RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

이 절차의 전반적인 목표는 아카이브 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 코어에서 RNA와 DNA를 순차적으로 추출하는 것입니다. 이것은 RNA와 DNA를 모두 추출할 조직 코어를 수확하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 조직 블록의 정확하게 표적화된 영역에서 RNA 및 DNA 수율을 개선한다는 것입니다.

이 절차는 주로 보관 전립선암 조직에서 개발됩니다. 다른 유형의 보관 조직에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 조직 코어링 단계가 연구 실험실에서 일반적으로 사용되지 않기 때문에 매우 중요합니다.

대부분의 연구실은 대신 단면을 사용하는데, 이는 조직을 더 빨리 소모하고 샘플에 상당한 이질성을 추가합니다. 먼저 현미경 슬라이드를 검토하고 fine point 영구 마커를 사용하여 관심 영역을 간략하게 설명합니다. 다음으로, 현미경 슬라이드의 관심 영역을 덮을 수 있을 만큼 충분히 큰 파라핀 필름 부분을 자릅니다.

그런 다음 필름을 슬라이드에 단단히 놓고 필름이 미끄러지지 않도록 가장자리에 감습니다. Fine Point Permanent Marker를 사용하여 전체 조직과 조직 내 관심 영역의 윤곽을 그립니다. 그런 다음 슬라이드에서 필름을 제거하고 해당 조직 블록으로 옮깁니다.

전체 조직의 윤곽이 블록에서 관찰된 조직 모양과 일치하도록 필름을 뒤집거나 회전하여 필름의 방향을 지정합니다. 미끄러짐을 방지하기 위해 필름 부분을 블록 표면에 단단히 누르십시오. 영구 마커의 끝을 사용하여 관심 영역의 윤곽을 따라 얕지만 눈에 띄는 움푹 들어간 곳을 만든 다음 필름을 제거합니다.

다음으로, 0.6mm 펀치 세트에서 1.5ml의 표백제가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 팁을 담그고 펀치를 위아래로 여러 번 밀어 리셉터 펀치를 청소합니다. 70% 에탄올이 함유된 튜브로 세척을 반복한 다음 물을 줍니다. 이제 청소된 펀치를 관심 영역에 3mm 깊이까지 누르고 빼냅니다.

스타일러스를 사용하여 코어를 펀치 밖으로 밀어 결합이 낮은 마이크로 원심분리기 튜브로 분리합니다. 조직 코어와 와류가 들어 있는 마이크로분리 튜브에 자일렌 1ml를 10초 동안 격렬하게 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 50도로 설정된 열 블록에 3분 동안 놓습니다.

배양 후 실온에서 최대 속도로 2분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 코어를 얼음 위에 5분 동안 올려 왁스 같은 잔류물을 응고시킵니다. 이제 피펫 팁을 사용하여 상층액과 함께 반월상 연골 주변에 쌓인 파라핀을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 자일렌 처리를 반복합니다. 파라핀 자일렌 혼합물을 제거한 후 100% 에탄올 1ml를 넣고 10초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 최대 속도로 2분 동안 원심분리한 후 에탄올을 조심스럽게 버립니다.

균질화를 시작하기 전에 에탄올 세척을 한 번 더 반복합니다. 균질화 전에 700마이크로리터의 100% 에탄올에 파라핀화된 코어를 재현탁합니다. 중간 설정에서 전동 조직 균질화기를 사용하여 코어를 미세 입자로 분쇄합니다.

최적의 DNA 및 RNA 수율을 위해서는 조직 코어의 철저한 균질화가 필요합니다. 다음으로, 별도의 15ml 튜브에 약 10ml의 표백제, RNase 중화 용액 및 70% 에탄올을 채웁니다. 샘플 균질화 후 각 세척 용액에서 균질화 프로브를 순서대로 세척합니다.

세탁 단계에서 균질기를 최고 속도로 실행하십시오. 티슈로 프로브를 닦고 다음 s를 균질화하기 전에 프로브가 완전히 건조되도록 합니다.amp르. 프로브 블레이드에 잔여 조직 조각이 있는지 육안으로 검사하고 발견되면 프로브를 다시 청소하십시오.

균질화 후 100% 에탄올을 사용하여 샘플 부피를 1ml로 가져온 다음 15분 동안 최대 속도로 원심분리합니다. 에탄올을 조심스럽게 흡인하고 proteinase K 추출을 시작하기 전에 펠릿을 약 15-20분 동안 자연 건조합니다. 150마이크로리터의 proteinase K 분해 완충액에 펠릿을 재현탁하고 튜브를 튕겨 펠릿을 느슨하게 합니다.

더 높은 DNA 회수를 위해 하룻밤 동안 proteinase K 분해가 권장됩니다. 10마이크로리터의 온도 안정 proteinase K를 넣고 가볍게 튕겨 섞습니다. 섭씨 56도에서 15분 동안 가벼운 교반으로 배양합니다.

얼음 위에서 튜브를 3분 동안 배양합니다. 냉각 후 최대 속도로 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. 다음으로, 펠릿을 방해하지 않고 RNA 정제를 위해 각 상층액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

DNA 추출을 위한 조직 분해 시간 연장을 포함하는 서면 프로토콜의 최적화된 절차를 사용하여 RNA와 DNA를 추출합니다. RNA와 DNA는 이 방법을 사용하여 오래된 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 샘플에서 회수할 수 있습니다. 핵산은 3세에서 14세 사이의 전립선암 샘플에서 공동 추출되었습니다.

평균 수율은 2, 270 나노그램의 RNA와 820 나노그램의 DNA였습니다. 흥미롭게도, 조직 샘플의 나이와 핵산 회수율 사이에는 유의미한 상관관계가 없었다. 전반적으로 RNA와 DNA 수율은 샘플 간에 상관관계가 있었지만 대부분의 경우 DNA에 비해 두 배 이상 많은 RNA가 회수되었습니다.

이 프로토콜로 추출한 게놈 DNA의 성능을 입증하기 위해 보관 전립선암 샘플에서 중아황산염으로 변환된 DNA 추출물을 메틸화 특이적 PCR로 증폭했습니다. ALU 반복 요소는 메틸화 대조군으로 사용되었으며 샘플 간에 거의 변동이 없었습니다. 전립선암에서 과메틸화되는 것으로 알려진 유전자인 GSTP1은 양성 샘플에서 추출한 DNA를 사용했을 때 메틸화 특이적 PCR에 의해 검출 가능한 증폭을 보여주지 않았습니다.

공격적인 전립선암 환자의 DNA 샘플은 나태한 전립선암 세포의 값보다 낮은 검출 가능한 QPCR 주기 임계값을 나타냈으며, 이는 공격적인 전립선암에서 GSTP1의 메틸화가 증가했음을 나타냅니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 RNA의 경우 3-4시간 이내에 완료할 수 있으며, 적절하게 수행되면 DNA의 경우 하룻밤 동안 분해한 후 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 기술을 통해 분자 병리학 연구자들은 다양한 암에서 진단 DNA 및 RNA 바이오마커를 탐색할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 보관 조직 블록의 정확하게 매핑된 관심 영역에서 DNA와 RNA를 추출하기 위해 조직 코어를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.