Name: 전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 배우세요 마우스 배아 섬유 아 세포에서 전사 인자 과발현을 통해 조혈 전구 세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 다능성 단계 없이 직접 재프로그래밍하여 진정한 조혈 줄기 세포를 얻는 새로운 접근법을 제공합니다.

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이 작업은 K.M. 및 I.R.L. (1RO1HL119404)에 대한 NHLBI 보조금의 지원을 받았습니다. Carlos-Filipe Pereira는 Revson Senior Biomedical Fellowship을 수상했습니다. 자재 및 프로토콜에 대한 지원을 제공한 Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility와 S. D'Souza에 감사드립니다. 우리는 또한 Mount Sinai 유세포 분석, 유전체학 및 마우스 시설에 감사드립니다.

윤리 문 : 마우스 세포주가 시내 산에서 의학의 아이칸 학교의 동물 관리 지침에 따라 유도하고, 호스트 기관 준수 수행해야합니다. C57BL / 6 마우스 1. 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 분리 <ol><li> 시간 제한 짝짓기 (13)을 설정합니다. 질 플러그가 가시화되면,이 날 0.5을 고려하십시오. </li><li> 플러그 날짜에 연결 여성을 분리하고 임신을 확인하기 위해 하루 10 ~ 11에이를 확인. </li><li> 날 13.5-14.5에서 CO를 통해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입을 임신 여성 쥐를 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 임신 한 여성의 배를 적시 중간 선 아래로 멸균 가위와 집게로 복강을 절개하고 수술 배아 (14)를 포함하는 자궁 뿔을 제거합니다. 나머지 복부 조직을 차단하면서 부드럽게 배아를 꺼냅니다. 주 : 각면에 4 약 8 배아를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 자궁 시간 배치멸균 냉동 인산염 완충액 (PBS) 용액 5-10와 10cm 접시에 배아를 함유 orns. </li><li> 멸균 가위와 집게로, 자궁 뿔을 따라 절개 배아를 들고 주머니를 분리 할 수 ​​있습니다. PBS 냉각 살균의 5 ~ 10 ml의 새로운 10cm 접시에 주머니를 전송하고 얼음에 배치합니다. </li><li> 멸균 냉장 PBS의 5 ~ 10 ml를 가진 새로운 10cm 접시에 주머니의 몇 가지를 놓습니다. 멸균 가위와 집게 부드럽게 배아를 관통 방지하기 위해 (너무 깊이 절단하지 않고) 주머니를 자르면 사용. </li><li> 탯줄을 절단하여 태반에서 배아를 분리합니다. </li><li> 냉장 PBS의 5 ~ 10 ml의를 포함하는 새로운 10cm 접시에 배아를 전송하고 나머지 해부를 완료하는 동안 얼음에 둡니다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 배아 목을 벨. 조심스럽게 복부를 엽니 다 참수 지역에서 시작하여 멸균 가위와 집게를 사용하여 배아의 중간 선을 잘라. 위치는 t 아래 포셉그는 내장 기관 (심장, 간을 포함한 폐)와 15 그들을 다 쳤어요. </li><li> 트립신 10 ㎖를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 가위와 집게 및 전송을 사용하여 작은 조각으로 남아있는 조직을 잘라. </li><li> 피펫 위로 20 ~ 30 회 10ml를 피펫으로 다운 혼합 조직을 떼어 놓다합니다. </li><li> 때때로 소용돌이, 45 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에있는 조직과 트립신 믹스를 품어. </li><li> 피펫 상하로 약 5 분 동안 10 ㎖ 피펫으로는 내용물을 혼합한다. </li><li> 10 % 소 태아 혈청과 표준 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) (FBS)의 볼륨을 3 배 트립신 세포 추가 10 μg의 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S), 1 mM의 L 글루타민 (L-GLUT)에서 10cm 요리 (~ 10 ㎖)과 합류 (2-4 일)까지 37 ° C에서 문화. 10cm 접시 당 1-2 배아에 대한 문화. 참고 : 플레이트 한번 동결 세포가 합류한다. 냉동 세포를 해동하고 2 회 이상 계대 될 수있다. 세포는 대안이 될 수해동 후 다음 한 번 더 이전에 동결에 2 회 분할합니다. </li></ol> 2. 바이러스 성 생산 <ol><li> 10 % FBS, 형질 전환을위한 1 % P / S, 1 %의 L-GLUT 10 ML의 DMEM과 10cm 플레이트에서 293T 세포를 확장합니다. <ol><li> 2ml의 트립신를 Trypsinize 293T 세포를, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다 XG 300 15 ㎖의 튜브에 스핀 세포를 수집하고, 적절하게 플레이트 (10cm 접시 당 10 ㎖). </li></ol></li><li> 6 및 코팅 10cm 젤라틴의 씨앗 (PBS에서 0.1 % 젤라틴) 판 : 24 시간은 형질 전환 이전에, 293T 세포 1의 합류 10cm 접시를 분할합니다. 참고 : 바이러스 당 4 플레이트가 필요합니다. <ol><li> 젤라틴의 코팅 플레이트, 코팅 10cm 플레이트의 바닥을 0.1 % 젤라틴 용액의 적어도 2를 가하여. 적어도 20 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 판에 셀을 추가하기 전에 대기음 오프 젤라틴. </li></ol></li><li> 15 ML 튜브에서 (84 μg의 플라스미드를 추가 예를 들어 Gata2, Gfi1b, cFos를, 또는 Etv6합니다 (pFUW-TETO의 VECT에 서브 클로닝16) 또는 FUW - M2rtTA 17), 84 μg의의 psPAX2, 42 μg의 pMD2.G. 물을 추가 (H 2 O) 2 ml의에 볼륨을 확인합니다. 각 요소에 대한 튜브를 준비합니다 (예. Gata2, Gfi1b, cFos를, Etv6와 FUW - M2rtTA). </li><li> 선택된 유전자의 84 μg의 구성 2 ml의 혼합물을 포함하는 각 튜브에 2M CaCl2를 250 μl를 추가 (Gata2, Gfi1b, cFos를, Etv6 또는 FUW - M2rtTA) + 84 μg의 psPAX2 + 42 μg의 pMD2.G + H 2 O . </li><li> 피펫 처치에 삽입 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 릴리스는 2.25 ml의 DNA + H 2 O + 2 M CaCl2를 혼합물에 거품. 거품이 생성되는 바와 같이, 유리 피펫 대해 P1000의 팁을두고 서서히 배출이 100 mM의 N, N- 비스 (2- 히드 록시 에틸) 파스퇴르 피펫 1 다운 -2- 아미노 에탄 술폰산 (BES) 식염수 용액 한 번에 ml의. </li><li> 적어도 15 분 동안 실온에서 배양 후드 내의 모든 튜브 부화. 주 : 4.25 ml의 혼합물 (지금의 DNA +의 H 2 O + 2M 염화칼슘 (2) </서브&gt; + BES 식염수)을 약간 흐린 볼 것이다. </li><li> 혼합물, 흡인 미디어 오프 293T 판을 잠복하고 10 ML의 DMEM + 10 % FBS + 1 mM의 L 글루타민 + 25 나노 클로로퀸을 추가. 참고 :이 매체는 P / S가 포함되어 있지 않습니다. </li><li> 배양 적어도 15 분 후 (또는 293T 세포에 미디어를 변경 할 때까지), O + 2 M 염화칼슘 2 + BES 식염수 혼합물을 튜브 당 4 셀 플레이트 균등하게 분배의 293T 세포에 현명한 드롭 4.25 ml의 DNA +를 H 2를 추가 (플레이트 당 혼합물의 예보다 약간 많은 1 mL)을 첨가 하였다. </li><li> 37 ° C에서 하룻밤 판 (O / N)를 품어. </li><li> 24 시간 후 배양은 4 ㎖의 표준 DMEM (단계 1.15 참조) 모든 판에 미디어를 교체합니다. </li><li> 지금부터 32 °의 C 배양기에서 세포를 유지합니다. </li><li> 24 시간 단계 2.10 후, 별도의 50 ㎖ 튜브에 미디어를 수집합니다. 표준 DMEM 4 ㎖로 각 플레이트에서 수집 된 미디어를 교체합니다. 참고 : 수집 된 미디어 (16) 용액에 초기 튜브 혼합물 결과 당 4 판. <ol><li> 에이따고 배양 12 시간 동일한 50 ㎖ 튜브에 다시 미디어를 수집하고 표준 DMEM의 또 다른 4 ㎖로 교체합니다. </li><li> 배양 12 시간 후, 상기 미디어를 수집하고 동일한 50 ㎖ 튜브에 추가. 참고 : 각각의 튜브는 지금 바이러스를 포함하는 미디어의 약 48 ml에 포함해야합니다. </li></ol></li><li> 0.45 μM 저 단백 결합 필터를 통해 수집 된 바이러스, 첫 번째 필터 수집 된 미디어를 집중합니다. </li><li> 바이러스 농도를 원심 분리 튜브 (한번에 약 16 mL)에 바이러스를 함유하는 여과 매체를 붓는다. </li><li> 25 분 4 ° C에서 4,000 XG에 스핀과 흐름을 통해 제거합니다. 참고 : 농축 미디어와 바이러스의 작은 볼륨이 필터에 표시됩니다. </li><li> 필터에 남아있는 농축 미디어 + 바이러스 볼륨으로 필터링 된 바이러스 함유 미디어의 또 다른 16 ML을 추가하고 튜브를 반전하여 섞는다. </li><li> 스핀 튜브 다시 25 분 및 폐기 흐름을 통해 4 ° C에서 4,000 XG에. </li><li> 필터링 된 나머지 추가농축 미디어 + 바이러스 볼륨 집합은 필터에 남아있는 튜브를 반전시켜 혼합한다. </li><li> (필터의 양에 따라) 10 ~ 20 분 동안 4 ° C에서 다시 한 번 4000 XG에 스핀 필터에 남아있는 농축 미디어 + 바이러스의 남은 양이 약 1 ml 인 것을 확인합니다. 농축 미디어 + 바이러스보다 1 ml를 필터에 남아있는 경우, 1 분 동안 4,000 × g으로 다시 회전하고 1 ㎖의 필터에 남아 때까지 반복한다. </li><li> 1.5 ml의 튜브에 집중 바이러스의 200 μL 나누어지는 및 -80 ° C에서 동결 또는 즉시 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. MEF 재 프로그래밍 <ol><li> 프리 코트 젤라틴이 잘의 전체 면적을 보장 PBS 웰 당 0.1 % 젤라틴 0.5 ml의 6 잘 접시. 37 ° C 배양기에 넣고 적어도 20 분 동안 품어. 인큐베이션 후, 플레이트를 제거하고, 젤라틴 대기음. </li><li> 물론 당 25,000 세포의 밀도에서 표준 DMEM와 플레이트 MEFs에 (150,000 셀단계 3.1에서 젤라틴 6 웰 플레이트 (들)에) 6 웰 플레이트 당은 37 ° C 배양기에서 O / N을 해결 할 수 있습니다. </li><li> Gata2, Gfi1b, cFos를, 그리고 Etv6의 혼합 (12.5 μL 각)을 50 μl의 M2rtTA를 혼합하고 나머지 50 μL하여 100 ㎕의 바이러스 칵테일을 준비합니다. </li><li> MEFs에에서 대기음 매체와 8 μg의 / ㎖ hexadimethrine 브로마이드와 2 mL의 표준 DMEM를 추가합니다. </li><li> 바이러스 칵테일 15 μL와 MEF 플레이트의 각 웰에 형질 도입하고, 37 ℃에서 O / N을 배양한다. 주 : 이것은 프로그래밍 프로세스의 일 0이다. </li><li> 1 일에서 배양의 16 ~ 20 시간 후, / ㎖ DOX 웰 당 1 μg의 보충 2 ml의 신선한 표준 DMEM으로 미디어를 교체합니다. </li><li> 하이드로 코르티손 (10-6 M), 100 ng의 / 줄기 ㎖로 세포 인자 (SCF), 100 ng의 / ㎖ FMS 관련 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt3L) 20 NG / ㎖ 인터루킨 -3 (IL-보충 조혈 배지를 준비 3) 20 NG / ml의 인터류킨 -6 (IL-6), 1 μg의 / ㎖ DOX. </li><li> 4 일 aspirat에각각의 전자 매체 잘 잘 당 PBS 1 ml의 세포를 씻는다. </li><li> 대기음 PBS는 웰 당 0.05 % 트립신 1 ㎖를 사용하여 세포를 해리하고 세포를 모은다. </li><li> 단계 3.7에 설명 된 조혈 미디어 12 ㎖에 5 분에 resuspend 300 XG에, 혈구와 스핀 세포를 세어 0.1 % 젤라틴 코팅 된 플레이트에 6 웰 플레이트 당 60,000 세포를 플레이트 (2 ㎖ 당 잘 10,000 세포 당 잘 ). </li><li> 문화의 기간 (35 ~ 36 일)에 대한 매 6 일 신선한 보충 조혈 문화 미디어와 미디어를 교체합니다. </li><li> hemogenic 내피 또는 HSC와 같은 마커 유전자 발현의 인수를 확인하는 면역 염색 (12), FACS 분석 8,12, QRT-PCR (12), 및 mRNA의 염기 서열 (12)를 통해 중간 세포 또는 신흥 조혈 같은 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 메틸 셀룰로오스 4. 태반 집계 및 콜로니 형성 단위 (CFU) 분석 실험 <ol><li> 임신 C5에서 태반을 해부하다7BL / 6 마우스는 이전에 E12.5에서 18 설명과 얼음에 조직을 유지한다. </li><li> 태반 해리 (19)를 시작하려면, 나는 20 % FBS와 PBS에서 2-5 ml의 0.2 % 콜라게나 유형에 태반 조직을 씻어 기계적으로 바늘을 통해 태반과 PBS를 계대하여 5 ML의 주사기에 장착 18G 바늘 해리 이상 3 회. </li><li> 기계적 분리 후, 1.5 시간 동안 37 ° C에서 콜라게나 제 용액을 2-5 ml의 태반 세포를 유지한다. </li><li> 20 ~ 25 G 바늘을 통과 세포는 더 기계적으로 태반 세포를 떼어 놓다 5 ml를 주사기에 여러 번 장착. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 단일 세포 현탁액을 필터링합니다. </li><li> 혈구와 세포를 계산하고 유사 분열 불 활성화 20 2,000 cGy의에서 조사. </li><li> 10cm의 100 NG / ㎖ SCF 100 NG / ㎖ Flt3L 20 NG / ㎖의 IL-3, 20 NG / ㎖의 IL-6 및 10 NG / ㎖ 트롬 보포 이에 틴 (TPO)이 보충 된 조혈 배양 배지 10 ㎖를 추가 요리. 참고 : DOX는이 단계에서 필요하지 않습니다. </li><li> 이 액체 가스 인터페이스를 생성하고 따로 요리를 설정 떠있게 접시에 조혈 문화 매체에 직접 0.65 μm의 필터를 놓습니다. </li><li> 단계 3.8-3.10에 설명 된대로 (단계 3.11에서 파생 된) 일 (25) 형질 도입 된 MEFs를 해리 단계 4.6에서 태반 집계 167,000 세포로 형질 도입 MEFs에의 33000 혼합 (1 : 6 비율). </li><li> 300 X g에서 5 분 동안 단계 4.9에서 집계 18,21은 MEF 아래 첫 번째 스핀과 태반 세포 믹스를 생성합니다. 200 μL nonbevelled 피펫 팁으로 단일 세포 현탁액 그리기, 미디어를 기음과 P200 피펫을 사용하여 표준 DMEM의 30 ~ 50 μL에 펠렛 세포를 재현 탁. </li><li> 파라핀 필름 피펫 팁을 흡장. 15 ML의 원심 분리기 튜브에 차단 팁을 놓고 끝 부분의 피복 말에 300 XG에 5 분간 때문에 펠렛 형태의 스핀 다운. </li><li> 15 ML의주의 깊게 관과 장소에서 팁을 제거P200 피펫의 끝에 끝. 파라핀 필름을 폐기 단계 4.8에서 부동 필터에 세포 펠렛을 돌출. 참고 : 필터 당 최대 3 집계 접시입니다. </li><li> 문화 5 % CO 2와 37 ° C 4-5 일 동안 부동 0.65 μm의 필터에 집계. </li><li> 세포를 해리 전체 태반으로 수행과 같은 프로토콜 (4.2-4.5 단계)에 따라, 셀 스크레이퍼로 집계 (필터 당 최대 3) 수집을 결합하고, 0.2 % 콜라게나 제와 소화. </li><li> PBS 2-5 ml의 5 % FBS로 보충하여 분리 한 후, 응집체를 씻고 5 분 동안 300 XG에 세포를 스핀 다운. </li><li> FBS, P / S, 또는 L-GLUT없이 DMEM 500 μL의 집계를 재현 탁. 이 재현 탁 500 μL를 취하여 10 신중 거품의 형성을 회피 TPO의 / ㎖ 겨 보충 된 3 ㎖의 1 % 메틸 매체에 추가. 3 35 X 10mm 비 처리 된 배양 접시에서이 혼합물 접시 같은 부피CFU (12)를 분석. </li><li> 대조군으로, 문화는 단계 4.7-4.16에 상술 한 바와 같이 CFU 분석에 재 프로그램 MEFs에 4-5 일 장소를 혼합하지 않고 태반의 집계를 조사. 참고 :이 집계 혼자 식민지를 형성하지 않는다. </li><li> 수동 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화의 10~14일 후 현미경으로 조혈 식민지를 계산합니다. </li><li> Cytospin (22)는 단일 세포의 형태 학적 표현형을 보여 식민지를 들었다. </li></ol>

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

쉽게 달성 체세포에서 HSPCs 새로이 생성하는 것은 잠재적으로 시험관 내에서 조혈 및 기회를 연구 인간 시스템에이 기술을 적용하는 독특한 방법을 제공한다. 이 번역은 접시에 인간의 혈액 질환을 연구뿐만 아니라 새로운 치료제 또는 HSC 이식 수많은 장애를 치료 할 수있는 기회를 대상으로 약물 테스트 플랫폼과 유전자를 제공하기 위해 새로운 도구를 생성합니다. 필드에서, 최근의 연구는 프로그래밍 프로세스의 여러 가지 기능의 중요성을 보여주는 드 노보 HSPCs을 생성하는 능력을 확장하고있다. 다음은 시작 세포 인구 및 TF 칵테일의 선택뿐만 아니라 방법으로 배양 조건 (공동 문화의 틈새 시장) 및 보충 (사이토 카인, 작은 분자 등)을 크게 24-26를 재 프로그램의 효율성에 영향을 미칠를 포함한다. 여러 연구를 통해 이동하지 않고 인간 시스템 프로그래밍 기술을 적용이러한 과정에서 다 능성 중간, 27,28 바람직하지 않은 단계. <p...

조혈는 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)가 같은 대동맥 - 생식소 - Mesonephros로 배아 조혈 사이트와 태반 1,2의 다양한 존재 hemogenic 내피 세포를 싹 복잡한 발달 과정이다. 체외에서 배양 조혈 모세포에 대한 무능력이 과정의 깊이 분석뿐만 아니라 이러한 연구의 임상 응용 프로그램을 방지 할 수 있습니다. 이 제한을 회피하기 위해, 기존의 연구는 유도하기 위해 시도 조혈 모세포 드 노보 중 재 프로그래밍 미디어 4,5를 사용하는 다 능성 줄기 세포 (PSC를) 3, 또는 체세포에서 유도 소성 감독 분화의 차별화를 통해. 이 연구는, 그러나, 임상 적으로 안전 engraftable 세포를 생성하거나 결정적인 발달 조혈의 연구를 허용하지 않습니다 &quot;접시를.&quot; 체세포 섬유 아세포의 페이지에서 야마나카 연구팀에 의해 설립 된 신규 작업을 유도 생성하는 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)전사 인자 (TF) 프로그래밍 세포 운명 6,7에 기반 과발현 전략을위한 프레임 워크를 rovides. 이 작품은 쉽게 얻을 체세포의 TF의 재 프로그래밍을 통해 선택의 세포 유형을 생성하기 위해 여러 분야의 연구자를 묻는 메시지가있다. 여기에 설명 된 프로그래밍 전략 목표는 마우스 체세포 시험 관내에서 인간 조혈을 연구하기 위해 환자 별 섬유 아세포를 재 프로그램 할 수있는 인간의 시스템에 이들 결과를 변환하는 목표와 TF 기반 프로그래밍 방법을 사용하여 세포로부터 hemogenic 처리를 유도하는 것이다 질병 모델 약물 테스트에 대한 환자 - 특정 혈액 제제를 생성하고, 줄기 세포 이식. 이러한 마우스 시스템의 적절한 프로그래밍을 위해 첫 번째 단계는 CD34 발현 내피 전구 세포 및 조혈의 공지 된 마커에 대한 판독 역임 리포터 라인을 개발 하였다. 이렇게하려면 huCD34-TTA와 TETO-H2BGFP 유전자 변형 마우스 라인 g을 사용 하였다enerate 이중 형질 전환 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs에)는, 이제 CD34 발기인 (8)의 활성화에 따라 녹색 형광 34 / H2BGFP를 나타낸다. 이는 조혈 명세서 및 개발하는 동안 다른 지점에서 요구되는 공지의 TF의 다양한 스크리닝시켰다. PMX retrovial 벡터 18과 TF를 시작으로 34 / H2BGFP MEFs에는 AFT024 기질 세포를 HSC는지지의 모든 요소 배양과 형질 도입 된, (34 / H2BGFP 마우스를 설명 문학 마이닝 및 이전에서 조혈 모세포를 유지 GFP 라벨의 프로파일 링을 통해 결정). 기자의 활성화를위한 TF가 최적의 설정이 확인 될 때까지 34 / H2BGFP 활성화의 검출 후, TF가이 연속적으로 재 프로그래밍 칵테일에서 제거되었습니다. 이 초기 화면 후에 인자하여 TFS의 발현을 제어 할 수 있도록하는 유도 DOX pFUW 벡터 시스템으로 옮겼다. 이 두 DOX 제어 시스템 (34 / H2BGFP 세포와 pFUW 유도 벡터)에서 MEFs에 호환되지 않는 때문에야생형 C57BL / 6 마우스가 필요했다. hemogenesis 진행하고 multilineage 클론 원성 전구 세포를 만들 수 있도록 적절한 미세 환경을 제공하는 것도 필요했다. 조혈 줄기 및 전구 세포로 (HSPCs)에 체세포를 재 프로그래밍을 시도하는 현재의 연구는 성공 9-11의 다양한 수준을 만났다. 현재까지, 마우스 및 장기 자기 갱신 다시 채우기 능력이 인간의 이식 가능한 HSPCs 모두의 발생과 TF들의 동일한 세트를 사용하여 달성되어 있지 않다. 이 프로토콜에서는 재현 된 MEFs에서 hemogenesis을 유도하는 미리 설정된 전략에 대한 상세한 설명을 제공한다. 우리는 TF가 (Gata2, Gfi1b, cFos를, 그리고 Etv6)의 최소한의 도입을 보여 발달 조혈 및 조혈 프로그래밍의 임상 응용 프로그램이 더 (12)를 연구 할 수있는 플랫폼을 제공 체외에서 복잡한 개발 프로그램을 선동 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &뮤; M 필터</td><td>Corning</td><td>430625</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 울트라 원심 필터</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini's Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>18G 바늘</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>20G 바늘</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 I</td><td>시그마</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>골수요법 배지</td><td>줄기 세포 기술</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R & D 체계</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Flt3L</td><td>연구 & D 시스템</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R & D 시스템</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R & D 시스템</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R & D 시스템</td><td>488-TO</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린</td><td>시그마</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레네 (헥사디메트린 브로마이드)</td><td>시그마</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>듀라포어 0.65 &mu; M 멤브레인 필터</td><td>Millipore</td><td>DVPP14250</td><td></td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스 배지</td><td>줄기세포 기술</td><td>Methocult M3434</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>줄기세포 기술</td><td>07904</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G-1890 100g</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>애드진</td><td>플라스미드 #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>Origene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>Origene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&nbsp;</td><td>애드진</td><td>플라스미드 #19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>Origene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>애드진</td><td>플라스미드 #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>애드진</td><td>플라스미드 #12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>애드젠</td><td>플라스미드 #20342</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm 배양 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 hemogenic 프로그램을 유도하는

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

이 프로토콜은 전사 인자(TF)의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 먼저 인간 CD34-tTA/TetO-H2BGFP(34/H2BGFP) 이중 형질전환 마우스의 MEF를 사용하여 리포터 스크린을 설계했습니다. 이 마우스의 CD34+ 세포는 GFP로 H2B 히스톤을 라벨링하고 독시사이클린(DOX)이 첨가되면 라벨링을 중단합니다. MEFS를 후보 TF로 형질전환한 다음 조혈 세포 또는 내피 세포 운명의 획득을 나타내는 GFP+ 세포의 출현을 관찰했습니다. 18개의 후보 TF로 시작하여 조합 제거 과정을 통해 가장 높은 비율의 GFP+ 세포를 유도할 수 있는 최소한의 요인 세트를 얻었습니다. 우리는 Gata2, Gfi1b 및 cFos가 필요하고 Etv6의 추가가 최적의 유도를 제공한다는 것을 발견했습니다. 재프로그래밍 과정 중 서로 다른 시점에서 수행된 일련의 유전자 발현 분석은 이러한 세포가 내피에서 조혈 전이(EHT)를 거친 전구 세포를 통과하는 것으로 나타났습니다. 이와 같이, 이 재프로그래밍 프로세스는 "접시 내에서" 발달 조혈을 모방하여 체외에서 조혈을 연구하고 이 사양의 기초가 되는 메커니즘을 식별할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 이 방법론은 또한 혈액 질환의 치료 및 연구에서 여러 응용 분야를 위한 환자 특이적 조혈 줄기 세포(HSC)의 대체 공급원을 생성하기를 희망하여 이 작업을 인간 시스템에 번역하기 위한 프레임워크를 제공합니다.

조혈 다양한 배아 사이트에서 시작 복잡한 발달 과정이다. Hemogenic 내피 세포는이 사이트에있는 세포는 23 신진를 통해 조혈 모세포에 상승을 제공합니다. 이 과정은 현재 HSPC 확장 생체 또는 새로이 생성하여 역시 든 시험관 내에서 이들 세포를 수득하는 방법을 필요로 배양에서 조혈 모세포 또는 조혈 전구체를 배치하여 재생할 수 없다. 이 프로토콜은 MEFs에에 TF 과발현을 통해 이들 세포를 얻기 위해 시도하는 우리의 새로운 기술을 보여줍니다. 도 1은 전체 프로그래밍 과정을 나타낸다. MEF 생성 및 확장 한 후, 세포 Gata2, Gfi1b, cFos를, Etv6와 FUW - M2rtTA로 형질 도입된다. 젤라틴 코팅 된 플레이트에 DOX에 확장 노출...

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

본 혈액 생성 유도 프로토콜의 전반적인 목표는 전사 인자 과발현을 통해 마우스 섬유아세포에서 발달 과정을 유도하여, 장기 배양 시 혈액 세포를 생성하는 조혈 전구 세포를 in vitro에서 생성하는 것입니다. 이 방법은 다분화 능력과 이식 능력을 갖춘 진정한 HSCs를 de novo로 얻기 위한 프로토콜 개발 가능 여부와 같이, 조혈 프로그래밍 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소한의 전사 인자 세트 과발현을 통해, 다능성 중간 단계(pluripotent intermediate)를 거칠 필요 없이 리프로그래밍된 세포에서 발달 과정을 시작할 수 있다는 점입니다.마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 배양하고 텍스트 프로토콜에 따라 바이러스를 생성한 후, 0.1% gelatin/PBS 용액을 사용하여 6-well plate를 사전 코팅합니다. 이때 gelatin이 웰의 전체 면적을 덮도록 합니다. 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 최소 20분 동안 둡니다.그런 다음, 플레이트를 꺼내고 젤라틴을 흡입하여 제거합니다. 표준 DMEM을 사용하여 웰당 25, 000 cells의 밀도로 MEF를 분주하고, 37 °C에서 하룻밤 동안 세포를 안착시킵니다. M2RTTA 50 µL와 GATA2, GFI1B, CFOS 및 ETV6를 각각 12.5 µL씩 혼합하여 100 µL의 바이러스 칵테일을 준비합니다.MEF에서 배지를 흡입하여 제거하고, 8 µg/mL의 hexadimethrine bromide가 포함된 표준 DMEM 2 mL를 첨가합니다. 그 다음, 각 MEF 웰에 바이러스 칵테일 15 µL를 처리하여 트랜스덕션시키고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 16~20시간의 배양 후, 각 웰의 배지를 1 µg/mL의 DOX가 보충된 신선한 표준 DMEM 2 mL로 교체합니다.37 °C에서 3일 동안 배양합니다. 4일 차에 hydrocortisone, stem cell factor, MFS-related tyrosine kinase three ligand, interleukin three, interleukin six 및 DOX가 보충된 조혈 배양 배지를 준비합니다. 다음으로, MEF에서 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 PBS를 사용하여 세포를 세척합니다.그 다음, PBS를 흡입하여 제거한 후, 세포를 해리하고 수집하기 위해 웰당 0.05% trypsin 1 mL를 첨가합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 센 다음, 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, 방금 준비한 조혈 배지 12 mL를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 그런 다음, 젤라틴 코팅된 6-웰 플레이트에 웰당 10,000개의 세포를 분주합니다.배양 기간 동안 6일마다 배지를 신선한 보충 조혈 배양 배지로 교체하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 분석하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 임신한 마우스로부터 태반을 적출한 후, 20% FBS가 포함된 PBS 내 0.2% collagenase type one 2~5 mL를 사용하여 조직을 세척하고, 5 mL 주사기에 장착된 18게이지 바늘을 사용하여 PBS 용액 내에서 조직을 기계적으로 분리하십시오.태반 세포를 37°C에서 2~5 mL의 콜라게나제 용액에 넣고 1.5시간 동안 배양합니다. 그다음, 5 mL 주사기에 20~25 gauge 바늘을 장착하여 세포를 여러 번 통과시켜 기계적으로 더욱 분리합니다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너로 여과합니다.그 다음, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고, 유사분열 불활성화를 위해 2,000 centigray volts로 조사합니다. 다음 성분들이 보충된 조혈 배양액 10 mL를 10 cm 디쉬에 넣습니다. 0.65 micron 필터를 디쉬 내의 배양액 위에 직접 올려 액체-기체 계면이 형성되도록 띄운 후, 디쉬를 그대로 둡니다.이 비디오의 앞부분에서 보여준 것과 같이 25일 차에 형질전환된 MEF를 분리하고, 형질전환된 MEF 33,000개를 유사분열이 비활성화된 태반 응집체 세포 167,000개와 혼합합니다. 응집체를 생성하려면 MEF와 태반 세포 혼합물을 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 배지를 흡입하여 제거하고 30 ~ 50 µL의 표준 DMEM을 사용하여 펠렛이 된 세포를 재현탁한 후, 단일 세포 현탁액을 200 µL의 비절단 피펫 팁으로 흡입합니다.다음으로, 파라핀 필름을 사용하여 피펫 팁을 막습니다. 그런 다음, 막힌 팁을 15 milliliter 원심분리 튜브에 넣고 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 팁의 막힌 끝부분에 펠릿이 형성되도록 합니다. 15 milliliter 튜브에서 팁을 조심스럽게 꺼내 P200 피펫 끝에 장착합니다.파라핀 필름을 제거하고 세포 펠렛을 배양액이 담긴 디쉬에 떠 있는 필터 위로 밀어내어 옮깁니다. 떠 있는 필터 위에서 응집체를 37 °C, 5% CO₂ 조건으로 4~5일 동안 배양합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 응집체를 수집한 후, 이를 합치고 0.5% collagenase를 사용하여 소화시킵니다.해리 후, 5% FBS가 포함된 PBS 2~5 mL를 사용하여 응집체를 세척하고 300 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. FBS, Pen-Strep 또는 L-glutamine이 포함되지 않은 DMEM 500 µL에 응집체를 재부유시킵니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며, 10 ng/mL의 Tepo가 첨가된 1% methylcellulose 배지 3 mL에 현탁액 전체를 첨가합니다.CFU 분석을 위해 이 혼합물을 35 x 10 mm 비처리 배양 접시 3개에 동일한 부피로 분주합니다. 대조군으로 조사된 태반 응집체를 배양합니다. 마지막으로, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 10~14일간 배양한 후 현미경으로 조혈 콜로니 수를 수동으로 측정합니다.MEF를 HSC로 리프로그래밍하는 과정에서, 여기에서 보여주는 것과 같이 전사 인자가 세포에 도입됩니다. 3일간의 확장 및 transgene 활성화를 시작하기 위한 DOX 노출 후, 세포를 분리 및 분할하여 젤라틴 코팅 플레이트에서 보충 조혈 배지로 배양합니다. 리프로그래밍 배지로 형질전환 후 배양 20일째에, 34/H2BGFP MEF는 MEF와는 뚜렷이 구분되는 내피 세포 형태를 포함하여 명확한 형태학적 변화를 나타냅니다.35일까지 추가 배양하면 내피세포 유사 중간체로부터 여러 개의 둥근 조혈모세포 유사 세포가 나타나는데, 이들은 GFP 양성 반응을 보이며 조혈 마커인 Sca1 및 CD45에 대해 양성으로 염색됩니다. 추가 배양 시 세포들은 인간 CD34 리포터의 발현을 유지하면서 CD45를 발현하게 됩니다. 태반 응집 후, 배양된 세포들은 클론 형성 능력을 갖게 되며, 다양한 조혈 형태 및 모세포 유사 세포를 포함하는 콜로니를 메틸셀룰로오스 내에서 생성합니다.이 절차를 시도할 때는 혼동을 피하기 위해 각 단계를 천천히 수행하는 것이 중요합니다. 어떤 실수가 발생하더라도 리프로그래밍을 시작하고 수주가 지날 때까지는 이를 알아차리기 어렵습니다. 이 절차 이후에는, 기능 분석에서 입증된 것처럼 유도된 세포가 진정으로 조혈 기능을 보유하고 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 cobblestone-forming cell assay 및 long-term culture initiating cell assay와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 조혈모세포 프로그래밍 분야의 연구자들은 혈액, 내피 및 기타 세포 유형에서 다른 리프로그래밍 전략과 최적화 프로토콜을 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하신 후, 마우스 섬유아세포에서 조혈성 프로그램을 유도하는 방법, 전사 인자의 과발현, 그리고 유도된 세포의 기능적 분석 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

마우스 배아 섬유아세포는 전사 인자 Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc의 강제 발현에 의해 낮은 효율로 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍할 수 있습니다. 재프로그래밍 반응의 드문 중간체는 세포 표면 제작자 Thy-1.2, Ssea-1 및 Epcam에 대한 항체 표지를 통해 분리된 FACS입니다.

재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

이 프로토콜은 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 혈구 내피 및 다중전위 조혈 전구 세포의 효율적인 유도를 설명합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

생산 유발에 대 한 우리의 프로토콜 여기 제시 erythroid 창시자 (Iep) 성인 섬유 아 세포 전사 인자 제어를 사용 하 여 마우스에서에서 직접 혈통 프로그래밍 (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

배우세요 마우스 배아 섬유 아 세포에서 전사 인자 과발현을 통해 조혈 전구 세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 다능성 단계 없이 직접 재프로그래밍하여 진정한 조혈 줄기 세포를 얻는 새로운 접근법을 제공합니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

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