Name: 자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 학습하세요 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스 모델에서 약물 치료가 중추신경계 보호와 면역 세포 침윤 억제를 통해 작용하는지 구별하는 방법을. 이 기술은 다발성 경화증 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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일반 기금 기금, 국가 -이 작품은, 국립 다발성 경화증 SocietyRG 4587-A-1 Civitan 국제 학술 진흥 재단, 마이크 L. Jezdimir 횡단 성 척수염 재단, 알라바마 보건 서비스 재단의 대학 NINDS P30-NS069324에 의해 투자되었다 국립 알레르기 연구소 감염증, 건강의 국립 연구소에서 과학 재단 1,355,183 및 T32 AI007051.

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저자는 공개 아무것도 없어.

MS 환자는 CNS로 T 세포 활성화 및 / 또는 침투를 감쇠 약물 복용 직접 CNS 보호 치료법의 개발을 정당화하는 동안 질병의 재발을 경험하는 것을 계속한다. EAE는 고전 MS의 현상을 모델링하기 위해 사용되었고, 생체 내에서의 면역 시스템 및 CNS의 상호 작용의 특성을 연구 할 때 강력한 도구가 될 수있다. 주변부에서 면역 세포 상기 CNS의 침투 및 확산 및 활성화를 검사와 함께 전 또는 질병의 개시 후 치료 EAE의 고려, 예를 들어, 타이밍을 사용하여, 면역 체계 모두에서 치료 효과를 서술 할 수있다 중추 신경계. C57BL / 6 마​​우스에 EAE이 널리 이용되고 있지만 이러한 마우스는 실질의 재발 송금 표현형 및 면역 세포의 침윤이 같이 SJL 마우스에 EAE는 MS의 대부분의 경우 더 많은 대표 될 수있다뇌 10. SJL 마우스는 질병이 제시 한 후에는 가능한 치료를 시작하고 있지만 감소 염증의 시간 동안,뿐만 아니라 사함을하는 동안 분명 복구가 있습니다. SJL 마우스는 항상 재발 및 결과를 풀링 할 때 잠재적으로 큰 변화의 결과로, 동시성에 송금하지 않도록 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 일부 연구자들은 질병의 진행에 개별 지점에서 FACS 분석 및 조직학을 위해 마우스를 복용하는 동안 한 동물에서 임상 점수에 대한 대표적인 결과를 표시하도록 선택할 수 있습니다. 조작이 치료는 면역 시스템 또는 중추 신경계에 영향을 미치는 방법의 결정에 도움을 줄 수 EAE 마우스에 대한 때 고려. 처리가 시작되면 많은 옵션 자체의 면역 세포가 CNS에 진입했는지에 대한 내포 방법 각각은은 CNS와 상호 작용 될 수있다. 증상의 발병하기 전에 치료는 면역 세포가 아직 입력 또는 중추 신경계에 손상을 발생하지 않은 것을 의미한다.증상의 발병 후 치료는 면역 세포가 중추 신경계를 입력 한 일부 손상의 원인이 있다는 것을 의미한다. SJL 마우스를 사용, 치료는 면역 세포가 활발하게 침투 및 염증을 유발하거나 면역 세포가 적은 염증으로 CNS에 널리 보급 될 수 사함, 동안되는 재발 동안 시작할 수 있습니다. 면역 세포 치료시 병적 과정에서 어디 고려할 때 치료법은 CNS 및 면역계에 미치는 영향에 관한 초기 가정이 이루어질 수있다. 치료는 면역 세포 및 CNS, EAE 증상의 중증도를 감소시키는 최종 결과 각각 영향을 미칠 수있는 여러 가지 방법이있다. 그러므로, 면역 세포가 CNS 입력 여부 외주와 CNS에 영향을 받는지 면역 세포 보는 유세포 분석 및 면역 조직 화학 법을 사용하는 것이 필요하며, 중추 신경계 치료에 반응하는 방법. 척수의 유세포 분석은 얼마나 많은 셀 HA를 결정할 수 있지만주어진 시간에 CNS를 입력했습니다, 하나는 면역 세포의 증식이 비장에 영향을받지 않는 한이 효과가 감소 된 면역 세포 인신 매매에 의한 것을 확인할 수 없습니다. 이는 말초 및 CNS 조직을 분석하여 양쪽 조직을 비교할 때 기계적으로 의미하는 결과를 결정하는 것이 필요하다. 면역 세포 활성 프로파일이 조절 T 세포 무거운 프로필 병원성 헬퍼 T 세포 무거운 프로필 스위치를 갖는, 예를 들면, 처리에 의해 변경되는 것이 또한 가능하다. 다른 세포 유형의 마커를 찾고 치료 및 치료 동물 사이 %의 발현을 비교하는 따라서도 중요한 고려 사항이다. MS 연구 신흥 개념은 B 세포가자가 면역 탈수 초에서 중요한 역할을한다는 것을 암시한다. 이것은 B 세포는 T 세포 (20)의 활성화에 필요한 것을 보여주는 연구에 기초한다. 이 개념은 예 리툭시 맵, CD20의 예에 대한 항체와 같은 치료의 성공에 의해지지된다B 세포 (21, 22)의 표면에 가압. 임상 시험에 모노클로 날 항체 ocrelizumab의 성공에 의해 입증 된 바와 같이, CD20의 다른 에피토프를 표적 약물은 B 세포 치료제 타겟 (23)의 효과를 향상시킬 수있다. 여기에 제시된 기술의 한 가지 제한은 면역 세포가 CNS를 입력하지만 실질 여행 할 수 없게하는 것이 가능하다는 것이다. 면역 취급과 미처리 동물 사이에서 실질 이동 거리를 면역 세포의 혈관 주위있는 절삭을 검출하고 평가하기 위해 사용될 수있다. 또 다른 잠재적 인 한계가 EAE 병인의 마이크로 바이의 효과를 포함한다. 공생 장내 미생물은 크게 질병 발병 (24)에 영향을 미칠 수있다; 따라서, 마우스는 다른 식민지에 보관, 심지어 다른 우리에서 질환의 중증도에 광대 한 차이가있을 수 있습니다. 동일한 케이스에서 발생 한배 새끼 컨트롤을 사용 가능한 따라서, 항상 바람직EAE를 포함하는 실험. 마지막 주는 주변의 면역 세포 증식의 변화의 영향을 제거하기 위해 실험적으로 바람직한 경우, 패시브 전사 유도하기보다는,이 프로토콜에 기재된 활성 유도를 이용하여이를 수행 할 수있을 수 있다는 것이다. 신경에 대한 확인은 또한 세포 사멸 또는 선택적 세포 유형에 단백질의 결실을 허용 조건부 녹아웃 마우스의 사용을 통해 특정 메커니즘을 테스트하기 위해 공존 배양 시스템 (11)을 사용하여 달성 될 수있다. 또한, 신경 있습니다 약리 에이전트의 탐사를 확장, 축삭 절개 및 신경 세포의 죽음의 표식이 포함되어야한다. 중요성의 또 다른 영역은 재유 수화입니다. 부상 축삭은 신경 치료가 재유 수화 치료의 중요한 부분이되어야 추가 지원 대출 remyelinate 할 수 없습니다. 또한, 수초 축삭은 myelina보다 부상에 더 취약테드의 축삭. 이것은 축삭이 축삭 손상을 방지 할 적절한 재유 수화를 촉진 탈수 초 치료 적 개입이되면 제안합니다. 이 도로를 탐색하려면, 탈수 초화 및 재유 수화 다른 생체 내 모델 (즉, cuprizone 및 리소 레시틴)을 사용할 수있다. 이 방법은 본원에서 미엘린 손실을 정량함으로써 신경 평가에 초점을 설명한다. 재유 수화 평가 선조 세포의 수뿐만 아니라, 증식과 같은 조사하는 것이 중요 할 것이다 성숙 그들의 능력. 이러한 대안 모델의 언급으로, 사람은 급속도로 매개되는 뇌염의 다른 모델을 고려해야합니다. 미엘린 손실을 생성 두 잘 특성화 RNA 바이러스 모델이있다 : 하나는 Theiler의 쥐 뇌척수염 비 포위 Picornaviridae 바이러스이고, 다른 하나는 마우스 간염 바이러스의 Coronaviridae 바이러스 군 (25, 26)의 일원이다. EAE는 일을위한 유용한 도구입니다조작 또는 치료가 면역 체계와 생체 내에서 중추 신경계에 영향을 미치는 방법의 udies. 치료는 질병 과정에 영향을 미치는 곳은 혈액 - 뇌 장벽에서 또는 CNS에서 주위에 있는지 여부를 결정하는 데 도움 여기에 설명 된 프로토콜. MS에 대한 현재의 치료는 질환 및 환자의 시간에 종종 경험 하락을 치료하지 않습니다. 마찬가지로, 급성 파종 성 뇌척수염, 횡단 성 척수염 및 시신경 척수염,이 면역 세포에 침투하여 공격 바로 아래로 CNS를 보호 부족​​ 치료를 포함하는 면역 세포의 중추 신경계에 침투와 수초의 분해를 포함하는 다른 질병. 고려 처리의 타이밍을 촬영 및 치료에 대하여 이루어져야 기계적 결정을 허용한다 염증 손상을 평가하기 위해 CNS의 면역과 관련하여 유세포 분석 비장 및 척수를 사용.

다발성 경화증 (MS)는 주로 초기에 질병에있는 뇌의 백질 지역에서 염증성 병변을 특징으로한다. 장기간의 진행 후, 회백질 위축은 MRI 영상 검출 및 신경 퇴행성 질환의 위상을 표시한다. 반응성 신경교 증, 탈수 초화 및 백질의 축삭 손상은 CNS-침투 면역 세포에 기인한다. 현재 CNS의 신경 퇴행을 예방 직접 역방향 또는 MS에서 사용되는 치료 없음 - 대신, CNS로 T 세포 활성화 및 / 또는 침투를 감쇠하여 염증을 감소하지 않는다. 이 MS에 대한 치료는없고 현재 치료를 사용하여 환자가 질병의 진행을 계속 발생하기 때문에, 탈수 초화 및 신경 세포 손실을 방지 약물의 발견은 매우 중요하다. 즉, CNS에 감소 손상이 - -의 S 보이는 그러나, 면역 세포에 작용 및 CNS에 그 구별하는 결과로, 실험적으로 어려울 수 있습니다에 관계없이 발생되는 메커니즘의 AME. 따라서, CNS 보호의 평가는 질병 메커니즘에 미치는 영향 약리 에이전트를 결정하기 위해 주변에 면역 세포와 면역 세포의 증식을 CNS는-침투의 평가와 협력해야합니다. 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 현재 MS 1-4 치료 용 약물의 발견에 대한 직접 책임 염증성자가 면역 질환의 잘 확립 된 동물 모델이다. 마우스는 종종 C57BL / 6 마​​우스는 유전자 변이체의 가용성에 따라 인기 균주 인 상태 EAE 사용된다. EAE로 유도 C57BL / 6 마​​우스는 10 일 후 유도 주위에 발병 만성 질병의 진행을 나타낸다. 척수 실질 및 소뇌 피질 침투 실질 5 침윤의 유무,이 동물의 조직 병리학 적 특성이다. ㄴ에서 또한 대뇌 피질의 병변 및 탈수 초화비는 C57BL / 6 마우스에서 상대적으로 결석 질환 6-9의 특징이다. 재발 완화 성 질환 및 MS (10)에서 나타나는 것과 유사한 뇌와 척수 모두에서 발견되는 병소가 SJL 마우스를 사용할 때 가능 따라서 바람직하다. 면역 세포는 CNS에 도달하지 않을 경우, 치료는 신경 세포로 분류 될 수 없다. 따라서,이 프로토콜은 이전에 11 있듯이 뇌, 척수 및 EAE 마우스에서 비장의 유세포 분석의 사용은, 면역 세포 상기 CNS에 침입하여 주변의 면역 세포의 증식에 대한 치료 효과를 확인 할 수있다. 범위와 신경의 성격을 결정하는 CNS 조직의 면역 조직 화학적 분석도 설명한다. 이들 방법을 조합하면 CNS 였는지 PR 면역 세포가 활성화 된 면역 세포가 CNS 입력 여부를 주변에 확산되었는지 여부의 판정이 가능하고,염증이나 손상 otected. 신경 보호 효과가 면역 체계에 영향에도 불구하고 의심되는 경우, 실험자는 CNS가 발생한으로 치료가 면역 세포의 침윤 후 시작 시간을 변경할 수 있습니다. 여기서는 활성 EAE, MS의 T 세포 매개 된 동물 모델의 서로 다른 모델들을 사용하는 프로토콜을 제공하고, 다른 측면에 실험 요법의 효능을 결정하는 질병 중 다양한 시간 점에서 면역 조직 화학 결합 분석 유동 세포 계측법 MS의 발병 기전. 이 방법은 면역 세포 증식 및 CNS 보호 대 침투에 영향을 구별 약물이 질병의 발병 기전에 작용하는 방법을 쉽게 좁힐 만드는 연구를 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>22 x 22 x 20 mm 임베딩 몰</td>드 <td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td><td></td></tr><tr><td>22 x 30 x 20 mm 임베딩 몰</td><td>드 Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올 (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-메틸부탄</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 mm 임베딩 몰</td><td>드 Fisher Scientific</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td>품질 생물학적</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552775</td><td>0.2 mg/ml 원료 농도</td></tr><tr><td>anti-Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0.5 mg/ml 원료 농도</td></tr><tr><td>anti-GFAP (Cocktail)</td><td>Biolegend</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg/ml 원료 농도</td></tr><tr><td>항-IBA-1 폴리클론 항체 (50 &#181; g)</td> <td>Wako</td><td>019-19741</td><td>0.5 mg / ml 재고 농도</td></tr><tr><td>안티 IFN -&감마; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0.2 mg/ml 재고 농도</td></tr><tr><td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0.2 mg/ml 재고 농도</td></tr><tr><td>anti-Ki-67 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0.2 mg/ml 재고 농도</td></tr><tr><td>anti-MBP (D-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0.2 mg/ml 재고 농도</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0.5 mg/ml 재고 농도</td></tr><tr><td>항-TCR&베타; PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>0.2 mg/ml 재고 농도</td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-1000</td><td>1.5 mg/ml 재고 농도</td></tr><tr><td>Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000&nbsp;</td><td>1.5 mg/ml 원료 농도</td></tr><tr><td>구연산, 무수, 99.5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 테트라소듐염 이수화물, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446085000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드, 10개의</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>골지체 케이스 플러그</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>단백질 수송 억제제</td></tr><tr><td>Immedge 소수성 배리어 펜</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>EMD Millipore</td><td>407952-5mg</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Near IR Live/Dead 염색 키트</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td>생존력 염료</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>일반 말 혈청</td><td>Vector Labs</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 96%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0891-01</td><td>밀도 구배</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td>수지 장착 매체</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>정제 항 미엘린 염기성 단백질 항체</td><td>BioLegend</td><td>808401</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT 화합물</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>비이온 세제</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit (Standard)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9206402</td><td>avidin-biotin-peroxidase&nbsp; 면역페록시다제의 복합체(ABC);</td></tr><tr><td>Vector Laboratories 과산화효소 기질 키트(DAB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9276270</td><td>DAB 솔루션</td></tr></tbody></table>

자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 cns 보호 대 결정 면역 시스템 억제

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

자가면역 탈수초성 질환인 다발성 경화증(MS)의 주요 특징은 면역 세포가 뇌와 척수에 침투하여 미엘린이 파괴되어 신경 자극의 전도가 느려질 뿐만 아니라 축삭 손상을 일으켜 운동 및 인지 기능 저하를 초래하는 것입니다. 현재 다발성 경화증 치료법은 면역 세포가 중추신경계(CNS)로 침투하는 것을 약화시키는 데 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 치료법은 재발 횟수를 줄여 삶의 질을 향상시키지만, 재발을 완전히 없애지는 못하므로 장기적인 장애는 개선되지 않습니다. 따라서 CNS를 보호하는 치료제가 필요합니다. 인간 다발성경화증 환자뿐만 아니라 동물 모델 모두에서, T 세포가 중추신경계로 진입하는 것은 일반적으로 염증을 유발하는 것으로 간주됩니다. 약물이 중추신경계(CNS)를 보호하는지 평가하기 위해서는 면역 세포의 침투 또는 말초의 증식에 대한 잠재적 영향을 배제해야 합니다. 이 프로토콜은 약물 개입 후 관찰된 중추신경계 보호가 중추신경계 침투 면역 세포를 약화시키거나 염증성 모욕 중 중추신경계 세포의 사멸을 차단한 결과인지 여부를 결정하는 방법을 설명합니다. 염증성 발작 중에 중추신경계(CNS)를 보호하는 다발성경화증 치료법을 검사하는 능력은 현재의 치료법이 재발(즉, 면역 세포 침윤)을 줄이기는 하지만 완전히 제거하지는 못하여 중추신경계가 변성에 취약하기 때문에 치료 전략의 발전에 매우 중요합니다.

여기, 우리는 약리 에이전트에 의해 CNS 보호를 제공하는 경우 이해 EAE의 두 가지 모델을 사용하거나 CNS-침투 T 세포를 약화 또는 염증 면역 세포의 침윤의 공격 동안 수초와 축삭 손상을 방지 할 수있다. 면역 세포의 침윤과 질병의 병리는 주로 척수 (그림 1A)에서의 위치 치료제가 척수에 면역 세포 침투를 방지 있는지 확인하려면, 만성 EAE의 C57BL / 6 마우스 모델을 사용한다. 치료 약물이 CNS, 뇌와 척수 (그림 1B) 모두에서 질병의 병리를 보여줍니다 사용되는 재발 - 완화 성 EAE의 SJL 동물 모델에 면역 세포의 침입 동안 CNS 보호 기능을 제공하는지 확인합니다. 임상 평가 관련 임상 평가는 일반적인 내용은 다음 루 브릭 (그림 1 항에 만들어진C) 또는 비정형 (그림 1D) EAE. 전형적인 임상 질환의 경우, 0의 점수는 더 이상 동작하지 않습니다. 꼬리의 기지에 의해 선택하면, 꼬리는 (많이 로터 등) 빠르게 회전 할 수 있으며, 뒷다리는 벌리됩니다. 하나의 임상 점수는 꼬리의 기부에서 마우스를 해제함으로써 결정될 수있다 부분적 림프 테일이다. 정상 헬리콥터와 같은 회전 약화 또는 부재, 및 꼬리의 부분을 완전히 림프 일 수있다. 꼬리 마비의 정도를 결정하기위한 유용한 방법은 부분적으로 마비 꼬리 그렇게 할 수없는 것 중에 unparalyzed 꼬리는 일반적으로 손가락의 주위에 말려있는 바와 같이, 꼬리의 길이를 하나의 손가락을 실행하는 것이다. (2)의 임상 점수는 완전히 마비 꼬리를 나타냅니다. 꼬리의 기지에서 마우스를 위로 따기 때 꼬리의 어떤 움직임이 전혀 발생하지 않는다. (3)의 임상 점수는 부분 뒷다리 마비를 나타냅니다. 이 점수의 결정은 마​​우스가 FLA에 자유롭게 이동할 수 있어야합니다t면. 하나 뒷다리 드래그하면 마우스가 전진으로, 또는 하나 또는 두 개의 뒷다리 일부가 마비 된 것으로 나타나면 (3)의 점을들 수있다. (4)의 임상 점수는 완전한 뒷다리 마비를 나타냅니다. 이 점수로, 마우스는 뒷다리를 이동 할 수 없습니다 및 전면 사지를 사용하여 자신을 앞으로 끌어 것입니다. (5)의 임상 점수는 죽어가는 마우스를, 또는 어려움 마우스는 케이지이나 호흡을 통해 자신을 이동. 마우스가 케이지의 하단 또는 호흡이 곤란하면 자체를 드래그 할 수없는 경우, 마우스는 인도적 안락사되어야한다. (6)의 임상 점수는 새장에서 죽은 마우스를 나타냅니다. 6의 점수는 특이하고 EAE 이외의 사망 원인을 조사해야한다. 비정형 임상 질환 수도 있고 마비를 동반 할 수 없습니다. 마우스는 전형적인 질병 플러스 전형적인 증상을 제시하는 경우는 두 개의 분리 된 채점 시스템을 포함 할 필요가있다. 0의 점수는 더 이상 행동하는 없다전형적인 채점 시스템들. 마우스는 산책하는 동안 하나의 임상 점수는 약간의 머리 회전 또는 기울기를 나타냅니다. 이것은 마우스가 앞으로 걸어 있도록 그 움직임에 일정한 좌우 방향성을 관찰함으로써 결정될 수있다. (2)의 임상 점수는 더 두드러 머리 회전과 가난한 복원력 능력을 나타냅니다. (1)의 전형적인 점수와 마찬가지로, 마우스의 움직임에 방향성을 가지고 있으며, 균형 약간의 어려움이있을 수 있습니다. (3)의 임상 점수는 직선으로 걷는 무능력을 나타냅니다. 마우스 어려움 균형을 가질 것이다하고 산책으로 오른쪽 자체 있도록 카의 측면을 사용할 수있다. (4)의 임상 점수로 인해 균형 문제로 걸을 수없는 옆에 누워 마우스를 나타냅니다. 마우스는 케이지의 하단에 자신을 드래그 할 수 있습니다 만, 그 움직임에 방향성을 가질 수있다. 지원하지 않는 5의 임상 점수는 연속 압연을 나타냅니다. 이 점수에 도달 마우스는 인도적 안락사되어야한다. 병원6의 알 점수는 새장에서 죽은 마우스를 나타냅니다. 6의 점수는 특이하고 EAE 이외의 사망 원인을 조사해야한다. 이 마우스의 상태 변화 약간 경우 또는 두 점수 사이에 선택하는 것이 어려운 경우 점수에 0.5을 추가, 예를 들어, 점수, &quot;사이 -&quot;를 허용 할 필요가있다. 예를 들어, 시작하는 마우스는 정상 대응보다 느리게 이동하지만 마비, 0.5의 점수를받을 수 있습니다 꼬리에 의해 획득시 그 다리를 플레잉하는 대신 앞과 뒷 발을​​ 걸쇠 마우스를 표시 없습니다 . 단지 케이지의 하단에 자신을 끌어 3.5의 점수를받을 수 있습니다 주기적으로 또는 때 감동의 뒷다리를 트 할 수 있습니다 마우스. 면역 세포의 침윤의 감소를 평가 C57BL / 6 마우스 모델에서의 EAE (도 1A, 0 일), 항원의 유도 후 presentati비장 T 세포의 증식에 발생할 일 1 - 약 3 ~ 5 일 임상 점수 본 초기 면역 세포 침윤 마우스 후 7 일 주위 CNS로 면역 세포 침윤 하였다 5. 치료제가 척수로 면역 세포 침투를 차단하고 있는지를 평가하기 위해, 약물 또는 비히클은 비장에서 항원 제시 및 증식 후 7 일째에 도입하지만, 면역 세포를 척수로 침투하기 전에된다. 면역 세포 침윤이 약화 된 경우 임상 적 질병 과정 일에서 질병의 상승 단계 10 ~ 15 (도 2) 동안의 개선 된 임상 점수를 반영해야한다. 면역 세포 침윤의 감소는 감소 된 신경 염증이 발생할 것이다. 반응성 astrocytosis 및 microgliosis는 신경 염증 주요 특징으로 간주됩니다. 이바-1 GFAP 및 미세 아교 세포와 성상 세포 염색을하는 것은 다음 장을 평가하는데 사용될 수있다평균 면적 분율 염색의 ES는 신경 염증 (그림 3)를 정량화한다. 면역 세포의 침윤이 감소되어 있는지 확인하기 위해 척수를 제거하고 질병의 피크 (그림 1A, 약 하루 18)에서 유동 세포 계측법 분석을 위해 처리됩니다. 이 면역 세포의 가장 큰 수는 척수을 체결했다고 보장합니다. 중추 신경계에 대한 T 세포의 입구 개시 염증성 이벤트 간주 모두와 Th17받은 Th1 세포가 EAE의 동물 모델뿐만 아니라 MS 환자에서 발견된다. 종합적 유세포 분석은 병원성 T 세포의 두 가지 유형의 평가를 포함한다. 또한, Tregs는 질병을 저해 잘 특성화 억제 T 세포이다. 따라서, 총 CD4 + 집단에서 Tregs의 비율은 이펙터 T 세포 개체군의 백분율과 비교하여 평가한다. 이 경우 THER T 세포 침윤의 전반적인 감소가 발생했는지 여부를 나타내거나 것E는 CNS에서 T 세포 표현형의 스큐이다. 대표 점 플롯 (도 4a) 비히클 - 처리 된 마우스 (오른쪽 사분면 번호)로부터 척수 비해 약물 처리 된 마우스에서 척수에서 T 세포 침윤 CD4 +의 전체 개수의 감소를 보여준다. 각각 IFN-γ +, IL-17 + 및 Foxp3의 +, 및 (그림 4A)을 감소해야합니다받은 Th1, Th17, 그리고 TREG 세포 다음 서명 단백질이 평가를 알아보고자 하였다. 통계 분석은 현저한 감소 (도 4b)를 보여주기 위해 CD4 +, IFN-γ +, IL-17 + 및 Foxp3의 + 세포 수에 수행되어야한다. (및 Foxp3의 + 세포가 수행된다 -, IL-17 + IFN-γ - T 세포 하위 집합의 기울이기, IFN-γ + IL-17 +, IFN-γ + IL-17의 비율의 통계적 평가를 배제하려면 인터넷gure 4C). T 세포 CNS가 침윤 감소가 주변부에서 증식,​​ 활성화 및 분화를 억제하는 결과이다 가능성을 제거하기 위해, 적극적으로 T 세포 아형의 비율에 부가하여 T 세포 증식의 개수가 평가 될 필요가있다. 활성화 및 분화는 영향을받지 (그림 5A) 경우 어떤 CD4 +, IFN-γ +의 비율의 변화, IL-17 +, 또는 Foxp3의 +를 찾을 수 없습니다해야합니다. 확산 (그림 5B) 영향을받지 않는 경우 또한, 사료된다 + CD4 + 세포의 변화를 찾을 수 없습니다해야합니다. 약물 치료법은 7 일째에 도입 된 이후 주변에 초기 항원 제시 및 T 세포 활성화를 피하기 위해 변경. 그러나, 유전 적 모델 단백질은 종종 배아 동안 구조적으로 삭제 또는 비장 ASSE을 EAE의 유도 전 유도높은 중요성 ssment. CNS 보호 평가 특정 치료제는 면역 세포의 침윤 후 CNS 질병의 병리를 변조하는 경우 설명하기 위해, 약물 개입은 임상 질병 득점의 첫 번째 피크 기간 동안 투여해야한다. 이 마우스는 재발 완화 성 표현형을 나타내는 때문에 EAE의 SJL 모델이 실험 유리하다. 약물 치료가 수초 - 축삭 변성을 방지하는 경우, 임상 점수 향상 (그림 6)를 관찰한다. 수초의 병리학 적 평가는 개선 된 임상 점수와 일치 수초 손상의 감소를 확증해야합니다. 정량적으로 수초의 무결성, 미엘린 염기성 단백질의 DAB 염색을 평가하기 위해 (MBP)이 염색의 광학 밀도의 통계 분석 (그림 7) 다음에 수행된다. 또한 그 신경 염증을 입증하기 위해 지속 또는 therape에 의해 감소utic 개입 반응성 신경교 증이 (도 3) 상술 한 바와 같이 반응성 신경교 증에 대한 평균 면적 비율을 측정함으로써 평가 될 수있다. 치료 개입이 직접 면역 효과없이 CNS를 보호하고 있음을 확증하기 위해, 비장에서 면역 세포의 중추 신경계에 침투와 확산의 감쇠 할인해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 뇌 면역 세포 침윤 및 말초 T 세포의 증식 및 활성화의 평가 척수 평가 방법은 상기 한 바와 같이 수행되어야한다 (도 4 및도 5). 이와 함께, T 세포 나 주변의 T 세포 증식은 CNS 함침 감소의 증거로 CNS 세포 손상을 차단하는 치료제 CNS 보호 치료법이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig1.jpg" /> 그림 1. 대표 ResuC57BL / 6, SJL 마우스에 EAE에서 임상 점수의 LTS. (A) 임상 점수는 만성 질환으로 EAE를 생산하는 MOG 35-55로 유도 (N = 10) / 6 마우스 C57BL의 (± SEM을 의미). (B) 임상 점수는 재발 완화 성 EAE 병을 생산하는 PLP 139-151로 유도 SJL 마우스 (N = 3)의 (평균 ± SEM). (C) EAE 생쥐 일반적인 질병의 진행을 추적하는데 사용되는 임상 점수 섹션. (D) EAE 마우스의 전형적인 질병의 진행을 추적하는 데 사용되는 임상 채점 루 브릭. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig2.jpg" /> EAE와 C57BL / 6 마우스 그림 2. 약리 치료 이전에 면역에 세포의 침윤. </str옹&gt; C57BL / 6 마우스 MOG 35-55으로 7 일 postimmunization에서 PBS로 처리 (N = 20) 또는 SAS (N = 19)의 임상 점수 (± SEM을 의미). 데이터는 세 풀링 독립적 인 실험에서입니다. 통계적으로 유의 한 차이는, * P &lt;0.05 비모수 양측 맨 - 휘트니 U 테스트를 사용하여 측정 하였다. (11)로부터 허가를 재 인쇄 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig3.jpg" /> 그림 3. 면역 형광 염색 및 제어, EAE의 척수에서 반응성 신경교 증의 정량화 및 치료 C57BL / 6 마우스. (A) 제어의 척수에서 GFAP (성상 세포)와 이바-1 (미세 아교 세포)에 대한 형광 라벨 (면역화 PBS (중간 패널) 또는 SAS (오른쪽 패널)로 처리) 마우스 (왼쪽 패널)와 EAE 마우스. 스케일 바 = 100 μm의. 염색 정량 immunop 퍼센트를 측정 면적 분율 기법을 사용하여 측정 하였다GFAP (B)와 이바-1 (C)에 대한 ositive 영역입니다. , ± SEM을 의미 N = 3 컨트롤, N = 3 SAS가 처리 또는 n = 4 PBS 처리 된 마우스, 마우스 당 6 절. 통계적 차이는 일방 ANOVA를 사용하여 측정 하였다 * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001. 다시 인쇄 (11)의 허가와. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig4.jpg" /> EAE C57BL / 6 마우스 척수의 그림 4. 외과 분석. 처리 된 마우스에서 T 세포 침투를 감소 시연 C57BL / 6 마우스 EAE의 7 일 이내의 postinduction를 시작, SAS 또는 PBS로 처리 하였다. 척수가받은 Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) 표시 일 (15) (A) 대표 도트 플롯에 얻었다과 Th17을 (IFN-γ- / IL-17 +) CD4 + 게이트 (상단 패널)와 T 조절 세포 (Foxp3를 +) (하단 패널)에있는 세포. 도트 플롯은 오른쪽 상단 사분면의 비율을 보여줍니다. (B)의 절대 CD4 + 세포의 수뿐만 아니라, IFN-γ의 +, IL-17A +와 + Foxp3의 세포는 통계적으로 분석 하였다. (C) SAS- 및 PBS 처리 마우스 사이 EAE T 세포 개체군의 백분율에서의 변화도 관찰 하였다. 두 개의 독립적 인 실험에서 처리 SAS과 N = 9, ± SEM 평균, N = PBS 처리 10. 두 꼬리 t 테스트는 모든 막대 그래프에 사용되었다. ** P &lt;0.01. 다시 인쇄 (11)의 허가와. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig5.jpg" /> 그림 5. FACEAE C57BL / 6 마우스 비장의 S 분석 치료와 처리되지 않은 마우스에 상응하는 T 세포 발현 프로필 및 확산을 입증. PBS-및 SAS 처리 된 마우스의 비장은 EAE의 15 d 개 postinduction을 분석 하였다. (A) CD4 + T 세포의 백분율받은 Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) Th17 (IFN-γ - / IL-17 +) PBS-로부터 비장, 그리고 T 조절 세포 (Foxp3의 +) 처리 (N = 10)를 2 개의 독립적 인 실험으로부터 (N = 9) 마우스 SAS는 처리. (B, 왼쪽 패널) 순 비장으로부터의 CD4 + 인구 기-67 + 세포의 비율은 (N = 4)과의 PBS-(N = 5), SAS 처리 된 마우스 (N = 5)로 유도 EAE. 단방향 ANOVA 테스트는 PBS-또는 SAS 처리 EAE의 비장 중 하나에 비해 순진 비장에서 기-67 + 세포의 비율 사이의 통계적 유의성을 보여 주었다. 어떤 의미는 PBS-및 SAS 처리 EAE의 비장 사이에 관찰되지 않았다. (B, 오른쪽 패널) 대표 도트 플롯; 번호는 확산의 비율을 나타냅니다. 도트 플롯 비율을 보여줍니다. 막대 그래프는 두 개의 꼬리 t 테스트를 나타내고, *** p &lt;0.001. 다시 인쇄 (11)의 허가와. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig6.jpg" /> 그림 6. 약리 치료 후 EAE와 SJL 마우스에 면역 세포 침투. 임상 점수 (± SEM을 의미) PBS로 처리 SJL 마우스의 (N = 8) 또는 SAS (N = 8) PLP와 하루 24 postimmunization (점선)에서 139-151. 데이터는 임상 점수의 ± SEM 평균입니다. 통계적으로 유의 한 차이는, *** p &lt;0.001 비모수 양측 맨 - 휘트니 U 테스트를 사용하여 측정 하였다. 탑 라인은 통계에 사용되는 값을 나타냅니다분석. (11)로부터 허가를 재 인쇄 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig7.jpg" /> 광학 밀도를 사용하여 MBP 염색 그림 7. 정량화. (A) EAE로 유도 한배의 새끼 제어 C57BL / 6 마우스에 비해 지정되지 않은 유전자 녹아웃 마우스에서 흉부 척수에 MBP의 대표 염색. 브라켓이 감소 MBP 염색 나타내는 탈수 초화의 대표 영역을 나타냅니다. 지정되지 않은 유전자 녹아웃 C57BL / 6 마우스에서 흉부 척수의 (B) MBP 염색. (C) EAE로 유도 지정되지 않은 유전자 녹아웃 마우스 (KO n은 = 6 마우스, 2-4 요추 및 동물 당 흉부 절) 야생형 (WT에 비해 척수에 MBP 염색의 높은 광학 밀도 (OD)를 전시, N = 3 마우스, 2-4 요추 및 EAE로 유도 흉부 동물 당 부분) 마우스. 통계적으로 분석 USI* P &lt;0.05, 두 꼬리 t 테스트를 ng를. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 스케일 바 100 μm의.

이 프로토콜은 실험적 자가면역 뇌척수염에 대한 약물 치료가 면역 세포 침투를 억제한 결과로 중추신경계 보호를 보여주는지 또는 면역 세포 침투의 맹공격 동안 신경 보호를 보여주는지 확인하는 방법을 설명합니다.

자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

이 개념적 방법의 전반적인 목표는 실험적 자가면역 뇌척수염에 대한 약리학적 치료가 면역 세포 침투의 맹공격 중 또는 면역 세포 침투 억제의 결과로 중추 신경계 보호를 입증하는지 여부를 결정하는 것입니다. 이 방법은 신경 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, EAE 치료 시간을 조작하는 것이 면역 세포 침투와 보호에 미치는 영향을 어떻게 구별합니까?이 기술의 의미는 현재 이 질병에 대한 신경 보호 치료법이 없기 때문에 다발성 경화증 치료에도 확장됩니다. EAE 마우스에게 Xc-transporter 시스템의 억제제를 투여하는 것이 신경 보호 및 면역 조절이라는 사실을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 이 방법은 약물 치료를 연구하는 데 사용할 수 있지만 EAE 또는 기타 조작을 받은 유전자 녹아웃 마우스를 사용하는 연구에도 적용할 수 있습니다.멸균 가위를 사용하여 개별 동물의 뇌와 척수를 작은 조각으로 다지는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 조직당 3밀리리터 주사기 플런저 하나를 사용하여 각 샘플을 개별 70미크론 세포 스트레이너를 통해 개별 50ml 원뿔형 튜브로 으깨고 배지로 스트레이너를 헹굽니다. 모든 조각이 침식되면 새 배지로 튜브의 최종 부피를 최대 50ml까지 가져온 다음 세포 현탁액을 원심분리합니다.각 펠릿을 40% 밀도 구배 용액 4ml에 재현탁합니다. 그런 다음 튜브당 2밀리리터의 70% 밀도 구배 용액 위에 개별 15ml 원뿔형 튜브의 벽을 따라 세포를 천천히 층을 이룹니다. 원심분리로 세포를 분리하고 1밀리리터 전사 피펫을 사용하여 상부 미엘린 층을 조심스럽게 버립니다.다음으로, 시료 계면의 생존 가능한 세포를 새로운 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브당 15ml의 새로운 배지의 최종 부피로 세포를 세척합니다. 펠릿을 200마이크로리터의 신선한 배지에 재현탁시키고 세포 현탁액을 96웰 원형 바닥 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 플레이트를 원심분리하고 상층액을 튕겨냅니다.그런 다음 펠릿을 200마이크로리터의 복원 배지에 재현탁시키고 세포를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 다시 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 2%FCS가 보충된 200마이크로리터의 PBS로 세포를 세척하고 2%FCS와 FC-블록이 보충된 200마이크로리터의 PBS에 세포를 얼음 위에서 10-15분 동안 재현탁합니다.배양이 끝나면 방금 시연한 대로 세포를 세척하고 펠릿을 15마이크로리터의 세포 표면 염색 칵테일에 얼음에서 15분 동안 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 스핀 다운하고 200 마이크로 리터의 PBS에서 샘플을 두 번 세척합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 FOXP3 전사 인자 염색 시약의 세포를 섭씨 4도에서 30분에서 하룻밤 동안 재현탁합니다.배양이 끝나면 150마이크로리터의 투과화 완충액으로 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포를 원심분리하고 얼음 위의 15마이크로리터의 투과화 완충액에 관심 있는 세포 내 항체의 펠릿을 재현탁합니다. 30분 후, 세포를 스핀다운한 다음 200마이크로리터의 투과화 완충액을 3회 세척합니다.마지막 세척 후 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고 살아있는 CD4 양성, TCR 베타 양성 세포에 게이팅하여 유세포 분석으로 샘플을 분석합니다. 또한 말초 T 세포의 증식을 평가하는 것도 중요한데, 말초의 변화는 면역 세포가 중추신경계로 침투하는 데 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. EAE 유도 후 척수 조직 샘플에 존재하는 성상세포와 신경교세포의 수를 정량화하려면 4배 배율로 각 절편의 이미지를 얻고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.그런 다음 ImageJ에서 관심 있는 이미지를 선택하고 다각형 선택 도구를 사용하여 전체 척추 조직 단면을 추적합니다. 이미지 메뉴에서 유형 및 16비트를 선택하여 이미지를 16비트로 변환합니다. 그런 다음 프로세스 메뉴를 열고 주제 배경을 선택하여 구르는 공 반경을 배경의 일부가 아닌 가장 큰 개체의 크기 이상으로 설정합니다.슬라이딩 포물면을 확인하고 OK(확인)를 클릭합니다. 그런 다음 이미지에서 조정 및 임계값을 선택하고 슬라이딩 막대를 사용하여 더 낮은 임계값 수준을 설정합니다. 선택한 영역 내에서 임계값이 설정된 영역의 백분율을 얻으려면 analyze and set measurements(분석 및 측정 설정)에서 area fraction(면적 분율)을 선택합니다. Limit to Threshold(임계값 한계)가 선택 취소되어 있고 디스플레이 레이블(Display label)이 선택되어 있는지 확인한 다음 OK.To 클릭하여 측정값을 구하고 analyze(분석)에서 measure(측정)를 선택합니다.결과 팝업 상자가 나타납니다. 이 데이터를 저장하고 처리 그룹 간의 면적 분율 값을 비교합니다. 광학 밀도에 의한 미엘린 염기성 염색을 정량화하려면 관심 이미지를 열고 다각형 단면 도구를 사용하여 샘플 내에서 관심 영역을 그립니다.analyze and set measurements(분석 및 측정 설정)에서 mean gray value(평균 회색 값)를 선택하고 Limit to threshold(임계값 제한)가 선택 취소되어 있고 해당 디스플레이 레이블이 선택되어 있는지 확인합니다. 확인을 클릭합니다. 그런 다음 분석 메뉴에서 측정을 선택합니다. myelin basic protein mean gray value 데이터가 포함된 새로운 결과 팝업 상자가 나타납니다.척수 제거 및 유세포 분석을 통해 중추 신경계 면역 세포 침투를 평가할 수 있으며, 질병이 최고조에 달했을 때 면역 세포 침투가 최대입니다. CD4 양성, 인터페론 감마 양성, IL-17 양성 및 FOXP3 양성 세포 수에 대한 통계적 분석을 통해 CD4 양성 침투 T 세포 수와 대조 동물의 CD4 양성 침투 T 세포 수에서 관찰된 변화의 중요성을 밝힐 수 있으며, CD4 양성 침투 T 세포 수의 전반적인 감소에 대한 교란 요인인 왜곡을 배제하는 데 필수적인 심층적인 동시 발현 분석이 필수적입니다. T 세포에 침투하는 중추 신경계의 감소가 말초의 증식, 활성화 및 분화를 억제하는 결과일 가능성을 제거하기 위해 활발하게 증식하는 T 세포의 수와 T 세포 아형의 비율을 평가할 수 있습니다.미엘린 무결성의 정량적 평가를 위해 미엘린 염기성 단백질 염색의 광학 밀도에 대한 통계적 분석을 수행할 수 있으며, 예를 들어 야생형 깔짚과 비교하여 상세불명의 유전자 녹아웃 동물에서 척수 조직의 상당한 탈수초화를 밝힐 수 있습니다. 신경염증이 치료적 개입에 의해 지속되거나 감소한다는 것을 더욱 입증하기 위해, 방금 설명한 바와 같이 반응성 신경교증에 대한 평균 분획 면적을 측정하여 반응성 신경교증을 평가할 수도 있습니다. 유세포 분석 기법은 제대로 수행되면 2일 내에 완료할 수 있으며, 조직 염색의 정량화는 염색당 약 2시간 내에 수행할 수 있습니다.면역조절은 면역세포가 침투하기 전에 치료법을 도입하여 T세포의 이동 및 증식 변화를 정량화하여 평가할 수 있습니다. 면역 세포가 이미 CNS에 침투한 질병이 최고조에 달했을 때 치료법을 도입하여 CNS 보호를 평가할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포 염색의 특정 강조 표시에 대해서만 ImageJ에서 최적의 임계값 설정을 평가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 동영상을 시청한 후에는 중추신경계, T세포 증식 및 이동 반응에 대한 특정 치료법의 효과를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 면역 세포 침투 전후의 치료 시간을 변경합니다.

determining-immune-system-suppression-versus-cns-protection-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

마우스 척수 이미징을위한 새로운 생체 준비. 이 프로토콜은 척수 걸쳐 라이브 세포 상호 작용의 두 광자 이미징을 허용한다.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

탈수초 질환은 리솔레시틴을 중추신경계에 국소적으로 적용하여 동물에서 모델링할 수 있습니다. 쥐의 척수에 리솔레시틴을 한 번 주입하면 시간이 지남에 따라 자발적으로 복구되는 병변이 생성됩니다. 목표는 탈수초화 및 재수초화와 관련된 요인을 연구하고 수리를 강화하기 위한 에이전트를 테스트하는 것입니다.

리소 레시틴의 초점 주사 실험 탈수 초화 및 설치류 척수의 재유 수화

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

본 프로토콜은 마우스에서 안정하고 재현가능한 탈수초화 모델을 생성하기 위해 입체택시 프레임을 통해 리소포스파티딜콜린의 두 점 주사를 기술한다.

마우스에서 리소포스파티딜콜린-유도된 초점 탈수초화 모델의 안정적으로 확립된 투포인트 주사

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증의 동물 모델 역할을 합니다. 이 기사에서는 EAE에서 척수 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 채점하는 접근 방식을 설명합니다. 또한, 생쥐 혈청에서 용해성 신경 필라멘트 광 수준을 정량화하는 방법이 제시되어 살아있는 생쥐의 축삭 손상 평가를 용이하게 합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (실험적 자가면역 뇌척수염 시 마우스의 자가반응성 항체 정량화)

학습하세요 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스 모델에서 약물 치료가 중추신경계 보호와 면역 세포 침윤 억제를 통해 작용하는지 구별하는 방법을. 이 기술은 다발성 경화증 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제

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