본래 식물을 표백제로 또는 추출물의 열처리에 의한 담배 숙주 세포 단백질 제거 방법의 비교

이 일련의 실험의 전반적인 목표는 열을 이용하여 식물 숙주 세포 단백질을 침전시키는 것입니다. 이를 통해 재조합 바이오 의약품 단백질의 후속 크로마토그래피 정제를 용이하게 할 수 있습니다. 이 방법은 예를 들어 숙주 프로테아제(protease)를 활성화함으로써 공정 개발을 효율화하고 제품의 안정성을 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 기존의 프로테아제에 쉽게 적용할 수 있으며, 다양한 표적 단백질에 빠르게 적응시킬 수 있다는 점입니다. 실험 절차의 시연은 제 연구실의 석사 과정 학생인 Hannah Gruchow가 진행하겠습니다. 숙주 세포 단백질을 열 침전시키는 과정입니다.

예를 들어 담배 잎을 사용합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 담배 식물을 배양한 후, 단열 폴리스티렌 폼 버킷에 8 L 작업 용량의 수조를 준비합니다. 전체 장치를 마그네틱 교반기 위에 올리고, 수조에 마그네틱 바를 넣습니다.

그 다음 교반자를 nonmagnetic 지지 타일로 둘러싸되, 타일이 교반자보다 약 1cm 정도 높게 위치하도록 합니다. 이 타일 위에 나중에 실험 과정 중 폴리프로필렌 바스켓을 놓게 됩니다. 워터배스에 8L의 완충액을 추가합니다.

그 다음 23 by 23 by 23 centimeter 크기의 폴리프로필렌 바스켓을 지지 타일 위에 놓습니다. 이때 지지대가 교반자의 회전을 방해하지 않는지, 그리고 바스켓이 액체에 완전히 잠겼는지 확인합니다. 그런 다음 바스켓을 꺼냅니다.

조절 가능한 온도 조절기를 사용하여 항온수조의 온도를 70 °C로 맞춥니다. 설정 온도에 도달한 후, 전체 장치가 열평형 상태에 도달할 수 있도록 최소 15분 동안 기다립니다. 그런 다음, 담배 잎에서 150 g의 분취량을 준비합니다.

잎에 되돌릴 수 없는 압착이나 찢어짐과 같은 손상이 가지 않도록 주의하며 분주액 하나를 바스켓에 넣습니다. 바스켓을 뜨거운 액체에 조심스럽게 그러나 빠르게 담근 후 지지 타일 위에 놓습니다.

그 다음, 잎이 뜨는 것을 방지하기 위해 바스켓 위에 스테인리스 스틸 블록을 올립니다. 블랜칭 액에서 잎을 5분 동안 배양합니다. 또는 실험 설계에 적합한 시간을 선택하십시오.

전체 배양 기간 동안 액체 온도를 모니터링하십시오. 배양이 끝나면 블랜칭 액에서 바스켓을 조심스럽게 꺼내어 잎의 물기를 30초 동안 제거합니다. 그런 다음 바스켓에서 식물 잎을 꺼내 블렌더로 옮기고, 텍스트 프로토콜에 따라 즉시 추출을 시작하십시오.

교반 용기 내의 침전된 HCP를 가열합니다. 항온수조를 마그네틱 교반기 위에 올리고, 용기의 중심이 교반기의 중심과 일치하도록 2L 스테인리스 스틸 용기를 항온수조에 넣습니다. 스테인리스 스틸 용기에 마그네틱 바를 넣습니다.

추출 버퍼로 용기를 채웁니다. 그런 다음 탈이온수로 채웁니다. 스테인리스강 용기의 상단 가장자리에서 5 cm 아래까지 워터배스를 채웁니다.

폴리스티렌 폼 뚜껑으로 이를 덮습니다. 다음으로, 뚜껑의 구멍을 통해 스테인리스 스틸 용기에 온도계를 삽입합니다. 그런 다음 항온수조의 온도를 78 °C로 설정하고, 열평형에 도달하도록 전체 장치를 15분 동안 배양합니다.

장치가 평형 상태에 도달하면 용기를 비우고, 용기가 여전히 항온수조 안에 있는 동안 300 milliliters의 추출액을 붓고 타이머를 시작하십시오. 5분 동안 배양하는 동안 추출액을 150 rpm으로 교반하십시오. 배양 기간 중 추출액의 온도가 최소 2분 동안 70 degrees Celsius에 도달하도록 하십시오.

배양이 끝나면 마그네틱 교반기에서 항온수조를 제거합니다. 스테인리스 스틸 용기를 꺼내 얼음물이 담긴 버킷에 넣습니다. 그런 다음 버킷을 교반판 위에 올립니다.

식물 균질액이 150 rpm에서 충분히 교반되도록 하십시오. 온도계를 추출액에 넣고 온도가 20 °C 또는 지정된 온도에 도달할 때까지 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 작동 용량이 8 L인 수조 두 개를 준비한 후, 탈이온수로 첫 번째 수조를 채우십시오.

온도 조절기를 74.5 °C로 설정하고, 열평형에 도달할 때까지 어셈블리를 15분 동안 배양하십시오. 0.5 L 플라스틱 비커를 1 L 플라스틱 비커 안에 넣어 단열 보관 용기를 준비합니다. 그리고 틈새를 채우기 위해 탈지면과 같은 절연 재료를 사용하십시오.

LS24 튜빙을 사용하여 열교환기의 한쪽 끝을 연동 펌프에 연결하고, 다른 쪽 끝을 배출 호스에 연결합니다. 두 튜빙 끝부분을 온도계와 함께 단열 보관 용기에 넣습니다. 그리고 추출 버퍼 300 millimeters를 채웁니다.

다음으로, 열교환기를 온수조에 넣고 연동 펌프를 300 milliliters per minute의 속도로 가동합니다. 3분 후, 용기 내의 결과 온도가 70 °C인지 확인하십시오. 이는 온수조의 설정 온도보다 약 4.5 °C 낮은 온도입니다.

보온 용기에서 추출 버퍼를 버리고, 식물 추출물을 300 mL씩 분주하여 준비합니다. 그런 다음 분주된 추출물 하나로 보온 용기를 채웁니다. 이제 열교환기를 통해 식물 추출물을 분당 300 mL의 속도로 5분 동안 펌핑합니다.

그 다음, 3분 후에 추출물 온도가 70 °C가 되었는지 확인하거나 실험 설계에서 정한 온도와 일치하는지 확인하십시오. 5분 후, 열교환기를 얼음 냉수욕으로 옮깁니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 추출물의 온도가 30 °C 미만인지 확인하십시오.

연동 펌프에 연결된 유입 호스를 단열 용기에서 제거하십시오. 그리고 열교환기 내에 남아 있는 열침전 식물 추출물을 수집하기 위해 펌핑을 계속하십시오. 그 후 펌프를 정지시키십시오.

식물 추출물의 백 필터(bag filtration)를 수행하려면, 필터 하우징에 장착된 해당 지지 바스켓에 백 필터를 설치하십시오. 바스켓 아래에 1L 용기를 놓고, 추출물 분취액을 분당 150mL의 속도로 백에 주입하십시오. 여과 후, 탁도계를 사용하여 추출 버퍼로 1:10로 희석한 여과액의 탁도를 측정하십시오.

1 mL의 샘플을 분취하여 백 여과물을 처리합니다. 예를 들어, depth filtration 및 크로마토그래피를 통해 처리합니다. 이후 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 추가로 분석합니다.

블랜칭(blanching)을 통한 숙주 세포 단백질의 열 침전은 총 가용성 단백질(TSP)을 96 ± 1% 감소시켰습니다. 블랜칭을 통해 DsRed의 최대 83 ± 1%와 Vax8 표적 단백질의 51%를 회수하였으며, 이를 통해 크로마토그래피 분리 전 순도를 0.1%에서 1.2%로 높였습니다.

블랜칭 온도가 63 °C보다 높을 때 필터 용량이 감소했습니다. 이는 단백질 추출 후 응집제를 첨가하고 백 필터링(bag filtration) 후에 여과 조제(filter aids)를 추가함으로써 해결할 수 있습니다. 열 침전용 교반 용기는 최대 84 ± 1%의 HCP를 제거했습니다.

Vax8의 경우 0.33 ± 0.02%, DsRed의 경우 20.2 ± 1.4%의 순도를 달성하였다. 블랜칭 및 열교환기 설정과 대조적으로, 용기 내에서의 HCP 침전은 후속 공정인 depth filtration의 용량을 2.5배 증가시킨다. 이는 열교환기를 통해 추출액을 펌핑하거나 블랜칭 후 균질화하는 것보다 용기 내에서의 전단력이 더 낮음을 반영한다.

60에서 70 °C 사이의 열교환기를 사용하여 추출물로부터 HCP 함량의 약 88.3 ± 0.7%가 일관되게 제거되었습니다. Vax8의 경우 0.31 ± 0.01%, DsRed의 경우 27.6 ± 2.0%의 순도를 달성하였습니다.

마지막으로, 열교환기는 하류-단 깊이 필터 용량이 가장 낮게 나타났습니다. 폐쇄 전까지 단 13.5 ± 6.0 L/m²만 정제되었습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면, 샘플 준비 시간을 제외하고 50분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 방법을 시도할 때는 표적 단백질이 열에 안정적인지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 제품을 필요한 수준까지 추가로 정제하기 위해 크로마토그래피와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 식물 분야의 연구자들은 백신 후보 단백질 및 nicotiana 종의 정제를 탐구할 수 있는 기술적 토대를 마련하게 되었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 블랜칭, 교반 용기 또는 열교환기를 사용하여 식물 숙주 세포 단백질을 침전시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.