고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

이 방법의 전반적인 목표는 micro RNA 분석을 위해 인간 혈장으로부터 정제된 고밀도 지질단백질을 신속하게 분리할 수 있는 간소화된 접근 방식을 개발하는 것입니다. 이 방법은 고밀도 지질단백질의 분자적 기전과 보호 기능을 이해하는 것과 같이 간학 및 심장학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점 중 일부는 정제된 HDL micro RNA를 짧은 시간 내에 더 적은 양의 시료로부터 사전 분리하여 얻을 수 있다는 점입니다.

본 프로토콜에서는 프로토콜 본문에 설명된 바와 같이 여러 단계의 원심분리 과정을 통해 공복 말초 정맥 혈액 샘플로부터 혈장을 얻습니다. 혈장을 새 튜브로 옮깁니다. 그다음 제조사의 지침에 따라 실온에서 밀도계를 사용하여 혈장의 밀도를 측정합니다.

micro RNA 오염원이 되는 순환 엑소좀을 제거하기 위해, 1 mL의 혈장에 252 µL의 엑소좀 침전 용액을 첨가합니다. 그리고 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 혼합물을 30분 동안 원심 분리하여 엑소좀을 펠렛 형태로 침전시킵니다.

다음 비디오 세그먼트에서 보여주는 것과 같이, 결과물인 상층액 1 mL를 추가 처리를 위해 폴리카보네이트 두꺼운 벽 초원심분리관으로 옮깁니다. 고밀도 지질단백질(HDL)의 분리는 매우 저밀도 지질단백질(VLDL), 저밀도 지질단백질(LDL), 그리고 HDL을 순차적으로 분리하는 3단계 밀도 구배 초원심분리 프로토콜을 통해 수행됩니다. 세 가지 서로 다른 밀도 용액 A, B, C는 프로토콜 텍스트에 설명된 절차에 따라 새로 준비해야 합니다.

6.5 mL 폴리카보네이트 두꺼운 벽 초원심분리 튜브에 혈장 1 mL와 nuclease-free Fat Red 7B 200 µL를 혼합합니다. 그런 다음, 혼합물 위에 용액 A 5 mL를 조심스럽게 층을 쌓습니다. 필요한 경우, 각 튜브의 무게 균형을 맞추기 위해 용액 A 위에 Fat Red 7B를 추가로 첨가합니다.

미리 냉각된 로터에 튜브를 넣습니다. 로터를 바닥 설치형 원심분리기에 넣고 2시간 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 두 개의 층이 보여야 합니다.

VLDL 분획에 해당하는 상층액 1.5 milliliters를 제거하여 4 °C에서 보관하십시오. 피펫을 사용하여 튜브 바닥의 4 milliliters를 새로운 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.

여기에는 LDL 및 HDL 분획이 포함되어 있습니다. 다음 단계는 LDL의 분리입니다. LDL 및 HDL 분획이 들어 있는 튜브에 2 mL의 용액 B와 100 µL의 nuclease-free Fat Red 7B를 혼합하십시오.

5분에서 10분 동안 얼음에 둡니다. 혼합된 시료 6.5 mL를 폴리카보네이트 두꺼운 벽 초원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 미리 냉각된 로터에 넣고 3시간 동안 원심분리합니다.

원심분리가 완료되면 LDL 분획에 해당하는 상층액 1.5 milliliters를 취해 4 °C에서 보관하십시오. HDL 분획이 포함된 튜브 바닥의 4 milliliters를 50 milliliter 멸균 튜브로 옮깁니다. 세 번째 단계는 HDL의 분리입니다.

HDL 분획이 포함된 튜브에 용액 C 2 mL, nuclease-free Fat Red 7B 100 µL, 그리고 98% beta mercaptoethanol 15 µL를 넣고 혼합하십시오. 혼합물의 밀도를 확인하십시오. 튜브를 미리 냉각된 로터에 넣고 3시간 동안 원심분리하십시오.

그 후, HDL 분획에 해당하는 상층액 2 mL를 취하여 4 °C에서 보관합니다. 이후의 아가로스 겔 전기영동 및 PCR 과정에서 간섭이 발생하는 것을 방지하기 위해 리포단백질 분획에서 과도한 염을 제거해야 합니다. 본 영상에서는 HDL 분획에 대해서만 탈염 및 농축 과정을 시연하겠습니다.

냉각된 PBS 13 milliliters를 HDL 분획에 첨가하고, 분자량 컷오프가 10K인 원심분리 필터 장치로 옮깁니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 4000 times g, 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 냉각된 PBS 13 milliliters를 사용하여 HDL 분획을 다시 한번 탈염하고, 이전과 동일하게 원심분리합니다.

원심분리 후, 지질단백질이 포함된 용질을 제거하고 4°C에서 보관하십시오. 분리된 지질단백질의 품질과 순도를 평가하기 위해, 크기 참조용으로 포함된 인간 지질단백질 표준품을 이용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행하였습니다. beta mercaptoethanol을 사용하지 않은 분리의 대표적인 결과에서는 HDL 분획에 VLDL 오염이 없으며 전형적인 alpha 이동성을 나타냄을 확인하였습니다.

하지만 HDL 분획은 지질단백질 오염으로 인해 beta 이동성의 흔적 또한 나타냅니다. 마지막 원심분리 단계에서 용액 C에 beta-mercaptoethanol을 첨가하면 HDL 분획에서 모든 오염 지질단백질을 효과적으로 제거할 수 있습니다. 이 방법으로 정제된 인간 HDL에 포함된 micro RNA의 정량 가능성을 입증하기 위해, 두 가지 서로 다른 micro RNA를 실시간 정량 PCR로 증폭하였습니다.

이러한 증폭 플롯에서 수평선은 검출 임계값을 나타냅니다. 6개 샘플에서 얻은 분리된 HDL의 대표적인 실시간 PCR 데이터는 두 micro RNA가 모두 일관되게 검출됨을 보여주었습니다. 마지막으로, 해리 곡선 분석 결과 두 micro RNA 모두에서 뚜렷한 단일 피크가 관찰되었으며, 이는 이전 PCR 단계에서 특이적 증폭이 일어났음을 보여줍니다.

이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 탈염 과정을 포함하여 9시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 실험 절차를 시도할 때는 항상 4~8 °C에서 작업하는 것이 중요합니다. 또한 초원심분리 전에 각 지단백질 분획의 밀도를 조정해야 합니다.

이 절차 이후에 전자 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 HDL의 순도와 같은 추가적인 의문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 기술이 개발되면 대사 증후군 분야의 연구자들이 지방간 질환이 의심되는 사람의 HDL 관련 micro RNA를 바이오마커로 탐색할 수 있게 될 것입니다. 또한 HDL의 기능과 HDL이 세포 생물학을 변화시키는 분자적 메커니즘을 더 잘 이해하는 데에도 사용될 수 있습니다.