Name: 에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험 브루셀라 HeLa 세포의 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: 학습하세요 현미경 기반 고처리량 스크리닝을 통해 Brucella 감염에 관여하는 HeLa 세포의 숙주 인자를 식별하는 방법을. siRNA 스크리닝과 자동화된 이미지 분석 파이프라인을 활용하여 감염 메커니즘을 연구하고 치료 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 SystemsX.ch Swiss Initiative for Systems Biology의 틀에서 각각 연구 및 기술 개발(RTD) 프로젝트 InfectX 및 TargetInfectX에 대한 51RT 0_126008 및 51RTP0_151029 보조금의 지원을 받았습니다. 스위스 국립과학재단(SNSF)의 보조금 310030B_149886 인정합니다. S.H.L과 A.C.의 연구는 Biozentrum의 국제 박사 과정 "Fellowships for Excellence"의 지원을 받았습니다. Simone Muntwiler는 기술 지원을 인정받았습니다. pNF106을 제공해 주신 Dirk Bumann님과 pJC43 및 pJC44를 제공해 주신 Jean Celli님께 감사드립니다.

<ol><li>Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+global+map+of+human+brucellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The new global map of human brucellosis.</a> Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).</li>
<li>Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+human+pathogenic+Brucella+species+with+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).</li>
<li>Guzman-Verri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+of+the+Rho+subfamily+are+required+for+Brucella+abortus+internalization+in+nonprofessional+phagocytes%3A+direct+activation+of+Cdc42%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42.</a> J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).</li>
<li>Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+intracellular+replication+requires+trafficking+through+the+late+endosomal%2Flysosomal+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment.</a> Traffic. 9, 678-694 (2008).</li>
<li>Boschiroli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brucella+suis+virB+operon+is+induced+intracellularly+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).</li>
<li>Celli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+evades+macrophage+killing+via+VirB-dependent+sustained+interactions+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum.</a> J Exp Med. 198, 545-556 (2003).</li>
<li>Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acidification+of+phagosomes+containing+Brucella+suis+is+essential+for+intracellular+survival+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages.</a> Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).</li>
<li>Anderson, T. D., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+morphometric+analysis+of+Brucella+abortus-infected+trophoblasts+in+experimental+placentitis.+Bacterial+replication+occurs+in+rough+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum.</a> Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).</li>
<li>Ramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+large-scale+RNAi+screens+for+pathogen+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry.</a> BMC genomics. 15, 1162(2014).</li>
<li>Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+InlC+secretion+to+investigate+cellular+infection+by+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes.</a> J Vis Exp. , e51043(2013).</li>
<li>Kentner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+reroutes+host+cell+central+metabolism+to+obtain+high-flux+nutrient+supply+for+vigorous+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).</li>
<li>Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+coopts+the+small+GTPase+Sar1+for+intracellular+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).</li>
<li>von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+affairs%3A+investigating+the+Brucella+intracellular+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle.</a> FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

박테리아 병원체는 진핵 숙주 세포를 자신에게 유리하게 조작하기 위한 수많은 전략을 진화시켰습니다. 급성 감염을 일으키는 병원체는 종종 면역 체계의 심각한 경각심과 감염된 세포의 생존력 상실을 동반하는 급속한 증식을 보입니다. 대조적으로, 만성 감염을 일으키는 브루셀라 및 기타 병원체는 숙주 세포 내에서 오래 지속되는 상호 작용을 확립합니다. 따라서 박테리아는 세포 항상성을 방해하지 않고 숙주 세포 기능을 미세 조정해야 합니다. 게놈 규모에서 감염 과정에 관여하는 숙주 세포 인자를 식별하기 위한 일반적인 전략은 예를 들어 감염의 기능적 판독과 결합된 siRNA에 의한 체계적인 유전자 고갈을 사용하는 것입니다. 여기에서는 형광 박테리아 검출을 기반으로 한 고함량, 고처리량 스크리닝에 적합한 프로토콜을 제시합니다.
성공적인 대규모 스크리닝의 중요한 측면은 강력한 자동 이미지 분석 및 감염 점수와 관련이 있습니다. 여기에 설명된 방법은 일반적으로 매우 강력한 DAPI 염...

브루셀라 종은 α-프로 테오 박테리아의 클래스에 속하는 그람 음성, 통성 세포 내 병원균이다. 그들은 이러한 풍토 지역에서 심각한 경제적 손실을 초래 소, 염소, 또는 양 등 자연 호스트에서 낙태와 불임의 원인. 브루셀라 병은 전 세계적으로 매년 50 만 새로운 인간 감염 1 위에 일으키는 가장 중요한 인수 공통 질병 중 하나입니다. 인간에 ​​전송 가장 일반적으로 이러한 저온 살균하지 않은 우유로 감염된 동물과 직접 접촉하거나 오염 된 음식의 섭취에 의해 발생합니다. 열성 질환의 증상은 브루셀라 병의 진단에 어려움이 발생하는 불특정입니다. 처리되지 않은 경우, 환자는 관절염, 심내막염, 및 신경 병증이 같은 더 심각한 증상으로 만성 감염을 개발할 수 있습니다. 세포 수준에서 브루셀라 식세포는 비 식세포에 침입 할 수 있으며, 세포 내에서 복제브루셀라 함유 공포 (BCV)라고 함. 박테리아의 내면화는 라 세미,의 Rho와 Cdc42 3의 직접적인 활성화에 의해 액틴 세포 골격의 재 배열이 필요합니다. 진핵 숙주 세포 내부에서 BCV는 세포 내 이입 경로를 따라 트래 피킹과 리소좀과의 상호 작용에도 불구하고, 세균 분해 4 않도록 관리한다. 소낭 ATPase에 의해 BCV의 산성화가 박테리아 타입 IV 분비 시스템 (T4SS) (5)의 발현을 유도 할 필요가있다. 브루셀라는 복제 성 틈새 시장을 확립하기위한 T4SS 분비 세균 이펙터는 세포 내 틈새 시장 (7)의 설립의 결함에 T4SS 6의 삭제 또는 기공을 ATP 아제 리드의 억제 때문에, 필수적인 것으로 생각된다. 박테리아는 그들이 때까지 인신 매매의 단계에서 복제되지 않는다 응급실에서 파생 된 액포 실 (8)에 도달한다. 세포 증식이 발생되면, BCV는 CL에서 발견이러한 calnexin 및 글루코스 -6- 인산 (6)와 같은 ER 마커 OSE 협회. 브루셀라는 ER-같은 구획, 세포를 입력 리소좀 저하를 방지하고, 마지막으로 복제하는 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않은 남아있다. 감염의 여러 단계에 관여하는 호스트 요소는 주로 대상으로 접근 또는 초파리 세포 (9)에서 수행되는 작은 규모의 작은 간섭 RNA (siRNA를) 스크린에 의해 확인되었다. 다음은 브루셀라 감염시 개별 호스트 요인의 기여에 광명을 비춰했지만 우리는 전체 과정의 포괄적 인 이해에서 멀리 아직도이다. 여기서, 자동 폭 필드 형광 현미경 및 자동화 된 이미지 분석과 함께 대규모 RNA 간섭 (RNAi의) 검사를 사용하여 인간 숙주 인자의 식별을 허용 프로토콜이 제시된다. HeLa 세포의 뒷면의 siRNA로 형질 describ 수행에드 이전 10, 11 약간의 수정과. 엔드 포인트 분석은 상기 출구와 인접 셀의 감염을 제외한 브루셀라 세포 수명의 많은 부분을 포함한다. 상기 엔드 분석에서 확인 된 히트를 특성화하기 위해, 감염의 초기 단계에 관여하는 인자들을 확인하는 변형 프로토콜이 사용된다. 구조적 GFP를 발현하는 브루셀라 아 보르 투스 균주 박테리아 이틀 동안 세포를 감염시킬 수있는 엔드 포인트 분석에 사용된다. 이 기간 동안, 박테리아는 ER-파생 된 복제 성 틈새 시장 세포, 트래픽을 입력하고 요정 핵 공간에 복제합니다. GFP 신호의 하이 레벨은 안정적으로 복제 박테리아를 포함 개별 셀을 검출 할 수있다. 고 처리량 분석에 브루셀라 항목을 연구하기 위해, 세포 내 및 세포 외 박테리아를 구별 할 수있는 것이 중요하다. 이 방법은 여기 circumv 제시세포 내 및 세포 외 박테리아의 엔트 차 항체 염색. 그것은을 DsRed의 구성 성 발현과 함께 테트라 사이클린 - 유도 GFP를 발현하는 브루셀라 변형에 기초한다. 구성 적을 DsRed 마커의 존재는 샘플에 존재하는 모든 균을 식별 할 수있다. GFP 발현 젠타 의해 동시에 세포 외 박테리아의 불 활성화와 함께 무독성 테트라 사이클린 유사체 anhydrotetracycline (ATC)의 첨가 (GM)에 의해 유도된다. 셀 배리어 성 항생제 GM은 세포 외 박테리아를 죽이고 있지만, ATC는 숙주 세포를 선택하고 박테리아 세포 내에서 선택적으로 GFP 발현을 유도 할 수있다. 이 듀얼 기자는 넓은 필드 현미경을 사용하여 세포 외 박테리아 (만을 DsRed 신호)에서 단일 세포 내 세균 (GFP 및을 DsRed 신호)의 강력한 분리 할 수​​ 있습니다. 세포 브루셀라 의해 검출 GFP 발현에 도달하기 위해 우리는 ATC에 의해 유도 4 시간이 RELI 초래한다는 발견수 신호. 선택적으로 세포 내 세균에 GFP를 표현하는 유사 유도 방식은 세포 내 시겔 (12)을 연구하기 위해 이전에 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>트립틱 소이 한천 (TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 소이 국물 (TSB)</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신 설페이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>탈지유</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250ml 스크류 캡 병</td><td>코닝</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>열 비활성화</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10x 원액, PBS에서 1:10 희석</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 세포 계수기</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>대체 세포 계수 장치 사용 가능</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>박리 가능한 알루미늄 호일</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>시약 디스펜서: "Multidrop 384 시약 디스펜서"</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840150</td><td>대체 시약 디스펜서를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>트랜스펙션 시약: "Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>자동 플레이트 세척기: "플레이트 세척기 ELx50-16"</td><td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>이 플레이트 세척기에는 384웰 플레이트에 적합한 16채널 매니폴드가 포함되어 있습니다. 생물 안전 캐비닛에 맞고 세척 중 플레이트를 덮는 뚜껑이 있어 에어로졸 생성의 위험을 줄입니다. 유사한 기능을 가진 대체 플레이트 와셔를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>G1397</td><td></td></tr>, <tr><td>안히드로테트라사이클린, 염산염</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>37919</td>, <td>100 &#956; 100% 에탄올에 있는 g/ml 해결책은 -20°C에 유지된다; C 알루미늄 호일</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td>0.2m hepes 완충액, pH 7.4에 용해 빛으로부터 보호. -20 &deg에서 보관하십시오. C는 사용 전날 갓 해동합니다. 주의: PFA는 흡입, 피부 접촉 또는 삼키면 독성이 있습니다.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>로슈</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>스크램블 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Construction: pJC44 4를 EcoRI로 절단한 후 Klenov 효소로 뭉툭한 말단을 생성하고 SalI로 절단했습니다. TetR-GFP는 프라이머 prAC090 및 prAC092를 사용하여 pNF106으로부터 증폭되었습니다. SalI로 분해한 후, TetR-GFP 생성물을 절단된 pJC44 벡터에 연결시켰다.</td></tr><tr><td>프라이머 prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC GAA ACC</td></tr><tr><td>프라이머 prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC</td></tr><tr><td>HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress 마이크로</td><td>분자 장치&nbsp;</td><td>IXM IMAGING</td><td>MSCOPE 정밀 전동 Z-스테이지가 장착된 자동 세포 이미징 현미경. 자동 현미경 검사를 위한 대체 시스템과 아래에 명시된 하드 및 소프트웨어를 위한 대체 구성 요소를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>고속 레이저 자동 초점</td><td>분자 장치&nbsp;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>CFI Super Fluor 10X objective</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC 프리즘: 10X, 스프링 장착</td></tr><tr><td>광도 CoolSNAP HQ 흑백 CCD 카메라</td><td>분자 장치&nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1,392 x 1,040 이미징 픽셀, 6.45 x 6.45 &마이크로; m 픽셀, 12비트 디지털화</td></tr><tr><td>MetaXpress 소프트웨어</td><td>분자 장치&nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>라이트 엔진. 다음과 같은 광원이 사용됩니다 : 보라색 (DAPI), 청록색 (GFP), 녹색 / 노란색 (RFP)</td></tr> <tr><td>DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF01-377 / 50-25</td><td></td>용 단일</tr><tr><td>대역 익사이터 DAPI 용 단일 대역 방출기</td><td>Semrock</td><td>FF02-447 / 60-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 용 단일 대역 이미터 Demrock</td><td></td><td>FF409-DI03-25x36</td><td></td></tr><tr>GFP <td>Semrock</td><td>FF02-472 / 30-25</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>용 단일 대역 익사이터GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td>용 단일 밴드 이미터</tr><tr><td>GFP</td><td>Semrock</td><td>FF495-DI03-25X36</td><td></td></tr>용 <tr><td>단일 밴드 이미터, RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr>용 <tr><td>단일 밴드 이미터, RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr>용 <tr><td>단일 밴드 이미터, RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-DI03-25x36</td><td></td>용 단일 밴드 이미터</tr>,</tbody></table>

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; hela 세포의 감염

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

브루셀라 종은 자연 호스트로 동물을 감염 통성 세포 내 병원균이다. 인간에게 전송은 가장 일반적으로 감염된 동물과 직접 접촉하거나 오염 된 음식의 섭취에 의해 발생되고 심한 만성 감염으로 이어질 수 있습니다. 브루셀라 전문 및 비 전문 식세포의 세포 침입과 소포체 (ER) 유래 액포 내에서 복제 할 수 있습니다. 응급실과 같은 구획 브루셀라 숙주 세포에 진입, 리소좀 분해 회피 및 복제에 필요한 숙주 요인은 거의 알려져 남아있다. 여기에서 우리는 HeLa 세포에서 브루셀라 항목 및 복제에 관련된 호스트 요인을 파악하기 위해이 분석에 대해 설명합니다. 다른 검사 방법을 적용 할 수 있지만 프로토콜은 RNA 간섭의 사용을 설명한다. 분석법은 형광 표지 된 세균의 검출에 사용 자동 형광 표지 된 숙주 세포에 기초와이드 필드 현미경. 형광 이미지는 단일 셀 기반 감염 득점을 허용 CellProfiler에서 표준 이미지 분석 파이프 라인을 이용하여 분석한다. 엔드 분석에서, 세포 내 복제 이틀 감염 후 측정한다. 이 확산 성공적으로 이렇게 강하게 숙주 세포 내에서 증식 할 것이다 세포 내 틈새를 설립 세균 항목입니다. 브루셀라 후 12 시간의 주위에 시작되는 자신의 복제 성 틈새 트래픽에 박테리아를 할 수 있습니다. 세포 내 박테리아가 크게 개별 세포 또는 세포 비 - 복제 성 박테리아를 능가하기 때문에, 구조적으로 GFP를 발현하는 균주를 사용할 수있다. 강한 GFP 신호는 감염된 세포를 식별하기 위해 사용된다. 대조적으로, 엔트리 분석을 위해 세포 내 및 세포 외 박테리아를 구별하는 것이 필수적이다. 여기에서, 테트라 사이클린 - 유도 GFP에 대한 변형 부호화가 사용된다. 유도겐타 마이신에 의한 세포 외 박테리아의 불 활성화와 동시에 GFP의 세포 내 박테리아 GFP를 발현 할 수있는 함께 세포 및 GFP 신호에 기초하여 박테리아 세포의 분화를 가능하게한다. 세포 내 증식이 시작되기 전에이 단일 세포 내 박테리아의 강력한 탐지 할 수 있습니다.

도 1a는 자동으로 엔드 분석에서 감염된 세포를 식별하는 데 사용되는 이미지 분석의 일례를 나타낸다. DAPI 염색 HeLa 세포의 핵이 확인되었고, 25 픽셀 핵 연장하여 핵 주위 8 화소의 폭 조갑 핵 및 보로 노이 셀 바디를 산출 하였다. 박테리아가 주로 조갑 핵 공간 확산 때문에, 셀이 영역에서 강도 GFP 감염 및 비감염 세포를 구별 할 수있는 가장 강력한 측정이다. 일부 경우에 세균이 핵으로 큰 정도에 조갑 핵 또는 오버레이 외부 증식 발견된다. 따라서, 두 개의 추가 오브젝트는 감염된 세포의 식별을 고려 하였다. 분할뿐만 아니라 GFP 강도 측정은 화상 해석 소프트웨어 CellProfiler이 수행되었다. 브루셀라 <str옹&gt; 숙주 세포 3의 성공적인 침략을위한 굴지의 재 배열...

브루셀라 감염과 관련된 숙주 인자에 대한 현미경 기반 고처리량 스크리닝을 위한 두 가지 분석이 설명됩니다. 진입 분석은 Brucella 진입에 필요한 숙주 인자를 검출하고 종말점 분석은 세포 내 복제에 필요한 숙주 인자를 검출합니다. 대체 접근법에 적용할 수 있지만, HeLa 세포의 siRNA 스크리닝은 프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다.

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

이 고처리량 현미경 기반 분석의 전반적인 목표는 HeLa 세포의 브루셀라 감염과 관련된 숙주 인자를 식별하는 것입니다. 이 방법은 세포 내 병원균 브루셀라(Brucella)에 의한 집락화를 촉진하거나 방지하는 숙주 단백질을 식별하는 것과 같은 숙주 병원체 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수의사 실험실에서 이미지 분석에 이르는 반자동 워크플로우를 통해 로봇과 효율적인 고처리량 실험이 가능하다는 것입니다.따라서 이 방법은 siRNA 스크리닝을 사용하여 브루셀라 숙주 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 대부분의 프로토콜은 다른 스크리닝 전략에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 또는 siRNA 라이브러리가 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 HeLa 세포를 배양하고 siRNA로 스크리닝 플레이트를 준비한 후 300배 G에서 원심분리하고 실온에서 20분 동안 검은색 384웰 플레이트를 해동합니다. FCS 없이 실온 dmem을 사용하여 transfection medium을 준비합니다. transfection 시약을 1에서 200으로 희석하고 사용하기 전에 조심스럽게 혼합하십시오.시약 디스펜서를 사용하여 384웰 플레이트의 각 웰에 25마이크로리터의 트랜스펙션 배지를 추가하고 플레이트를 앞뒤로 움직여 용액을 혼합합니다. siRNA transfection 시약 복합체가 형성될 수 있도록 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 동안 배양 배지를 흡인하고 PBS에 2.5ml의 0.05% 트립신 EDTA를 첨가하여 75제곱센티미터 플라스크의 하위 합류 세포를 한 번 세척하여 HeLa 세포를 준비합니다.그런 다음 1.5ml의 신선한 트립신을 넣고 세포가 응고될 때까지 2-3분 동안 플라스크를 섭씨 37도로 옮깁니다. 10ml의 예열된 dmem 60%FCS를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 다음, 10의 세포 현탁액, 16%FCS를 가진 dmem에 있는 밀리리터 당 000개의 세포를 준비하기 전에 세포를 세기 위하여 자동화한 세포 카운터를 사용하십시오.50마이크로리터의 세포 현탁액을 transfection 시약의 각 well에 추가합니다. 그 결과 웰당 500개의 세포가 생성됩니다. 플레이트를 앞뒤로 움직여 세포를 고르게 분포시킵니다.그런 다음 세포가 안정될 수 있도록 플레이트를 실온에 5-10분 동안 그대로 둡니다. 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 그리고 섭씨 37도의 예열 된 알루미늄 판의 습한 인큐베이터에서 5 % C02로 72 시간 동안 배양하십시오.3급 병원균인 B.abortus와 함께 작업하는 것은 위험하며 전체 보호복, 보호 장갑, 마스크 및 고글 착용을 포함하는 현지 생물 안전 규정을 따라야 합니다. 감염 하루 전, TSB KM 배지 50ml에 미리 결정된 양의 B.abortus 스타터 배양을 접종합니다. 250ml 스크류캡 병에 담겨 있습니다.파라필름을 사용하여 병을 밀봉하고 셰이커에서 섭씨 37도 및 100RPM에서 하룻밤 사이에 광학 밀도 600.8에서 1.1까지 박테리아를 성장시킵니다. 박테리아 배양의 광학 밀도 600을 측정합니다. 그리고 원하는 감염 다중도를 달성하기 위해 dmem 10%FCS에서 박테리아 배양액을 희석하여 감염 매체를 준비합니다.또는 MOI. 자동 플레이트 세척기를 사용하여 transfection 배지를 50마이크로리터의 감염 배지로 교환합니다. 후드 내부에서 플레이트를 원심분리기 케이지로 옮기고 384웰 플레이트를 400배 G와 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다.그런 다음 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 섭씨 37도, 5%C02의 예열된 알루미늄 플레이트에서 4시간 동안 배양합니다. 자동 플레이트 세척기로 배양한 후 밀리리터당 100마이크로그램의 덴트리미센 또는 GM이 포함된 10% FCS가 포함된 dmem을 사용하여 세포를 세척하여 세포외 박테리아를 비활성화합니다. 그런 다음 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 종말점 분석을 위해 40시간 동안 인큐베이터의 예열된 알루미늄 플레이트에 다시 놓습니다.세포를 고정하려면 먼저 PBS를 사용하여 우물을 씻으십시오. 그런 다음 PBS를 50마이크로리터의 3.7%PFA로 교환합니다. pH 7.4에서 2에서.그리고 세포를 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후 50 마이크로 리터의 PBS를 사용하여 고정 매체를 교환하십시오. 자동 플레이트 세척기로 샘플을 염색하려면 먼저 PBS에 50마이크로리터의 1%Triton X-100을 10분 동안 사용하여 세포를 투과화합니다.PBS를 사용하여 세포를 세 번 세척한 후 PBS 50마이크로리터와 DAPI 밀리리터당 1마이크로그램을 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 세 번 씻은 후 빛으로부터 보호한다. 플레이트를 자동 현미경으로 옮깁니다.현미경 매개변수를 설정합니다. 10-X 주관을 선택합니다. 그런 다음 384웰 플레이트에 해당하는 플레이트 형식을 선택합니다.유정당 9개의 사이트를 획득합니다. 레이저 기반 초점 사용을 선택합니다. 그리고 접시와 우물 바닥에 초점을 맞춥니다.그런 다음 샘플을 찾기 위한 초기 웰로 획득한 첫 번째 웰과 사이트 자동 초점을 위한 모든 사이트로 설정합니다. 다음으로, DAPI 채널의 경우 초점의 Z 오프셋을 수동으로 조정합니다. 그런 다음 Find Sample(샘플 찾기)을 눌러 웰 바닥에 초점을 설정합니다.AutoExposure 기능을 사용하여 노출 시간을 잘 추정할 수 있습니다. DAPI 채널의 노출 시간을 수동으로 수정하여 과다 노출이 적은 넓은 다이나믹 레인지를 보장합니다. 이 노출 시간을 사용하여 플레이트 전체의 여러 부위를 이미지화합니다.그리고 가장 밝은 픽셀이 사이트의 최대 밝기의 약 80%에 도달할 때까지 노출 시간을 수동으로 조정합니다. 단계를 반복하여 다른 모든 채널에 대해 그에 따라 초점과 노출 시간을 설정합니다. 그런 다음 전체 플레이트의 획득을 시작합니다.종말점 분석의 경우 DAPI 및 GFP 채널을 사용하여 전체 플레이트를 이미지화합니다. 종말점 분석에서 염색된 세포에 대한 이미지 분석을 실행하려면 음영 모델을 계산한 후 텍스트 프로토콜에 따라 View output settings(출력 설정 보기)에서 이미지가 있는 입력 폴더와 결과가 있는 출력 폴더를 선택합니다. 그런 다음 이미지에 공통적으로 있는 텍스트를 정의하고 음영 모델을 로드합니다.테스트 모드 시작을 클릭하고 모든 모듈에 대한 일시 중지 및 표시 설정이 비활성화되어 있는지 확인합니다. 모듈 9 ImageMath에 대한 일시 중지 및 표시 설정을 활성화합니다. 활성화된 일시 중지 기호가 노란색으로 표시됩니다.활성화된 디스플레이 기능이 열린 눈으로 나타납니다. 그런 다음 Run(실행)을 클릭하여 모듈 9까지 분석을 실행합니다. 모듈 9에서 매개변수를 조정하고 두 번째 이미지에 핵을 억제하지 않고 브루셀라의 DAPI 신호를 억제할 값으로 곱합니다.모듈의 값을 테스트하려면 Step을 누릅니다. 새로 열린 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이미지 대비를 log normalized로 설정합니다. 반복해서 모듈 9로 돌아갑니다.매개변수를 조정하고, 두 번째 이미지에 곱하고, 브루셀라 신호가 완전히 억제되는 동시에 과잉 빼기를 나타내는 검은색 영역이 최소화될 때까지 모듈을 다시 밟습니다. 특정 모듈에 대한 좋은 매개 변수를 찾으려면 매개 변수를 점진적으로 최적화해야 합니다. 모듈을 반복적으로 단계별로 실행하고 다른 값을 시도하고 표시된 결과에 미치는 영향을 관찰하는 것이 확실히 중요합니다.모듈 10에 대해 일시 중지 및 표시를 활성화합니다. 기본 개체를 식별합니다. 매개변수를 임계값의 하한으로 설정하고, 핵이 분할되고 배경이 무시될 수 있을 만큼 충분히 높게 설정합니다.적절한 값을 식별하려면 모듈을 단계별로 실행한 다음 입력 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 피크가 일반적으로 배경을 나타내는 히스토그램을 표시합니다. background intensity에서 시작하여 출력 이미지에 표시된 대로 핵의 양호한 분할이 이루어질 때까지 매개변수를 증가시킵니다. 이미지 분석 파이프라인의 목표는 복제 박테리아가 포함된 세포를 식별하는 것입니다.이는 핵, 핵주위 및 보로노이 세포체의 병원체 신호에 대해 서로 다른 임계값을 설정하여 달성됩니다. 모듈 15에 대해 일시 중지 및 표시를 활성화합니다. 앞에서 설명한 것처럼 개체를 필터링하고 Run을 누릅니다.핵에서 브루셀라가 명확하게 보이는 세포만 유지되고 나머지는 모두 필터링되어 제거되도록 매개변수 최소값을 충분히 높게 설정합니다. 좋은 값을 식별하려면 모듈을 단계별로 실행하고 출력 이미지를 표시합니다. 핵에서 명확하게 보이는 브루셀라가 있는 세포만 유지될 때까지 값을 단계적으로 늘립니다.텍스트 프로토콜에 따라 모듈 16 및 17에서 주핵 주위 및 보로노이 세포체에 박테리아가 있는 세포를 필터링한 후 테스트 모드를 종료하고 모듈 옆에 있는 모든 눈 기호를 선택 취소하여 전체 분석을 실행하기 전에 어떤 모듈도 디스플레이에 표시되지 않는지 확인합니다. 마지막으로 이미지 분석을 눌러 분석을 시작합니다. 분석이 완료되면 결과 PNG 이미지와 CSV 스프레드시트를 검사하여 분석이 플레이트 전체에서 안정적으로 작동했는지 확인합니다.텍스트 프로토콜에 따라 진입 분석 및 감염 점수를 수행합니다. 이 그림은 종말점 분석에서 감염된 세포를 자동으로 식별하는 데 사용되는 이미지 분석의 예를 보여줍니다. DAPI로 염색된 핵 HeLa 세포가 확인되었습니다.핵을 둘러싸고 있는 8픽셀 너비의 핵 주위. 그리고 핵의 확장에 의한 보로노이 세포체(Voronoi cell body)를 25 픽셀로 계산하였다. 병원체 신호가 적어도 하나의 구획에서 해당 임계값을 초과하는 경우 세포가 감염된 것으로 간주되었습니다.브루셀라는 숙주 세포의 성공적인 참여를 위해 행동 재배열이 필요합니다. 따라서 ARP23의 고갈은 siRNA 스크리닝에 적합한 양성 대조군입니다. ARPC3의 고갈은 감염 2일 후 증식하는 박테리아가 있는 세포의 수를 줄였습니다.스크램블 처리된 대조 세포와 비교. 이 그래프에서 대조 세포에 비해 ARPC3 고갈된 HeLa 세포의 감염이 감소하는 것으로 정량적으로 관찰된 자동화된 이미지 분석. ARPC3의 고갈은 또한 대조 세포에 비해 진입 분석에서 브루셀라 감염이 감소한 것으로 나타났습니다.노란색으로 표시된 세포 내 브루셀라의 수가 감소한 것에서 알 수 있듯이. 마지막으로, 자동 이미지 분석을 통한 감염 정량화는 ARPC3의 고갈로 인해 감염된 세포의 수와 감염된 세포 내 박테리아의 수가 감소하는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜은 일단 마스터되면 실험 시작 후 1주 반 이내에 이미지 분석 결과를 제공할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 이미지 분석 결과를 주의 깊게 검토하여 선택한 매개변수가 전체 플레이트에서 잘 작동하는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 살아있는 세포 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 인신매매를 할 때 특정 숙주 요인이 브루첼라와 상호 작용합니다.또는 유전자의 고갈이 감염의 세포 내 역학에 어떤 영향을 미치는지. 개발 후 이 기술은 감염 생물학 분야의 연구자들이 HeLa 세포 분석에서 브루셀라 감염에 필요한 숙주 인자를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 내 병원균인 Brucella abortus에 의한 HeLa 세포의 성공적인 집락화를 촉진하거나 예방하는 숙주 요인을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.브루셀라 낙태를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으며 현지 생물 안전 규정을 엄격히 준수해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

microscopy-based-assays-for-high-throughput-screening-host-factors

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Casanova, A. 외. 헬라 세포의 브루셀라 감염에 관여하는 숙주 인자의 고처리량 스크리닝을 위한 현미경 기반 분석법. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 상피세포에서 브루셀라 아포터스 감염을 siRNA 매개 STING 넉다운으로 고처리량으로 영상화하여 세포 내 박테리아 복제와 숙주 선천 면역 반응에서 세포질 DNA 감지의 역할을 조사합니다.

숙주 상피 세포에서 세포내 브루셀라 아포터스 감염의 고처리량 영상

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Coxiella burnetii의는 인수 공통 질병 Q 열병에 대한 책임 의무적 세포 내 그람 음성 세균이다. 여기에서 우리는 Coxiella 형광 트랜스포존 돌연변이의 발생뿐만 아니라 자동 식별 및 결과 국제화, 복제 및 세포 독성 표현형의 분석 방법을 설명합니다.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

학습하세요 현미경 기반 고처리량 스크리닝을 통해 Brucella 감염에 관여하는 HeLa 세포의 숙주 인자를 식별하는 방법을. siRNA 스크리닝과 자동화된 이미지 분석 파이프라인을 활용하여 감염 메커니즘을 연구하고 치료 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험

더 많은 동영상 탐색