RNase inhibitor와 0.25% igepal이 포함된 1 mL의 핵 분리 버퍼(nuclear isolation buffer)에 비드 펠렛을 다시 현탁합니다. 실온에서 2분 동안 튜브를 회전시킵니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓아 마그네틱 비드와 상층액을 분리합니다.1분 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 비드 펠렛을 얼음에 둡니다. 웨스턴 블로팅을 위해 비드에서 RNA-단백질 복합체를 용출시키려면, 먼저 각 비드 펠렛을 75 µL의 핵 분리 완충액에 재현탁합니다. 그다음 25 µL의 4X 웨스턴 블롯 로딩 완충액을 첨가합니다.SDS가 포함된 용액을 사용하여 최종 부피가 100 µL가 되도록 합니다. 마지막으로, 이 100 µL 용액 내의 비드를 95 °C에서 5분 동안 가열합니다. 동봉된 문서에 기술된 대로 RBP 확인을 위한 western blotting을 수행합니다.본 실험에서는 항원 수용체 RNA 단편을 미끼로 사용하여 결합 단백질인 HuR을 캡처하였습니다. HuR 단백질과 관련이 없는 반딧불이 루시퍼라아제 RNA 미끼와 결합되지 않은 공백 스트렙타비딘 비드 분획을 각각 음성 대조군으로 사용하였습니다. RNA-단백질 상호작용은 핵 또는 세포질에서 모두 발생할 수 있으며, 본 풀다운 프로토콜은 전체 세포 용해물 또는 분획된 핵 및 세포질 세포 용해물 모두에 적용 가능합니다.단클론 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 분석 결과, 분획하지 않은 세포 용해물(input)에서 HuR 단백질이 검출되었습니다. 항원 수용체 RNA 용출 분획에서도 양성 결과가 나타나, RNA 풀다운 분석을 위해 항원 수용체 RNA가 결합된 비드를 사용했을 때 지방세포 용해물 내에 HuR 단백질이 존재함을 확인하였습니다. 반면, 반딧불이 루시페라아제 RNA 용출 분획과 공백 비드 샘플은 모두 음성 결과를 보여, 이 방법으로는 비특이적 상호작용이 검출되지 않았음을 나타냈습니다.종합하면, 이러한 결과는 항원-수용체 RNA 단편과 HuR 단백질 간의 상호작용이 특이적이었음을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 갈색 지방 조직의 RNA 전사체로부터 RNA 결합 단백질을 회수하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련된 후 적절하게 수행한다면, 이 과정은 24시간 이내에 완료될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

이 비디오는 mRNA에서 아데닐레이트-우리딜레이트-풍부 요소(ARE) 염기서열과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질(RBP)을 식별하기 위한 체외 RNA 풀다운 분석을 보여줍니다. 세포 용해물의 표적 RBP는 RNA 프로브와 혼합되어 RNA 단백질 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 RNA 프로브의 desthiobiotin 라벨과 streptavidin-labeled magnetic bead의 친화성을 활용하여 친화성 정제를 통해 분리됩니다.

친화성 추출을 통해 RNA 결합 단백질을 분리하기 위한 RNA-단백질 풀다운 분석

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

Desthiobiotin 라벨 아데닌 부자 요소 (는) 주제를 포함 하는 합성 25-뉴클레오티드 RNA oligo의 cytosolic는 바인딩 단백질의 특정 바인딩 수 있습니다.

Desthiobiotin Streptavidin 선호도 중재 Mesothelioma 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정화

이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

이 방법에서, 우리는 세균 세포에서 단순, 살아있는, 리포터 분석법을 사용하여 동축 및 비동종 결합 부위에 RNA 결합 단백질(RBPs)의 결합 친화도를 정량화한다. 분석은 기자 유전자의 억압에 근거를 둔다.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

여기에 제시된 것은 단백질과 마이크로 RNA 발현을 조절하기 위해 성숙한 아디포사이클로 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA 모방(miRs), 또는 항마이크로RNA(anti-miR)와 같은 올리고뉴클레오티드를 전달하는 프로토콜이다.

아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델

여기에서 우리는 인간 세포의 총 단백질 추출물, 비오티닐화 RNA로 코팅된 스트렙타비딘 비드 및 질량 분석 분석을 사용하여 특정 RNA 서열의 단백질 상호작용자를 발견, 정량화 및 검증하기 위한 최적화된 시험관 내 방법을 제시합니다.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

배우세요 체외 RNA 풀다운 기법을 사용하여 갈색 지방 조직에서 RNA 결합 단백질을 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 안드로젠 수용체 3-프라임 UTR을 이용하여 특이적인 단백질 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

RNA 결합 단백질의 검출에 의해

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