Name: 영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 배우세요 쥐 배아 섬유 아세포를 영양막 줄기 세포로 직접 변환하는 방법을. 특정 전사 인자의 일시적 과발현을 통해 안정적인 iTSC를 생성하여 태반 발달 및 줄기세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

모든 마우스 실험 동물의 보호와 지역 기관 동물 관리위원회 (Landesamt FUER 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz, 노르 트라 인베스트 팔렌 [승인 ID 번호의 승인을 계약의 독일 법에 따라 수행 하였다 : 84-02.04.2013 AZ .A428). 1. 미디어 준비 <ol><li> 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM), 10 % (V / V) FBS, L- 글루타민 (2 mM)을 피루브산 나트륨 (1 mM)을 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1X) 293T 매체를 준비한다. </li><li> DMEM, 10 % (V / V) FBS, L- 글루타민 (2 mM)을, 1X 비 필수 아미노산, 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1X) MEF 매체를 준비한다. </li><li> TS 매체를 준비 (w / FGF4 / 헤파린 O) : 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 1640, 20 % (v / v)의 FBS (줄기 세포 배양 등급), 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 배), L- 글루타민 (2 mM의 b), 나트륨 피루 베이트 (1 mM)을 2- 메르 캅토 에탄올 (0.1 mm)이다. </li><li> 줄기 세포 (RPMI 1640, 20 % (V / V) FBS : FGF4 / 헤파린 (TS + F4H)와 TS 배지를 준비배양 등급), 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1X), L- 글루타민 (2 mM)을 피루브산 나트륨 (1 mM)을 2- 메르 캅토 에탄올 (0.1 mM)을 25 NG / ㎖ FGF4 / ㎖의 헤파린을 1 μg의. 참고 : FGF4 및 헤파린 직접 사용하기 직전에 미디어에 추가됩니다. </li><li> FGF4 / 헤파린 (TS-CM + F4H)와 TS-CM을 준비 : 70 % MEF 에어컨 TS 매체 + 30 % 갓 준비 TS 매체 + 25 NG / ㎖ FGF4, 1 μg의 / ㎖ 헤파린. 참고 : FGF4 및 헤파린 직접 사용하기 직전에 미디어에 추가됩니다. </li><li> 형질 매체 준비 : 고급 DMEM, 2 % (v / v)의 FBS를 (세포 배양 학년 줄기), L- 글루타민 (2 mM)을, 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 배). </li><li> 바이러스 생산 배지 준비 : 고급 DMEM, 5 % (v / v)의 FBS를 (세포 배양 학년 줄기), L- 글루타민 (2 mM)을, 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 배). </li></ol> 2. 쥐 배아 섬유 아세포 유도 <ol><li> 129S2SV 여성과 동형 접합 남성 R26 :: rtTA 마우스 (주 이름 중량 사용하여 설정 시간이 초과 교배, B6.Cg-GT는 (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) 재 / J 7). 자궁 전위에 의해 E13.5 희생 마우스에서 표준 프로토콜 8 항에 기본 쥐의 배아 섬유 아세포 (MEFs에)를 분리. 그 후, MEF 미디어에서 150mm 접시에 하나의 배아에서 플레이트 세포. </li><li> 차 MEF 문화가 150mm 요리에 포화 상태에 도달하면, 10 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻어 4 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 인큐베이터에서 4 분 - 3 요리를 품어. </li><li> 배양 검사 후에 도립 현미경 (10 배의 렌즈를 사용)를 사용하여 접시로부터 분리 된 세포의 경우. 트립신을 중지하고 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 수집하기 위해 MEF 매체의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 풀 세포의 여러 요리에서 서스펜션과 50 ML 원뿔 튜브에 수집합니다. 200 XG에 3 분 10 ° C에 대한 원심 분리기 세포 현탁액. </li><li> 10 % (v / v)의 디메틸 설폭 사이드를 포함 FBS에서 상층 액과에 resuspend 세포 펠렛을 폐기하십시오. 더 사용 분취에서 MEFs에 동결. 참고 : 또는, 야생 일반을 사용전자 주 MEFs에; 그러나, rtTA 발현 추가 렌티 바이러스 벡터 (Maherali 등. (9)에 의해 기재된 FUdeltaGW-rtTA 플라스미드 등을 사용하여) 다른 렌티 바이러스 벡터와 함께 형질 도입 될 필요가있다. </li><li> MEF 에어컨 TS 매체의 제조 참고 : 이전에 변환 실험에, MEF 에어컨 (CM) TS 미디어 (6 절에 설명) 개인 ITSC 라인의 배양을 위해 요구되는 준비 할 수있다. <ol><li> 접시 요리의 원하는 수에 MEF 매체에 150mm 접시 당 1 × 10 7 mitotically 불 활성화 MEFs에. 9 Gy의의 복용량 γ-조사에 의해 MEFs에를 비활성화. 참고 : 150mm 접시 당 수율이 약 60 ml의 CM의입니다. </li><li> 도금, 흡인 후 하루는 MEF 매체를 폐기하고 다시 37 ° C에서 인큐베이터에 MEFs에 장소 요리 mitotically 불 활성화 된 각각의 접시에 갓 (FGF4 / 헤파린없이) TS 매체를 제조 20 ㎖를 추가합니다. </li><li> 배양 후mitotically 불 활성화 MEFs에에 3 일 동안 TS 매체는 50 ML 원뿔 튜브 매체를 수집합니다. 0.2 μm의 필터를 통해 매체를 필터링 및 2.6.4를 진행합니다. CM의 또 다른 배치의 준비를위한 신선한 TS 매체의 20 ml의 CM를 교체합니다. 주 : Mitotically 비활성화 된 MEFs는 3 회까지 CM의 제조에 사용될 수있다. </li><li> 분취 액을 -20 ℃에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브 저장소로 여과 CM 35 mL로 필요할 때까지. 해동 후, 최대 한 달 동안 4 ℃에서 70 %의 TS-CM을 얻기 위해 저장 갓 제조 TS 배지 15 mL로 추가한다. </li></ol></li></ol> 293T 세포 3. 렌티 바이러스 벡터 생산 참고 : 모든 단계 바이오 안전성 레벨 2에 라이센스 실험실 공간에서 수행된다. <ol><li> 이전 변환 실험에 과발현 Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2 및 mCherry의 의존 독시 싸이클린 (D​​OX)에 대한 렌티 바이러스 벡터를 준비합니다. 각 렌티 들어, 공동 트랜의 293T 세포는를 사용하여포장 플라스미드 및 VSV-G 표현 봉투 플라스미드 (플라스미드 정보 자료 표 참조)과 함께 각각의 렌티 바이러스 전이 벡터. 참고 :. 도움이되는 정보를 바이러스 생산 Gavrilescu 등 10 참조 관련. 이 레트로 바이러스 생산을 설명하지만, 293T 세포 및 플라스미드 DNA의 품질에 대한 일반적인 설명도 렌티 바이러스 생산 마찬가지이다. 주의 : 렌티 바이러스 벡터 및 작업 작업을 할 때 적절한 안전 조치가 취해질 필요는 바이오 안전성 수준이 시설에서 수행되어야한다. </li><li> 코트 폴리 -L- 라이신 (100 μg의 / ml) 용액에 5 ml의 요리를 덮고 부드럽게 균일하게 코팅 솔루션을 배포하는 락에 의해 솔루션 오 100mm 요리. 30 분 동안 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 요리를 놓습니다. 30 분 대기음 코팅 용액 후 PBS로 한번 요리를 씻어. </li><li> 10 ml의 293T 세포 미디어 접시 당 플레이트 (7) × 10 (6) 293T 세포이야WIRL 요리 균등하게 37 ° C에서 다시 인큐베이터로 세포 및 장소 요리를 배포합니다. </li><li> 다음날 아침, 형질 매체의 5 ㎖로 성장 매체를 교체합니다. 다시 37 ° C에서 인큐베이터에 클로로퀸 용액 (25 mM)을 제자리 요리의 1000 배 주식의 6 μl를 추가합니다. </li><li> 한편, 형질 감염 혼합물을 제조한다 : <ol><li> 각 렌티 바이러스 벡터 두 5 ㎖ 반응 관을 제조, A와 B로 표시된 </li><li> 배 HEPES의 추가 600 μL 튜브 A에 식염수 (HBS)를 버퍼 </li><li> 18.5 μg의 lentivector의 DNA와 9.25 μg의 psPAX2 및 pMD2.G.의 9.25 μg의와 튜브 B 믹스 61.5 μL 염화칼슘 2 용액 (2 M) 멸균 문화 학년 H 2 O. 600 μL에 볼륨을 조절 </li><li> 텍싱 동안 튜브 B 드롭 현명한 튜브 (A)에에서 솔루션을 추가합니다. RT에서 15 분 동안 형질 전환 혼합물을 인큐베이션. </li></ol></li><li> 매우 신중하게 형질 전환 혼합물을 추가 100mm 접시에 준비된 293T 세포에 현명한 놓습니다. 에이6 시간을 따고 5는 매체를 제거하고 바이러스 생산 배지 10 ㎖로 교체합니다. 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 요리를 놓습니다. 참고 : 제거 및 293T 세포가 쉽게 접시에서 분리하기 때문에 매체를 교체 할 때주의해야합니다. 클로로퀸에 장기간 노출이 세포에 독성이 있기 때문에 중간 변경 형질 전환 후 5 ~ 6 시​​간은 매우 중요하다. </li><li> 다음 날 아침, 조심스럽게 제거하고 중간 삭제하고 바이러스 생산 배지의 7 ㎖로 교체합니다. </li><li> 다음 아침 바이러스 함유 매체의 제 1 배치를 수확. 대기음 15 ML 원뿔 튜브 중간 수집합니다. 다시, 세포에 바이러스 생산 배지의 7 ml에 추가 할 수 있습니다. 두 번째 배치는 다음 날 수확 때까지 보관 냉장고에 매체 바이러스 함유. </li><li> 다음날 아침 15 ml의 첫번째 배치를 포함하는 원뿔 튜브를 추가 바이러스 함유 매체의 두 번째 배치를 대기음. 293T 세포는 이제 버려 질 수있다. 필터 0.45 μm의 쉬르 통해 매체 바이러스 함유factant없는 셀룰로오스 아세테이트 -membrane 필터. 나누어지는 필터링, 바이러스 함유 추가로 사용하기 위해 -80 ° C에서 매체 및 저장합니다. 주 : 바이러스 생산은 6 웰 접시에서 수행 될 수있다. 이에 따라 볼륨과 세포 수를 확장 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 섬유 아세포 형질 도입 4 요소와 mCherry 제어 벡터 참고 : 모든 단계는 바이오 안전성 수준이 시설에서 수행된다. <ol><li> 실험 개요의 개략도를 들어. 그림 1 참조 주 rtTA - MEFs에의 한 나누어지는을 해동 및 MEF 매체의 2 ML의 총 부피에 6 잘 요리 잘 당 3.33 × 10 5 세포를 접시. 적어도 3 개의 우물을 준비하고 4 요소 (4 층) mCherry 및 제어,로 레이블을 붙입니다. 참고 : rtTA 발현하는 렌티 바이러스 벡터 단계 4.2 동안 lentivector 칵테일에 추가 될 때 또는 야생형 MEFs에가, 사용할 수 있습니다. </li><li> 세포 후 다음 날 완전히 cryopre에서 회복보전은 각각 전달 매체의 0.6 ㎖ (4 층), 0.9 ㎖ (mCherry) 1 ㎖ (제어)와 세 6 우물에 MEF 매체를 교체합니다. RT에서 PLV-TETO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -ets 및 -mCherry 바이러스 중 하나 나누어지는을 해동하고 잘 4 층에 각각의 바이러스 함유 상층 액 100 ㎕ (Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2)를 추가합니다. 참고 : 야생형 MEFs에의 경우, 100 μL에 의해 예비 도금 미디어의 볼륨을 줄이고 추가로 4 층 믹스에 뜨는을 포함 FUdeltaGW-rtTA 바이러스의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 mCherry 표지에 mCherry 바이러스 함유 매체의 100 μl를 추가합니다. 각 웰에 8 μg / ML의 최종 농도로 폴리 브렌을 추가한다. 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 접시를 놓고 바이러스를 함유 상층 액과 MEFs에 O / N을 품어. 참고 : 야생형 MEFs에의 경우, 100 μL에 의해 예비 도금 미디어의 볼륨을 줄이고 추가 FUdeltaGW-rtTA 바이러스 함유 상층 액 100 μl를 추가합니다. </li><li> 다음날 아침, 조심스럽게 제거바이러스 함유 매체와 PBS 2 ㎖로 3 회 세척한다. 마지막으로, (FGF4 / 헤파린없이) TS 미디어 2 ㎖를 추가합니다. 참고 : 형질 MEFs에가 직접 ITSC 유도 실험에 사용하거나 추가 사용을 위해 얼 수있다. </li></ol> 5. 섬유 아세포 ITSC 변환에 참고 : 모든 단계 바이오 안전성 레벨 2에 라이센스 실험실 공간에서 수행된다. <ol><li> 4 분 - 2 ml의 PBS와 0.5 ml의 트립신 / EDTA 용액을 3 인큐베이터에서 그들을 품어 추가 한 후 두 번 형질 MEFs에 씻으십시오. 세포의 적절한 분리를위한 거꾸로 현미경으로 확인합니다. <ol><li> 1 ML의 TS 배지를 첨가함으로써 트립신을 비활성화한다. 200 X g에서 3 분 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다. 뜨는을 취소하고 2 ML의 TS 배지에서 세포를 재현 탁. 세포를 계산하기 위해 untransduced 제어 샘플을 사용합니다. </li><li> 플레이트 4 층 - MEFs에, mCherry-MEFs에 2 × 105의 밀도에서 untransduced 제어 MEFs에 각각10 ㎖의 TS에서 100mm 세포 배양 접시에 세포 당 2 μg의 매체 / ㎖ DOX (TS 배지 +를 FGF4 / 헤파린 + DOX)을 함유. </li><li> 또한, 작은 접시에 분화를 수행합니다. 따라서 원하는 접시 크기, 규모 볼륨 cm 2 당 3.6 × 10 3 세포를 플레이트. </li></ol></li><li> 다음날, 형질 도입 효율을 추정하기 위해 mCherry 단백질의 발현을 모니터링 (a 10X 렌즈 및 적색 형광 여기에 적합한 필터 사용) 표면 형광 현미경. 참고 : 형질 도입 효율이 100 %에 가까워 야합니다. 증가 된 세포 사멸을 유도 한 후 트랜스 분명한 경우이 바이러스 역가가 너무 높은 것을 의미한다. 전달 바이러스 함유 배지의 감소 된 양을 반복해야합니다. </li><li> 지금 변화 미디어의 모든 요리 도금 후 10 일까지 매일합니다. 그 후, DOX (TS 매체 + FGF4 / 헤파린)없이 TS 매체와 세포를 공급. </li><li> 거꾸로 현미경의 모니터를 사용하여외관 최대 3 주 동안 4 층 접시에 (그림 2B와 C 참조) &#39;지역 transdifferentiated&#39;가. 이러한 식민지는 두 제어 요리 (mCherry-MEFs에와 untransduced MEFs에)에 표시되지해야합니다. </li></ol> 개인 ITSC 라인 6. 분리 주의 : 단계 6.3 조직 배양 후드는 필요하지 않다. 세균 오염의 가능성을 최소화하기 위해 70 %의 에탄올로 거꾸로 현미경을 닦아하는 것이 좋습니다. 개인 ITSC의 식민지 일 21 분화 28 일 사이에 분리 할 수​​있다. <ol><li> 96 U-하단에 잘 접시 12 우물에 0.05 % 트립신 / EDTA 용액 40 μl를 추가하고 얼음에 접시를 놓습니다. </li><li> 콜로니 분리, 4F-MEF의 분화 접시에 흡인 매체 전에. 10 ml의 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 다시 거꾸로 현미경 하에서 10 ml의 PBS를 추가하고 장소 접시. </li><li> C에 의해 개별 식민지를 40 μL로 설정 100 μL 피펫을 리프트 사용피펫 팁을 ircling 및 부동 식민지를 흡입. 한 식민지의 전송 세포 제조 된 96 웰 접시의 잘 하나에 각. 수확 후 12 콜로니를 5 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 96 잘 접시를 놓습니다. </li><li> TS-CM 매체 (30 % 신선한 TS 매체 + 70 % CM + FGF4 / 헤파린)의 준비 500 μL와 24 잘 요리 잘 하나에 여러 번 전송 세포 현탁액을 위해 아래로 pipetting에 의해 세포를 떼어 놓다. </li><li> 다음 날은 죽은 세포를 제거하는 신선한 TS-CM 매체와 매체를 교체하십시오. 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 밝은 경계 상피 식민지의 모습을 모니터 (그림 2 참조). 식민지가 표시되면, 문화 70 % 합류 할 때까지 또는 최대 일주일 점차 큰 요리에 확장합니다. 지금부터, 혈청 함유 미디어 또는 무 혈청, 정의 미디어 3,5,11 표준 프로토콜에 따라 선의의 TSC로 배양 세포. </li></ol>

<ol><li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538(2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li>
<li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+S+%22Science%22">Science</a>. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li>
<li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta%2Factivin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li>
<li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550(2007).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

여기에 제시된 4 인자 (Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2)를 기반으로 분화 프로토콜은 충실하게 생성 마우스 배아 섬유 아세포에서 iTSCs을 변환 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 또한, 상기 방법은 비록 배아 섬유 아세포 (3)에 비해 효율의 저하로도 산후 테일 섬유 아세포에 적용된다. 일반적으로, 기본 섬유 아세포의 분화 품질 결과 및 치료의 중요한 요소가 초기 통로 세포 (통로 3-2)를 사용하여 수행되어야한다. 이 프로토콜의 강도는 유전자 발현의 시간 제어를 허용 독시사이클린 - 유도 성 벡터를 사용하는 것이다. 이는 유전자 발현 독립적 TSC 운명을 유지 내생 전사 인자를 활성화 네트워크 안정 ITSC 라인의 생성을 가능하게한다. 이것은 줄기 세포의 운명 TSC의 유도를 설명하기 이전에 발행 프로토콜 대조적이다 방법 그쪽현재까지 t은 불완전 재 프로그램 영양막 세포의 줄기 세포 유사 세포 (1)를 산출...

최근 줄기 세포 변환을 영양막하는 마우스 배아 줄기 세포의 여러 가지 접근 방식을 비교하는 연구는 모든 분석 시스템에서, 혈통 전환이 불완전 남아 있음을 밝혔다. 대신 그래서 영양막 줄기라고 유도 영양막 줄기 세포 (iTSCs)의 세포 유사 세포가 기원 한 세포의 운명의 메모리 유지 생성되었다. 여기, 우리는 ITSC 세대의 다른 접근 방식을 따랐다. 쥐 배아 섬유 아세포 (MEFs에) (2)로부터 다 능성 줄기 세포의 직접 유도와 유사하게, iTSCs 직접 분화 된 체세포 조직에서 변환되었다. 첫째, 우리는 MEFs에에서 과발현 때 TSC의 운명을 유도 (12) 후보 요인을 확인했다. 나중에, 요소 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2는 ITSC 유도 3 필요하고 충분한 것으로 확인되었다. 동시에, 다른 그룹은 독립적으로 iTSCs에 MEFs에 변환 할 충분한 것으로 Tfap2c, GATA3 및 Eomes를 발견했다. 그러나,에 그연구는 유전자 발현을 위해 필요한 시간이 상당히 길어 Ets2는 분화 칵테일 4에없는 경우에는, 다른 전환 반응 속도를 나타내는 연구와 비교된다. 유도 배반포 영양막 유래 줄기 세포의 배양을 포함하는 종래의 소 태아 혈청 (FBS)을 성장 비활성화 MEFs에 5,6- 분비 인자의 존재에 의존한다. ITSC​​ 유도하는 동안, 이러한 요인은 유전자의 전체 조합이 부족 분화가 진행되지 않습니다 MEFs에 의해 제공됩니다. 그러나 한 번 개인 ITSC 식민지 그들은 성장 비활성화 MEFs에 의해 미리 조정 된 미디어를 필요로 계대 배양합니다. 거기부터 iTSCs 배양 및 표준 프로토콜에 따라 배반포 유래의 TSC처럼 취급 할 수 있습니다. 참고로, 세포 배양 접시를 겔화없이 다나카 등. (5) 우리가 일상적으로 배양의 TSC와 iTSCs 대조적.

<table><tbody><tr><td>독시사이클린 하이클레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9891-10G</td><td>멸균 PBS에 용해시키고 2mg/ml 원액을 준비합니다. 부분 표본을 -20 &deg에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>클로로퀸 디포스페이트 염&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>멸균 세포 배양 등급의 물에 25mM 원액을 준비합니다. 부분 표본을 -20 &deg에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>폴리브레네(헥사디메트린 브로마이드)</td><td>시그마-알드리치</td><td>107689-10G</td><td>멸균 세포 배양 등급의 물에 8mg/ml 원액을 준비합니다. 부분 표본을 -20 &deg에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>인간 재조합 섬유 아세포 성장 인자 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>PBS의 멸균 0.1 % BSA에 용해하고 25 &micro를 준비하십시오. g/ml 원액. 부분 표본을 -80 &deg에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>멸균 PBS에 용해하여 1mg/ml 원액을 준비합니다. 부분 표본은 -80°C에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>ProFection Mammalian Transfection System</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, 글루타민 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>계면활성제 무함유 셀룰로오스 아세테이트-멤브레인 필터</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루베이트;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO), 세포 배양 등급</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>생쥐 B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7</td><td>JAX 마우스</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>찰스 리버</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

영양막 줄기 세포 (의 TSC)는 포유 동물 발달에서 제 1 셀의 운명 결정의 결과로서 발생한다. 그들은 자기 갱신과 태반의 태아 부분에 세포 인구주는 상승 줄기 생체에 해당 영양막 세포 계보의 모든 하위 유형으로 분화 할 수있는 능력을 유지, 체외에서 배양 할 수있다. 따라서,의 TSC는 체외에서 여분의 배아 세포 운명 결정 대 태반 개발 및 배아를 연구하는 독특한 모델을 제공합니다. 이후 배반포 단계에서 DNA 메틸화와 히스톤 수정 구성된 별개의 후생 유전 학적 장벽은 단단히 두 계통을 분리한다. 여기, 우리는 완전히 과발현 쥐의 배아 섬유 아세포에서 영양막 세포 키 규제 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2의 과도하여이 혈통의 장벽을 극복 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유도 영양막 세포의 줄기 세포는 자기 갱신 할 수 있습니다 및 파생 영양막 세포의 줄기 세포를 배반포 거의 동일하다 내가형태, 마커 유전자 발현과 메틸화 패턴 N 조건. 생체 외 및 생체 내 분석 기능은 이러한 세포는 영양막 세포의 혈통이 배수체 영양막 세포 거대 세포를 생성하고 포배에 주입하면 태반을 chimerizing 따라 차별화 할 수 있는지 확인합니다. 체세포 조직에서 영양막 줄기 세포의 유도는이 엑스트라 배아 혈통 유전자 및 후생 유전 학적 특성을 연구하는 새로운 길을 열고 각각의 배아를 파괴하지 않고 영양막 줄기 세포주를 생성하기위한 가능성을 제공한다.

4 층의 유전자 발현이 활성화 접시에서 세포를 신속하게 형태를 (그림 2A와 B를 비교)로 변경합니다. 하루의 주위에 14-21 별개의 transdifferentiated 영역 (두 가지 예는 그림 2B와 C에 나와있다) 등장. 이 차의 식민지는 전형적인 TSC 형태 부족; 그러나 그들은 단단한 가장자리와 선의의 TSC의 매우 연상시키는 밝은 경계 계대 배양, 특성 상피 형태 나타난다 (그림 2D) 일단. 영양막 세포의 전사에 대한 긍정적 인 4F-iTSCs 얼룩은 CDX2와 Tfap2c (그림 2E)을 요인. 이러한 ITSC 라인은 현재 시험 관내 또는 생체 내 분석에 대한 후속 즉 체외 분화 검정 또는 태반 키메라 실험에 사용될 수있다. <p class="jove_conten...

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐 섬유아세포로부터 진정한 유도 영양막 세포주 또는 iTSC를 생성하는 것입니다. 이 방법은 배아 계통과 배아 외 계통을 구분하는 장벽의 성격에 관한 줄기세포 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주된 장점은 형질전환 발현이 일시적으로만 활성화되어 안정적으로 전환된 세포의 선택이 용이하다는 점입니다.적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태로 생물 안전 2등급 실험실에서, 100 mL 디쉬 5개에 Poly-L-lysine 용액 5 mL씩을 넣고 플레이트를 가볍게 흔들어 코팅 용액이 고르게 퍼지도록 합니다. 디쉬를 37 °C 인큐베이터에 30분 동안 보관한 후, Poly-L-lysine을 흡입하여 제거하고 PBS로 디쉬를 1회 세척합니다. 다음으로, 293 T 세포 배지 10 mL에 293 T 세포 7 × 10⁶개를 디쉬당 분주하고, 디쉬를 돌려 세포를 고르게 분산시킨 후 다시 인큐베이터에 넣습니다.다음 날 아침, 성장 배지를 5 mL의 transfection 배지로 교체합니다. 그 후, 배양물에 1000X stock Chloroquine 용액 6 µL를 처리하고 플레이트를 다시 37 °C 인큐베이터에 넣습니다. transfection 혼합물을 준비하려면, 각 Lentiviral vector에 대해 2X HEPES buffered saline 600 µL에 Lentivector DNA 용액 600 µL를 vortexing 하면서 천천히 한 방울씩 첨가하고, transfection 혼합물을 실온에서 배양합니다.15분 후, 준비된 293 T 세포에 혼합물을 매우 조심스럽게 한 방울씩 첨가하고, 배양 접시를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 5~6시간 후, 배지를 10 milliliters의 바이러스 생산 배지로 교체하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날 아침, 배지를 7 milliliters의 신선한 바이러스 생산 배지로 조심스럽게 교체하여 하룻밤 더 배양합니다.다음으로, 각 플레이트의 배지를 개별 15 milliliter 원심 분리 튜브에 옮기고, 플레이트에 7 milliliter의 신선한 바이러스 생산 배지를 추가하여 하룻밤 동안 더 배양합니다. 다음 날 아침, 두 번째 바이러스 함유 배지 분획을 수확하여 첫 번째 바이러스 분획의 상층액과 합친 후, 바이러스 함유 배지를 0.45 micron 계면활성제 제거 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 필터로 여과하여 500 microliter씩 분주해 -80°C에 보관합니다. 섬유아세포를 유도 전영양막 줄기세포로 전환하려면, 형질도입된 생쥐 배아 섬유아세포(MEFs)를 2 milliliter의 PBS로 2회 세척합니다.그 다음, 37°C에서 0.5 mL의 Trypsin EDTA 용액을 사용하여 세포를 탈착시킵니다. 3~4분 후, 도립현미경으로 세포가 플레이트에서 떨어져 나왔는지 확인한 다음, 1 mL의 TS 배지를 가하여 Trypsin을 불활성화합니다. 세포 현탁액을 각각의 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포를 원심분리합니다.그 다음 펠렛을 2 mL의 TS 배지로 재현탁하고, 100 mm 디쉬당 10 mL의 TS 배지에 섬유아세포 성장 인자 4(fibroblast growth factor 4)와 헤파린(Heparin) 및 독시사이클린(Doxycycline)을 첨가하여 mCherry 또는 대조군으로 형질전환되지 않은 MEF를 2 × 10⁵개씩 분주한 후 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 형광 현미경 하에서 mCherry 단백질 발현을 통해 형질전환 효율을 추정합니다. 형질전환 효율이 약 100%인 경우, 배양물을 인큐베이터로 옮기고 10일까지 이틀마다 모든 디쉬의 배지를 교체합니다.그 후, 도립 현미경을 사용하여 4개 인자 배양 접시에서 형질전환 영역의 출현을 최대 3주 동안 관찰하며, Doxycycline이 포함되지 않고 섬유아세포 성장 인자 4(fibroblast growth factor four)와 Heparin이 함유된 신선한 TS 배지로 세포에 먹이를 줍니다. 이 시점에서는 MEF가 형태학적으로 영양막 세포 stem cell과 유사하지 않기 때문에, 형질전환 영역을 식별하는 것이 매우 중요합니다. 세포 크기와 커다란 핵으로 식별되는 영양막 거대 세포(trophoblast giant cells) 인접 부위에 밀집되어 쌓인 콜로니를 찾으십시오.개별 iTSC 라인을 분리하기 위해, 먼저 박테리아 오염 가능성을 최소화하도록 도립 현미경을 70% ethanol로 닦아냅니다. 다음으로, 96 U bottom well plate의 12개 웰에 0.5% Trypsin EDTA 40 µL를 넣고 플레이트를 얼음에 둡니다. 이제 4개 인자 MEF 전환 분화 디쉬에서 배지를 흡입하여 제거하고 PBS 10 mL로 세포를 한 번 세척합니다.세척 후, 세포에 신선한 PBS 10 milliliters를 첨가하고 플레이트를 도립 현미경 스테이지 위에 올립니다. 40 microliters로 설정된 100 microliter 피펫을 사용하여, 피펫 팁으로 각 개별 콜로니의 주변을 원형으로 둘러싸 부유하는 콜로니를 흡입합니다. 12개의 콜로니를 선택할 때까지 각 콜로니를 96-well 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다.그런 다음 콜로니를 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 피펫팅으로 세포를 분리하고, 세포 현탁액을 500 µL의 complete TS 및 fibroblast growth factor와 Heparin 배지가 들어 있는 24웰 플레이트의 개별 웰에 옮겨 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 죽은 세포를 제거하기 위해 배지를 신선한 complete TS 및 fibroblast growth factor와 Heparin 배지로 교체하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.경계가 뚜렷한 상피 세포 군집(Epithelial colonies)이 나타나는지 매일 배양 상태를 모니터링합니다. 군집이 관찰되면 세포가 70% 밀도(confluent)에 도달할 때까지 또는 최대 일주일 동안 배양합니다. 4가지 인자의 트랜스진(transgene) 발현이 활성화된 배양액에서는 세포의 형태가 빠르게 변화합니다.14일에서 21일경에 뚜렷한 전환분화 영역이 나타납니다. 이러한 일차 콜로니는 전형적인 영양막 세포 줄기세포의 형태를 띠지 않으나, 계대 배양을 거치면 실제 영양막 세포 줄기세포와 매우 유사한, 경계가 뚜렷하고 밝은 테두리를 가진 특징적인 상피 세포 형태가 관찰됩니다. 4가지 인자로 유도된 영양막 세포 줄기세포가 영양막 전사 인자인 Cdx2 및 Tfap2c에 대해 양성 반응을 유지할 때, 이러한 세포주를 후속 In vitro 또는 In Vivo 분석에 사용할 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 6주 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에는 생성된 iTSCs의 키메라 형성 가능성에 관한 추가 질문에 답하기 위해 blast assisted injection과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 초기 계통 분리 분야의 연구자들이 마우스의 배아 세포 대 배외 세포 운명 전환을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후에는 새로운 배아 섬유아세포를 유도 영양막 줄기세포로 직접 전환하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 렌티바이러스 벡터를 이용한 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 항상 생물 안전 2등급(BSL-2)에 적합한 작업 절차와 같은 예방 조치를 준수해야 함을 잊지 마십시오.

protocol-for-direct-conversion-murine-embryonic-fibroblasts-into

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 고립과 blastocysts에서 trophoblast의 줄기 세포의 유도를 보여줍니다. 우리는 또한 줄기 세포 속성의 유지 보수뿐만 아니라 문화에 분화의 유도에 대한 조건을 설명합니다.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

이 연구에서는 비바이러스 기반 전이(transposon) 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성합니다.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

생산 유발에 대 한 우리의 프로토콜 여기 제시 erythroid 창시자 (Iep) 성인 섬유 아 세포 전사 인자 제어를 사용 하 여 마우스에서에서 직접 혈통 프로그래밍 (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

이 프로토콜은 생쥐의 임신 중 모계 혈관 구조의 변화를 평가하는 기술을 설명합니다. 입체학적 방법을 사용하여 탈피나선동맥의 리모델링을 정량적으로 평가하고 결과는 면역조직화학을 사용하여 정성적으로 확인했습니다.

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

배우세요 쥐 배아 섬유 아세포를 영양막 줄기 세포로 직접 변환하는 방법을. 특정 전사 인자의 일시적 과발현을 통해 안정적인 iTSC를 생성하여 태반 발달 및 줄기세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

더 많은 동영상 탐색