에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험 브루셀라 HeLa 세포의 감염

이 고처리량 현미경 기반 분석의 전반적인 목표는 HeLa 세포의 브루셀라 감염과 관련된 숙주 인자를 식별하는 것입니다. 이 방법은 세포 내 병원균 브루셀라(Brucella)에 의한 집락화를 촉진하거나 방지하는 숙주 단백질을 식별하는 것과 같은 숙주 병원체 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수의사 실험실에서 이미지 분석에 이르는 반자동 워크플로우를 통해 로봇과 효율적인 고처리량 실험이 가능하다는 것입니다.

따라서 이 방법은 siRNA 스크리닝을 사용하여 브루셀라 숙주 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 대부분의 프로토콜은 다른 스크리닝 전략에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 또는 siRNA 라이브러리가 있습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 HeLa 세포를 배양하고 siRNA로 스크리닝 플레이트를 준비한 후 300배 G에서 원심분리하고 실온에서 20분 동안 검은색 384웰 플레이트를 해동합니다. FCS 없이 실온 dmem을 사용하여 transfection medium을 준비합니다. transfection 시약을 1에서 200으로 희석하고 사용하기 전에 조심스럽게 혼합하십시오.

시약 디스펜서를 사용하여 384웰 플레이트의 각 웰에 25마이크로리터의 트랜스펙션 배지를 추가하고 플레이트를 앞뒤로 움직여 용액을 혼합합니다. siRNA transfection 시약 복합체가 형성될 수 있도록 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 동안 배양 배지를 흡인하고 PBS에 2.5ml의 0.05% 트립신 EDTA를 첨가하여 75제곱센티미터 플라스크의 하위 합류 세포를 한 번 세척하여 HeLa 세포를 준비합니다.

그런 다음 1.5ml의 신선한 트립신을 넣고 세포가 응고될 때까지 2-3분 동안 플라스크를 섭씨 37도로 옮깁니다. 10ml의 예열된 dmem 60%FCS를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 다음, 10의 세포 현탁액, 16%FCS를 가진 dmem에 있는 밀리리터 당 000개의 세포를 준비하기 전에 세포를 세기 위하여 자동화한 세포 카운터를 사용하십시오.

50마이크로리터의 세포 현탁액을 transfection 시약의 각 well에 추가합니다. 그 결과 웰당 500개의 세포가 생성됩니다. 플레이트를 앞뒤로 움직여 세포를 고르게 분포시킵니다.

그런 다음 세포가 안정될 수 있도록 플레이트를 실온에 5-10분 동안 그대로 둡니다. 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 그리고 섭씨 37도의 예열 된 알루미늄 판의 습한 인큐베이터에서 5 % C02로 72 시간 동안 배양하십시오.

3급 병원균인 B.abortus와 함께 작업하는 것은 위험하며 전체 보호복, 보호 장갑, 마스크 및 고글 착용을 포함하는 현지 생물 안전 규정을 따라야 합니다. 감염 하루 전, TSB KM 배지 50ml에 미리 결정된 양의 B.abortus 스타터 배양을 접종합니다. 250ml 스크류캡 병에 담겨 있습니다.

파라필름을 사용하여 병을 밀봉하고 셰이커에서 섭씨 37도 및 100RPM에서 하룻밤 사이에 광학 밀도 600.8에서 1.1까지 박테리아를 성장시킵니다. 박테리아 배양의 광학 밀도 600을 측정합니다. 그리고 원하는 감염 다중도를 달성하기 위해 dmem 10%FCS에서 박테리아 배양액을 희석하여 감염 매체를 준비합니다.

또는 MOI. 자동 플레이트 세척기를 사용하여 transfection 배지를 50마이크로리터의 감염 배지로 교환합니다. 후드 내부에서 플레이트를 원심분리기 케이지로 옮기고 384웰 플레이트를 400배 G와 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 섭씨 37도, 5%C02의 예열된 알루미늄 플레이트에서 4시간 동안 배양합니다. 자동 플레이트 세척기로 배양한 후 밀리리터당 100마이크로그램의 덴트리미센 또는 GM이 포함된 10% FCS가 포함된 dmem을 사용하여 세포를 세척하여 세포외 박테리아를 비활성화합니다. 그런 다음 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 종말점 분석을 위해 40시간 동안 인큐베이터의 예열된 알루미늄 플레이트에 다시 놓습니다.

세포를 고정하려면 먼저 PBS를 사용하여 우물을 씻으십시오. 그런 다음 PBS를 50마이크로리터의 3.7%PFA로 교환합니다. pH 7.4에서 2에서.

그리고 세포를 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후 50 마이크로 리터의 PBS를 사용하여 고정 매체를 교환하십시오. 자동 플레이트 세척기로 샘플을 염색하려면 먼저 PBS에 50마이크로리터의 1%Triton X-100을 10분 동안 사용하여 세포를 투과화합니다.

PBS를 사용하여 세포를 세 번 세척한 후 PBS 50마이크로리터와 DAPI 밀리리터당 1마이크로그램을 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 세 번 씻은 후 빛으로부터 보호한다. 플레이트를 자동 현미경으로 옮깁니다.

현미경 매개변수를 설정합니다. 10-X 주관을 선택합니다. 그런 다음 384웰 플레이트에 해당하는 플레이트 형식을 선택합니다.

유정당 9개의 사이트를 획득합니다. 레이저 기반 초점 사용을 선택합니다. 그리고 접시와 우물 바닥에 초점을 맞춥니다.

그런 다음 샘플을 찾기 위한 초기 웰로 획득한 첫 번째 웰과 사이트 자동 초점을 위한 모든 사이트로 설정합니다. 다음으로, DAPI 채널의 경우 초점의 Z 오프셋을 수동으로 조정합니다. 그런 다음 Find Sample(샘플 찾기)을 눌러 웰 바닥에 초점을 설정합니다.

AutoExposure 기능을 사용하여 노출 시간을 잘 추정할 수 있습니다. DAPI 채널의 노출 시간을 수동으로 수정하여 과다 노출이 적은 넓은 다이나믹 레인지를 보장합니다. 이 노출 시간을 사용하여 플레이트 전체의 여러 부위를 이미지화합니다.

그리고 가장 밝은 픽셀이 사이트의 최대 밝기의 약 80%에 도달할 때까지 노출 시간을 수동으로 조정합니다. 단계를 반복하여 다른 모든 채널에 대해 그에 따라 초점과 노출 시간을 설정합니다. 그런 다음 전체 플레이트의 획득을 시작합니다.

종말점 분석의 경우 DAPI 및 GFP 채널을 사용하여 전체 플레이트를 이미지화합니다. 종말점 분석에서 염색된 세포에 대한 이미지 분석을 실행하려면 음영 모델을 계산한 후 텍스트 프로토콜에 따라 View output settings(출력 설정 보기)에서 이미지가 있는 입력 폴더와 결과가 있는 출력 폴더를 선택합니다. 그런 다음 이미지에 공통적으로 있는 텍스트를 정의하고 음영 모델을 로드합니다.

테스트 모드 시작을 클릭하고 모든 모듈에 대한 일시 중지 및 표시 설정이 비활성화되어 있는지 확인합니다. 모듈 9 ImageMath에 대한 일시 중지 및 표시 설정을 활성화합니다. 활성화된 일시 중지 기호가 노란색으로 표시됩니다.

활성화된 디스플레이 기능이 열린 눈으로 나타납니다. 그런 다음 Run(실행)을 클릭하여 모듈 9까지 분석을 실행합니다. 모듈 9에서 매개변수를 조정하고 두 번째 이미지에 핵을 억제하지 않고 브루셀라의 DAPI 신호를 억제할 값으로 곱합니다.

모듈의 값을 테스트하려면 Step을 누릅니다. 새로 열린 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이미지 대비를 log normalized로 설정합니다. 반복해서 모듈 9로 돌아갑니다.

매개변수를 조정하고, 두 번째 이미지에 곱하고, 브루셀라 신호가 완전히 억제되는 동시에 과잉 빼기를 나타내는 검은색 영역이 최소화될 때까지 모듈을 다시 밟습니다. 특정 모듈에 대한 좋은 매개 변수를 찾으려면 매개 변수를 점진적으로 최적화해야 합니다. 모듈을 반복적으로 단계별로 실행하고 다른 값을 시도하고 표시된 결과에 미치는 영향을 관찰하는 것이 확실히 중요합니다.

모듈 10에 대해 일시 중지 및 표시를 활성화합니다. 기본 개체를 식별합니다. 매개변수를 임계값의 하한으로 설정하고, 핵이 분할되고 배경이 무시될 수 있을 만큼 충분히 높게 설정합니다.

적절한 값을 식별하려면 모듈을 단계별로 실행한 다음 입력 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 피크가 일반적으로 배경을 나타내는 히스토그램을 표시합니다. background intensity에서 시작하여 출력 이미지에 표시된 대로 핵의 양호한 분할이 이루어질 때까지 매개변수를 증가시킵니다. 이미지 분석 파이프라인의 목표는 복제 박테리아가 포함된 세포를 식별하는 것입니다.

이는 핵, 핵주위 및 보로노이 세포체의 병원체 신호에 대해 서로 다른 임계값을 설정하여 달성됩니다. 모듈 15에 대해 일시 중지 및 표시를 활성화합니다. 앞에서 설명한 것처럼 개체를 필터링하고 Run을 누릅니다.

핵에서 브루셀라가 명확하게 보이는 세포만 유지되고 나머지는 모두 필터링되어 제거되도록 매개변수 최소값을 충분히 높게 설정합니다. 좋은 값을 식별하려면 모듈을 단계별로 실행하고 출력 이미지를 표시합니다. 핵에서 명확하게 보이는 브루셀라가 있는 세포만 유지될 때까지 값을 단계적으로 늘립니다.

텍스트 프로토콜에 따라 모듈 16 및 17에서 주핵 주위 및 보로노이 세포체에 박테리아가 있는 세포를 필터링한 후 테스트 모드를 종료하고 모듈 옆에 있는 모든 눈 기호를 선택 취소하여 전체 분석을 실행하기 전에 어떤 모듈도 디스플레이에 표시되지 않는지 확인합니다. 마지막으로 이미지 분석을 눌러 분석을 시작합니다. 분석이 완료되면 결과 PNG 이미지와 CSV 스프레드시트를 검사하여 분석이 플레이트 전체에서 안정적으로 작동했는지 확인합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 진입 분석 및 감염 점수를 수행합니다. 이 그림은 종말점 분석에서 감염된 세포를 자동으로 식별하는 데 사용되는 이미지 분석의 예를 보여줍니다. DAPI로 염색된 핵 HeLa 세포가 확인되었습니다.

핵을 둘러싸고 있는 8픽셀 너비의 핵 주위. 그리고 핵의 확장에 의한 보로노이 세포체(Voronoi cell body)를 25 픽셀로 계산하였다. 병원체 신호가 적어도 하나의 구획에서 해당 임계값을 초과하는 경우 세포가 감염된 것으로 간주되었습니다.

브루셀라는 숙주 세포의 성공적인 참여를 위해 행동 재배열이 필요합니다. 따라서 ARP23의 고갈은 siRNA 스크리닝에 적합한 양성 대조군입니다. ARPC3의 고갈은 감염 2일 후 증식하는 박테리아가 있는 세포의 수를 줄였습니다.

스크램블 처리된 대조 세포와 비교. 이 그래프에서 대조 세포에 비해 ARPC3 고갈된 HeLa 세포의 감염이 감소하는 것으로 정량적으로 관찰된 자동화된 이미지 분석. ARPC3의 고갈은 또한 대조 세포에 비해 진입 분석에서 브루셀라 감염이 감소한 것으로 나타났습니다.

노란색으로 표시된 세포 내 브루셀라의 수가 감소한 것에서 알 수 있듯이. 마지막으로, 자동 이미지 분석을 통한 감염 정량화는 ARPC3의 고갈로 인해 감염된 세포의 수와 감염된 세포 내 박테리아의 수가 감소하는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜은 일단 마스터되면 실험 시작 후 1주 반 이내에 이미지 분석 결과를 제공할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 이미지 분석 결과를 주의 깊게 검토하여 선택한 매개변수가 전체 플레이트에서 잘 작동하는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 살아있는 세포 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 인신매매를 할 때 특정 숙주 요인이 브루첼라와 상호 작용합니다.

또는 유전자의 고갈이 감염의 세포 내 역학에 어떤 영향을 미치는지. 개발 후 이 기술은 감염 생물학 분야의 연구자들이 HeLa 세포 분석에서 브루셀라 감염에 필요한 숙주 인자를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 내 병원균인 Brucella abortus에 의한 HeLa 세포의 성공적인 집락화를 촉진하거나 예방하는 숙주 요인을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

브루셀라 낙태를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으며 현지 생물 안전 규정을 엄격히 준수해야 한다는 것을 잊지 마십시오.