자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제

이 개념적 방법의 전반적인 목표는 실험적 자가면역 뇌척수염에 대한 약리학적 치료가 면역 세포 침투의 맹공격 중 또는 면역 세포 침투 억제의 결과로 중추 신경계 보호를 입증하는지 여부를 결정하는 것입니다. 이 방법은 신경 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, EAE 치료 시간을 조작하는 것이 면역 세포 침투와 보호에 미치는 영향을 어떻게 구별합니까?

이 기술의 의미는 현재 이 질병에 대한 신경 보호 치료법이 없기 때문에 다발성 경화증 치료에도 확장됩니다. EAE 마우스에게 Xc-transporter 시스템의 억제제를 투여하는 것이 신경 보호 및 면역 조절이라는 사실을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 이 방법은 약물 치료를 연구하는 데 사용할 수 있지만 EAE 또는 기타 조작을 받은 유전자 녹아웃 마우스를 사용하는 연구에도 적용할 수 있습니다.

멸균 가위를 사용하여 개별 동물의 뇌와 척수를 작은 조각으로 다지는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 조직당 3밀리리터 주사기 플런저 하나를 사용하여 각 샘플을 개별 70미크론 세포 스트레이너를 통해 개별 50ml 원뿔형 튜브로 으깨고 배지로 스트레이너를 헹굽니다. 모든 조각이 침식되면 새 배지로 튜브의 최종 부피를 최대 50ml까지 가져온 다음 세포 현탁액을 원심분리합니다.

각 펠릿을 40% 밀도 구배 용액 4ml에 재현탁합니다. 그런 다음 튜브당 2밀리리터의 70% 밀도 구배 용액 위에 개별 15ml 원뿔형 튜브의 벽을 따라 세포를 천천히 층을 이룹니다. 원심분리로 세포를 분리하고 1밀리리터 전사 피펫을 사용하여 상부 미엘린 층을 조심스럽게 버립니다.

다음으로, 시료 계면의 생존 가능한 세포를 새로운 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브당 15ml의 새로운 배지의 최종 부피로 세포를 세척합니다. 펠릿을 200마이크로리터의 신선한 배지에 재현탁시키고 세포 현탁액을 96웰 원형 바닥 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 플레이트를 원심분리하고 상층액을 튕겨냅니다.

그런 다음 펠릿을 200마이크로리터의 복원 배지에 재현탁시키고 세포를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 다시 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 2%FCS가 보충된 200마이크로리터의 PBS로 세포를 세척하고 2%FCS와 FC-블록이 보충된 200마이크로리터의 PBS에 세포를 얼음 위에서 10-15분 동안 재현탁합니다.

배양이 끝나면 방금 시연한 대로 세포를 세척하고 펠릿을 15마이크로리터의 세포 표면 염색 칵테일에 얼음에서 15분 동안 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 스핀 다운하고 200 마이크로 리터의 PBS에서 샘플을 두 번 세척합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 FOXP3 전사 인자 염색 시약의 세포를 섭씨 4도에서 30분에서 하룻밤 동안 재현탁합니다.

배양이 끝나면 150마이크로리터의 투과화 완충액으로 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포를 원심분리하고 얼음 위의 15마이크로리터의 투과화 완충액에 관심 있는 세포 내 항체의 펠릿을 재현탁합니다. 30분 후, 세포를 스핀다운한 다음 200마이크로리터의 투과화 완충액을 3회 세척합니다.

마지막 세척 후 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고 살아있는 CD4 양성, TCR 베타 양성 세포에 게이팅하여 유세포 분석으로 샘플을 분석합니다. 또한 말초 T 세포의 증식을 평가하는 것도 중요한데, 말초의 변화는 면역 세포가 중추신경계로 침투하는 데 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. EAE 유도 후 척수 조직 샘플에 존재하는 성상세포와 신경교세포의 수를 정량화하려면 4배 배율로 각 절편의 이미지를 얻고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.

그런 다음 ImageJ에서 관심 있는 이미지를 선택하고 다각형 선택 도구를 사용하여 전체 척추 조직 단면을 추적합니다. 이미지 메뉴에서 유형 및 16비트를 선택하여 이미지를 16비트로 변환합니다. 그런 다음 프로세스 메뉴를 열고 주제 배경을 선택하여 구르는 공 반경을 배경의 일부가 아닌 가장 큰 개체의 크기 이상으로 설정합니다.

슬라이딩 포물면을 확인하고 OK(확인)를 클릭합니다. 그런 다음 이미지에서 조정 및 임계값을 선택하고 슬라이딩 막대를 사용하여 더 낮은 임계값 수준을 설정합니다. 선택한 영역 내에서 임계값이 설정된 영역의 백분율을 얻으려면 analyze and set measurements(분석 및 측정 설정)에서 area fraction(면적 분율)을 선택합니다. Limit to Threshold(임계값 한계)가 선택 취소되어 있고 디스플레이 레이블(Display label)이 선택되어 있는지 확인한 다음 OK.To 클릭하여 측정값을 구하고 analyze(분석)에서 measure(측정)를 선택합니다.

결과 팝업 상자가 나타납니다. 이 데이터를 저장하고 처리 그룹 간의 면적 분율 값을 비교합니다. 광학 밀도에 의한 미엘린 염기성 염색을 정량화하려면 관심 이미지를 열고 다각형 단면 도구를 사용하여 샘플 내에서 관심 영역을 그립니다.

analyze and set measurements(분석 및 측정 설정)에서 mean gray value(평균 회색 값)를 선택하고 Limit to threshold(임계값 제한)가 선택 취소되어 있고 해당 디스플레이 레이블이 선택되어 있는지 확인합니다. 확인을 클릭합니다. 그런 다음 분석 메뉴에서 측정을 선택합니다. myelin basic protein mean gray value 데이터가 포함된 새로운 결과 팝업 상자가 나타납니다.

척수 제거 및 유세포 분석을 통해 중추 신경계 면역 세포 침투를 평가할 수 있으며, 질병이 최고조에 달했을 때 면역 세포 침투가 최대입니다. CD4 양성, 인터페론 감마 양성, IL-17 양성 및 FOXP3 양성 세포 수에 대한 통계적 분석을 통해 CD4 양성 침투 T 세포 수와 대조 동물의 CD4 양성 침투 T 세포 수에서 관찰된 변화의 중요성을 밝힐 수 있으며, CD4 양성 침투 T 세포 수의 전반적인 감소에 대한 교란 요인인 왜곡을 배제하는 데 필수적인 심층적인 동시 발현 분석이 필수적입니다. T 세포에 침투하는 중추 신경계의 감소가 말초의 증식, 활성화 및 분화를 억제하는 결과일 가능성을 제거하기 위해 활발하게 증식하는 T 세포의 수와 T 세포 아형의 비율을 평가할 수 있습니다.

미엘린 무결성의 정량적 평가를 위해 미엘린 염기성 단백질 염색의 광학 밀도에 대한 통계적 분석을 수행할 수 있으며, 예를 들어 야생형 깔짚과 비교하여 상세불명의 유전자 녹아웃 동물에서 척수 조직의 상당한 탈수초화를 밝힐 수 있습니다. 신경염증이 치료적 개입에 의해 지속되거나 감소한다는 것을 더욱 입증하기 위해, 방금 설명한 바와 같이 반응성 신경교증에 대한 평균 분획 면적을 측정하여 반응성 신경교증을 평가할 수도 있습니다. 유세포 분석 기법은 제대로 수행되면 2일 내에 완료할 수 있으며, 조직 염색의 정량화는 염색당 약 2시간 내에 수행할 수 있습니다.

면역조절은 면역세포가 침투하기 전에 치료법을 도입하여 T세포의 이동 및 증식 변화를 정량화하여 평가할 수 있습니다. 면역 세포가 이미 CNS에 침투한 질병이 최고조에 달했을 때 치료법을 도입하여 CNS 보호를 평가할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포 염색의 특정 강조 표시에 대해서만 ImageJ에서 최적의 임계값 설정을 평가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 중추신경계, T세포 증식 및 이동 반응에 대한 특정 치료법의 효과를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 면역 세포 침투 전후의 치료 시간을 변경합니다.