영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐 섬유아세포로부터 진정한 유도 영양막 세포주 또는 iTSC를 생성하는 것입니다. 이 방법은 배아 계통과 배아 외 계통을 구분하는 장벽의 성격에 관한 줄기세포 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주된 장점은 형질전환 발현이 일시적으로만 활성화되어 안정적으로 전환된 세포의 선택이 용이하다는 점입니다.

적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태로 생물 안전 2등급 실험실에서, 100 mL 디쉬 5개에 Poly-L-lysine 용액 5 mL씩을 넣고 플레이트를 가볍게 흔들어 코팅 용액이 고르게 퍼지도록 합니다. 디쉬를 37 °C 인큐베이터에 30분 동안 보관한 후, Poly-L-lysine을 흡입하여 제거하고 PBS로 디쉬를 1회 세척합니다. 다음으로, 293 T 세포 배지 10 mL에 293 T 세포 7 × 10⁶개를 디쉬당 분주하고, 디쉬를 돌려 세포를 고르게 분산시킨 후 다시 인큐베이터에 넣습니다.

다음 날 아침, 성장 배지를 5 mL의 transfection 배지로 교체합니다. 그 후, 배양물에 1000X stock Chloroquine 용액 6 µL를 처리하고 플레이트를 다시 37 °C 인큐베이터에 넣습니다. transfection 혼합물을 준비하려면, 각 Lentiviral vector에 대해 2X HEPES buffered saline 600 µL에 Lentivector DNA 용액 600 µL를 vortexing 하면서 천천히 한 방울씩 첨가하고, transfection 혼합물을 실온에서 배양합니다.

15분 후, 준비된 293 T 세포에 혼합물을 매우 조심스럽게 한 방울씩 첨가하고, 배양 접시를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 5~6시간 후, 배지를 10 milliliters의 바이러스 생산 배지로 교체하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날 아침, 배지를 7 milliliters의 신선한 바이러스 생산 배지로 조심스럽게 교체하여 하룻밤 더 배양합니다.

다음으로, 각 플레이트의 배지를 개별 15 milliliter 원심 분리 튜브에 옮기고, 플레이트에 7 milliliter의 신선한 바이러스 생산 배지를 추가하여 하룻밤 동안 더 배양합니다. 다음 날 아침, 두 번째 바이러스 함유 배지 분획을 수확하여 첫 번째 바이러스 분획의 상층액과 합친 후, 바이러스 함유 배지를 0.45 micron 계면활성제 제거 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 필터로 여과하여 500 microliter씩 분주해 -80°C에 보관합니다. 섬유아세포를 유도 전영양막 줄기세포로 전환하려면, 형질도입된 생쥐 배아 섬유아세포(MEFs)를 2 milliliter의 PBS로 2회 세척합니다.

그 다음, 37°C에서 0.5 mL의 Trypsin EDTA 용액을 사용하여 세포를 탈착시킵니다. 3~4분 후, 도립현미경으로 세포가 플레이트에서 떨어져 나왔는지 확인한 다음, 1 mL의 TS 배지를 가하여 Trypsin을 불활성화합니다. 세포 현탁액을 각각의 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포를 원심분리합니다.

그 다음 펠렛을 2 mL의 TS 배지로 재현탁하고, 100 mm 디쉬당 10 mL의 TS 배지에 섬유아세포 성장 인자 4(fibroblast growth factor 4)와 헤파린(Heparin) 및 독시사이클린(Doxycycline)을 첨가하여 mCherry 또는 대조군으로 형질전환되지 않은 MEF를 2 × 10⁵개씩 분주한 후 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 형광 현미경 하에서 mCherry 단백질 발현을 통해 형질전환 효율을 추정합니다. 형질전환 효율이 약 100%인 경우, 배양물을 인큐베이터로 옮기고 10일까지 이틀마다 모든 디쉬의 배지를 교체합니다.

그 후, 도립 현미경을 사용하여 4개 인자 배양 접시에서 형질전환 영역의 출현을 최대 3주 동안 관찰하며, Doxycycline이 포함되지 않고 섬유아세포 성장 인자 4(fibroblast growth factor four)와 Heparin이 함유된 신선한 TS 배지로 세포에 먹이를 줍니다. 이 시점에서는 MEF가 형태학적으로 영양막 세포 stem cell과 유사하지 않기 때문에, 형질전환 영역을 식별하는 것이 매우 중요합니다. 세포 크기와 커다란 핵으로 식별되는 영양막 거대 세포(trophoblast giant cells) 인접 부위에 밀집되어 쌓인 콜로니를 찾으십시오.

개별 iTSC 라인을 분리하기 위해, 먼저 박테리아 오염 가능성을 최소화하도록 도립 현미경을 70% ethanol로 닦아냅니다. 다음으로, 96 U bottom well plate의 12개 웰에 0.5% Trypsin EDTA 40 µL를 넣고 플레이트를 얼음에 둡니다. 이제 4개 인자 MEF 전환 분화 디쉬에서 배지를 흡입하여 제거하고 PBS 10 mL로 세포를 한 번 세척합니다.

세척 후, 세포에 신선한 PBS 10 milliliters를 첨가하고 플레이트를 도립 현미경 스테이지 위에 올립니다. 40 microliters로 설정된 100 microliter 피펫을 사용하여, 피펫 팁으로 각 개별 콜로니의 주변을 원형으로 둘러싸 부유하는 콜로니를 흡입합니다. 12개의 콜로니를 선택할 때까지 각 콜로니를 96-well 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다.

그런 다음 콜로니를 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 피펫팅으로 세포를 분리하고, 세포 현탁액을 500 µL의 complete TS 및 fibroblast growth factor와 Heparin 배지가 들어 있는 24웰 플레이트의 개별 웰에 옮겨 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 죽은 세포를 제거하기 위해 배지를 신선한 complete TS 및 fibroblast growth factor와 Heparin 배지로 교체하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.

경계가 뚜렷한 상피 세포 군집(Epithelial colonies)이 나타나는지 매일 배양 상태를 모니터링합니다. 군집이 관찰되면 세포가 70% 밀도(confluent)에 도달할 때까지 또는 최대 일주일 동안 배양합니다. 4가지 인자의 트랜스진(transgene) 발현이 활성화된 배양액에서는 세포의 형태가 빠르게 변화합니다.

14일에서 21일경에 뚜렷한 전환분화 영역이 나타납니다. 이러한 일차 콜로니는 전형적인 영양막 세포 줄기세포의 형태를 띠지 않으나, 계대 배양을 거치면 실제 영양막 세포 줄기세포와 매우 유사한, 경계가 뚜렷하고 밝은 테두리를 가진 특징적인 상피 세포 형태가 관찰됩니다. 4가지 인자로 유도된 영양막 세포 줄기세포가 영양막 전사 인자인 Cdx2 및 Tfap2c에 대해 양성 반응을 유지할 때, 이러한 세포주를 후속 In vitro 또는 In Vivo 분석에 사용할 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 6주 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에는 생성된 iTSCs의 키메라 형성 가능성에 관한 추가 질문에 답하기 위해 blast assisted injection과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 초기 계통 분리 분야의 연구자들이 마우스의 배아 세포 대 배외 세포 운명 전환을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 새로운 배아 섬유아세포를 유도 영양막 줄기세포로 직접 전환하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 렌티바이러스 벡터를 이용한 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 항상 생물 안전 2등급(BSL-2)에 적합한 작업 절차와 같은 예방 조치를 준수해야 함을 잊지 마십시오.