전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

본 혈액 생성 유도 프로토콜의 전반적인 목표는 전사 인자 과발현을 통해 마우스 섬유아세포에서 발달 과정을 유도하여, 장기 배양 시 혈액 세포를 생성하는 조혈 전구 세포를 in vitro에서 생성하는 것입니다. 이 방법은 다분화 능력과 이식 능력을 갖춘 진정한 HSCs를 de novo로 얻기 위한 프로토콜 개발 가능 여부와 같이, 조혈 프로그래밍 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소한의 전사 인자 세트 과발현을 통해, 다능성 중간 단계(pluripotent intermediate)를 거칠 필요 없이 리프로그래밍된 세포에서 발달 과정을 시작할 수 있다는 점입니다.

마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 배양하고 텍스트 프로토콜에 따라 바이러스를 생성한 후, 0.1% gelatin/PBS 용액을 사용하여 6-well plate를 사전 코팅합니다. 이때 gelatin이 웰의 전체 면적을 덮도록 합니다. 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 최소 20분 동안 둡니다.

그런 다음, 플레이트를 꺼내고 젤라틴을 흡입하여 제거합니다. 표준 DMEM을 사용하여 웰당 25, 000 cells의 밀도로 MEF를 분주하고, 37 °C에서 하룻밤 동안 세포를 안착시킵니다. M2RTTA 50 µL와 GATA2, GFI1B, CFOS 및 ETV6를 각각 12.5 µL씩 혼합하여 100 µL의 바이러스 칵테일을 준비합니다.

MEF에서 배지를 흡입하여 제거하고, 8 µg/mL의 hexadimethrine bromide가 포함된 표준 DMEM 2 mL를 첨가합니다. 그 다음, 각 MEF 웰에 바이러스 칵테일 15 µL를 처리하여 트랜스덕션시키고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 16~20시간의 배양 후, 각 웰의 배지를 1 µg/mL의 DOX가 보충된 신선한 표준 DMEM 2 mL로 교체합니다.

37 °C에서 3일 동안 배양합니다. 4일 차에 hydrocortisone, stem cell factor, MFS-related tyrosine kinase three ligand, interleukin three, interleukin six 및 DOX가 보충된 조혈 배양 배지를 준비합니다. 다음으로, MEF에서 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 PBS를 사용하여 세포를 세척합니다.

그 다음, PBS를 흡입하여 제거한 후, 세포를 해리하고 수집하기 위해 웰당 0.05% trypsin 1 mL를 첨가합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 센 다음, 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, 방금 준비한 조혈 배지 12 mL를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 그런 다음, 젤라틴 코팅된 6-웰 플레이트에 웰당 10,000개의 세포를 분주합니다.

배양 기간 동안 6일마다 배지를 신선한 보충 조혈 배양 배지로 교체하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 분석하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 임신한 마우스로부터 태반을 적출한 후, 20% FBS가 포함된 PBS 내 0.2% collagenase type one 2~5 mL를 사용하여 조직을 세척하고, 5 mL 주사기에 장착된 18게이지 바늘을 사용하여 PBS 용액 내에서 조직을 기계적으로 분리하십시오.

태반 세포를 37°C에서 2~5 mL의 콜라게나제 용액에 넣고 1.5시간 동안 배양합니다. 그다음, 5 mL 주사기에 20~25 gauge 바늘을 장착하여 세포를 여러 번 통과시켜 기계적으로 더욱 분리합니다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너로 여과합니다.

그 다음, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고, 유사분열 불활성화를 위해 2,000 centigray volts로 조사합니다. 다음 성분들이 보충된 조혈 배양액 10 mL를 10 cm 디쉬에 넣습니다. 0.65 micron 필터를 디쉬 내의 배양액 위에 직접 올려 액체-기체 계면이 형성되도록 띄운 후, 디쉬를 그대로 둡니다.

이 비디오의 앞부분에서 보여준 것과 같이 25일 차에 형질전환된 MEF를 분리하고, 형질전환된 MEF 33,000개를 유사분열이 비활성화된 태반 응집체 세포 167,000개와 혼합합니다. 응집체를 생성하려면 MEF와 태반 세포 혼합물을 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 배지를 흡입하여 제거하고 30 ~ 50 µL의 표준 DMEM을 사용하여 펠렛이 된 세포를 재현탁한 후, 단일 세포 현탁액을 200 µL의 비절단 피펫 팁으로 흡입합니다.

다음으로, 파라핀 필름을 사용하여 피펫 팁을 막습니다. 그런 다음, 막힌 팁을 15 milliliter 원심분리 튜브에 넣고 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 팁의 막힌 끝부분에 펠릿이 형성되도록 합니다. 15 milliliter 튜브에서 팁을 조심스럽게 꺼내 P200 피펫 끝에 장착합니다.

파라핀 필름을 제거하고 세포 펠렛을 배양액이 담긴 디쉬에 떠 있는 필터 위로 밀어내어 옮깁니다. 떠 있는 필터 위에서 응집체를 37 °C, 5% CO₂ 조건으로 4~5일 동안 배양합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 응집체를 수집한 후, 이를 합치고 0.5% collagenase를 사용하여 소화시킵니다.

해리 후, 5% FBS가 포함된 PBS 2~5 mL를 사용하여 응집체를 세척하고 300 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. FBS, Pen-Strep 또는 L-glutamine이 포함되지 않은 DMEM 500 µL에 응집체를 재부유시킵니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며, 10 ng/mL의 Tepo가 첨가된 1% methylcellulose 배지 3 mL에 현탁액 전체를 첨가합니다.

CFU 분석을 위해 이 혼합물을 35 x 10 mm 비처리 배양 접시 3개에 동일한 부피로 분주합니다. 대조군으로 조사된 태반 응집체를 배양합니다. 마지막으로, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 10~14일간 배양한 후 현미경으로 조혈 콜로니 수를 수동으로 측정합니다.

MEF를 HSC로 리프로그래밍하는 과정에서, 여기에서 보여주는 것과 같이 전사 인자가 세포에 도입됩니다. 3일간의 확장 및 transgene 활성화를 시작하기 위한 DOX 노출 후, 세포를 분리 및 분할하여 젤라틴 코팅 플레이트에서 보충 조혈 배지로 배양합니다. 리프로그래밍 배지로 형질전환 후 배양 20일째에, 34/H2BGFP MEF는 MEF와는 뚜렷이 구분되는 내피 세포 형태를 포함하여 명확한 형태학적 변화를 나타냅니다.

35일까지 추가 배양하면 내피세포 유사 중간체로부터 여러 개의 둥근 조혈모세포 유사 세포가 나타나는데, 이들은 GFP 양성 반응을 보이며 조혈 마커인 Sca1 및 CD45에 대해 양성으로 염색됩니다. 추가 배양 시 세포들은 인간 CD34 리포터의 발현을 유지하면서 CD45를 발현하게 됩니다. 태반 응집 후, 배양된 세포들은 클론 형성 능력을 갖게 되며, 다양한 조혈 형태 및 모세포 유사 세포를 포함하는 콜로니를 메틸셀룰로오스 내에서 생성합니다.

이 절차를 시도할 때는 혼동을 피하기 위해 각 단계를 천천히 수행하는 것이 중요합니다. 어떤 실수가 발생하더라도 리프로그래밍을 시작하고 수주가 지날 때까지는 이를 알아차리기 어렵습니다. 이 절차 이후에는, 기능 분석에서 입증된 것처럼 유도된 세포가 진정으로 조혈 기능을 보유하고 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 cobblestone-forming cell assay 및 long-term culture initiating cell assay와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 조혈모세포 프로그래밍 분야의 연구자들은 혈액, 내피 및 기타 세포 유형에서 다른 리프로그래밍 전략과 최적화 프로토콜을 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하신 후, 마우스 섬유아세포에서 조혈성 프로그램을 유도하는 방법, 전사 인자의 과발현, 그리고 유도된 세포의 기능적 분석 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.