Name: 교육 연구소에 Lactase 효소 활동 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 학습하세요 락타아제 효소 활성 측정 방법을 생화학 교육용으로. 색소 분석법을 활용해 온도에 따른 효소 반응을 관찰하고 해석하는 실험 기술을 익힐 수 있습니다.

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PAL는 파 킨 슨 병 영국 연구 친교 (그랜트 F1002)에 의해 투자 되었다. 이 일과 MRC 새로운 조사 연구 그랜트 (미스터/L010933/1)에 의해 지원 되었다 MRC 프로그램에 의해 권한을 부여 미스터/N026004/1 PAL, 고 BBSRC 재학 BB/M017222/1 JET. 우리는 그들의 의견 및 입력에 대 한이 실용적인, 그리고 이후 동료의 첫 번째 반복에 대 한 읽기의 대학에서 학생 들 MPharm 파트 1의 2014-15 일대 감사.

참고: 프로토콜 아래 목적 교육 실험실에서 개최 되는 2 시간 (를 포함 하 여 클래스에 워크시트의 완료)의 과정을 통해 개발 되었다. 실험 단계 했다 의도적으로 제외 (실시 모델 데이터를 사용 하 여이 과정의 맥락에서); 효소 활동의 더 상세한 분석을 함께 넣어 그러나-토론에 설명 했 듯이-프로토콜 시간, 시설 및 학생 달성 수준에 따라 고급 분석에 대 한 템플릿을 제공 합니다.
안전:이 실제 실행 되어야 좋은 화학 실험실 연습 (GCLP)의 규칙에 따라-걸린된 실험실 외 투, 안전 안경, 일회용 장갑 등 개인 보호 장비를 착용 한다에 항상 실험실에 .
1. 효소 추출
<ol><li>효소, 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여도 분말의 200 mg를 포함 한 lactase 태블릿 호감.</li>
	<li>"정지"를 붙인 15 mL 튜브에 결과 분말을 놓고 100 mM 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 10 mL에 resuspend.</li>
	<li>소용돌이 1 분 효소 추출 극대화입니다.</li>
	<li>침전 물 고체 입자를 현 탁 액 1.5 mL 원심 분리기 튜브와 10000 x g 에서 1 분 동안 원심 분리기 1 mL 전송.</li>
	<li>"Lactase 추출" 셔 서 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한의 500 µ L를 전송.</li>
</ol>2. 색도계 반응 관찰
<ol><li>1.5 mL 튜브에 100 m m PBS의 장소 390 µ L 이라는 "반응 A".</li>
	<li>Vortexing에 의해 잘 100 µ L 5mm ONPG 솔루션 및 믹스를 추가 합니다. 주의:이 실제 사용 하 여 ortho-Nitrophenol-베타-D-galactopyranoside (ONPG) 유 당에 대 한 대용으로. ONPG 페 놀 화합물 이기 때문에, 그것은 신중 하 게 처리 되어야 합니다. ONPG와 피부 접촉 시 노출 된 피부 즉시 세척 되어야 한다. 모든 유출 적절 한 폐기물 스트림으로 처리를 종이 타 올 즉시 닦아 해야 합니다.</li>
	<li>Vortexing에 의해 잘 반응 A 관 및 혼합 추출 물 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 반응 혼합물을 관찰 하 고 솔루션에 색도계 변경 합니다.</li>
</ol>3. 효소 활동 측정
<ol><li>두 개의 1.5 mL 튜브를 설정: "반응 B" 이라는 "컨트롤"을 표시 한.</li>
	<li>B 관, 제어 튜브를 100 m m PBS의 400 µ L 반응에 100mm PBS의 390 µ L을 추가 하 고 각 튜브를 100 µ L 5 m ONPG m의 추가.</li>
	<li>Vortexing에 의해 내용을 혼합.</li>
	<li>반응 B 관에 lactase 추출의 10 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 반응 실내 온도에서 1 분 동안 진행을 허용.</li>
	<li>1 분이 경과 되 면 반응 함으로써 종료 pH를 증가 하 여 lactase 효소를 억제 하기 위해 두 튜브를 1 M 탄산 나트륨의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 분 광 광도 계 큐 벳에 각 관에서 500 µ L를 전송 하 고 420에서 흡 광도 측정 nm은 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
	<li>B 반응과 컨트롤 샘플에 대 한 흡 광도 및 반응 값을 파생 하는 ONPG의 활성 효소의 가수분해로 인해 흡 광도 있는 변화에서 컨트롤 값을 뺍니다.</li>
</ol>4입니다. 효소 활동에 온도 효과
<ol><li>섹션 3에에서 설명 된 대로 3 제어 튜브 및 3 개의 반응 관을 설정 하 고 이러한 레이블 "4 ° C", "방 온도", 그리고 "37 ° C".</li>
	<li>효소의 추가 따라 추출, 얼음, 실내 온도에, 및 37 ° c (에서 미리가 열된 물 욕조)에 대 한 튜브를 품 어.</li>
	<li>다음 각 튜브를 1 M 탄산 나트륨의 500 µ L을 추가 하 여 반응을 종료 1 분을 반응 수 있습니다.</li>
	<li>420에 흡 광도 측정 섹션 3에에서 설명 된 대로 각 튜브에 대 한 nm. 각 경우에 반응 값에서 컨트롤 값을 뺀 값을 기록 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+JM+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 8th, Palgrave Macmillan. (2015).</li>
<li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red%3A+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li>
<li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li>
<li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+%28lacZ%29+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li>
<li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li>
<li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li>
<li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+intolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li>
<li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li>
<li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li>
<li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li>
<li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Laboratory+Technology%22%5BJournal%5D)">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li>
<li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed063p242">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242(1986).</li>
</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

효소, 효소 반응 및 효소 활동의 이해와 상세한 지식은 생물학, 의학 및 약 학에 걸친 주제의 넓은 범위에 대 한 필요 합니다. 위에서 설명한 프로토콜 보여주는 더 많은 고급 실험실 기반 실험에 사용할 수 있는 핵심 기술을 제공 하는 효소 반응에 대 한 인간의 건강에 관련 된 효소의 예를 들어 lactase를 사용 합니다.
이 프로토콜 시간의 짧은 공간에서 해석할 결과를 거의 또는 전혀 젖은 실험실 경험을 가진 가능한, 허용 학생 수를 의도적으로 설계 되었습니다. 2014/2015 학년도 약 학 대학의 독서 학교에서 총 144 학생, 3의 그룹으로 구성 된 모든 그룹이 lactase 정제에서 효소 활동의 어느 정도 감지할 수 있는 "lactase 측정" 실험 실시 추출합니다.
이 프로토콜에서 중요 한 단계는 여러 가지가 있습니다. 첫째, 초기 추출 후속 분석을 위해 충분 한 활성 효소의 가용 화를 수 있도록 효율적이 필수적 이다.입니다. 우리의 경험에서는, 첫 해 대학생이 달성할 수 있는 설명;는 프로토콜에 따라 그러나 실험실 논증 자에서 몇 가지 지침이 시점에서 필요 했다. 자명한 포인트 것입니다, 하지만이 프로토콜의 성공에 핵심 요소 신중 하 게 볼륨을 측정, 올바르게 레이블 튜브 및 지시의 수입니다. 동안 많은 학생 들, 주의 깊은 모니터링과의 확실 하지 않은 경우에 도움을 요청 하는 학생에 대 한 취소 요청에 대 한 일정 정도의 능력을 추측 될 수 있다 무엇을 해야할지 다음 성공적인 분석 결과의 가장 큰 가능성을 제공 합니다.
학생 평가 클래스에 워크시트 (보충 자료로 사용 가능), 학생 들이 참고 실험, 그들의 결과 배경 정보/읽기 강의 자료에서 개인에서에서 데이터를 요청 하거나 더 밖으로 실행 될 수 있다 자세한 모델 데이터 제공 시도 하 고 평가 하는 운동 분석에 대 한 허용 클래스 평가에서.
여기에 소개 하는 프로토콜은 가르치는 실험실 조건에서 lactase 활동 분석 결과의 간단한 예 이며 고급 분석을 허용 하는 실험의 복잡성이 증가 하는 충분 한 기회. 특히, 제시 프로토콜에서는 효소 활동의 개념을 소개 하지만 실험 데이터의 운동 분석을 허용 하지 않습니다. 이와 같이, 우리가 세밀 하 게 특정 목표와 학생 코 호트 사업 실험의 재능에 맞게 적응와 클래스에 대 한 초기 템플릿으로 설명된 프로토콜 보기 권하고 싶습니다. 확장 된 실험의 예 포함 될 수 있습니다: 서로 다른 온도에서 통계 분석, 운동 데이터를 분석 (생화학 학생/전공 적합), 시작 수 있도록 다른 기질 농도 사용 하 여 측정 반복 여러 다른 정제 및 효소 (제어 정제, 법의학 과학 학생/전공 적합의 추가)와 함께 각각의 다른 활동 평가, 열 변성의 영향을 평가 또는 경쟁 수행 유의 추가 또는 억제제 lactase (표 1)의 실험. Lactase의 운동 분석에 대 한 자세한 프로토콜 이전 게시12되었습니다.
이 프로토콜의 중요 한 강도 의학에서 enzymology의 진짜-생활 사례 연구와 함께 enzymology 및 효소 활동에 대 한 기본적인 소개는 결합입니다. 이것은이 실험실 의학, 약 학, 생물 의학 및 관련된 과목의 학생 들에 게 특정 한 관련성의 실험. 중요 한 것은, 심각한 건강 상태와 관련 된 유 당 놓과 더 광범위 한 식이 문제는 사실 다양 한 학생 들과 의료 및 윤리적인 문제를 기회를 제공 한다. 이 의료 조건에 대 한 유전자 검사를 둘러싼 문제를 포함할 수 있습니다 및 유전자 치료 및 유전 상담, 뿐 아니라 사용과의 약 보조 식품의 판매에 관련 된 토론. 한 가지 주요 한계는 프로토콜 추출에 사용 된 시작 물자로 인해 효소 농도의 정확한 예측에 대 한 허용 하지 않습니다. 그러나, 수정이를 담당 하는 시 약 학년 효소를 사용 하 여 분석 결과 대 한 것. 중요 한 것은,이 것 또한 lactase 효소에 대 한 속도의 더 정확한 계산에 대 한 허용.
결론적으로, 활동 시 금 교육 연구소에 lactase의 환경 소개를 제공 합니다 강력 하 고 매력적인 하 고 재미 있는 분야에 효소 생물학의 초기 단계에 대 한 대학생.

효소는 특수 유형의 생활에서 화학 반응에 대 한 생물학적 촉매 역할 단백질 유기 체1. 효소의 활동은 생활, 에너지 제공, 폐기물의 처분 및 유기 체 기능을 수 있도록 중요 합니다. 따라서, 이해 효소는 생활의 완전 한 이해에 중요 합니다. 이러한 지식은 다양 한 의료 과학에서 생물학에 이르기까지 대학 수준의 학위 프로그램에 대 한 필수적입니다. 효소 반응의 속성은의 실제적인 경험에 손에 의해 비로소 최고의 촉매의 원리에서 효소 활동의 이론적 모델에 이르기까지 자세한 배경 독서 자료와 강의 사용 하 여 학생 들에 게 제공 될 수 있다, 하는 동안 행동에 효소 이전2를 시연 했다. 이 프로토콜 제공 인간의 영양 및 건강에 관련 된 활동으로 효소의 예를 들어 lactase를 사용 하 여 실험실 조건 하에서 효소의 활동을 측정 하기 위한 실험 패러다임에 따라 간단을 합니다.
Glycosidic 가수분해 효소 락 타 아 제 (적 능력 3.2.1.23/26) 이다 효소 포유류3중앙 영양 중요성의. Lactase의 활동 높은 진화를 통해 보존 하 고 효소의 베타-galactosidase 가족에서 파생- 호모 사피엔스 (그림 1, PDB 1JZ8)4를 통해 대장균 에서 현재 가족. 인간 영양에 lactase의 중요 구성 단 당 류 구성, 시체에서 에너지를 생성 하기 위해 사용할 수 있는 유 당 분해를 허용 하는 역할에서 유래. Lactase catalyzes이 당 유 당, 갈 락 토스와 포도 당 (그림 2) 방출에 있는 glycosidic 유대의 가수분해5. 이 단은 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 통해 6구 연산 산 성 주기 및 산화 인 산화 생성을 위해 주로 사용 됩니다. 신생아 및 유아 개발, lactase은 인간의 소화 시스템, 유 방 우유는 유 당입니다 기본 탄수화물 구성 요소, 그리고 영양의 주요 소스 중 하나 초기 동안 에서 받은 유 당을 무 너 뜨에 매우 표현 7. 선천적인 lactase 결핍증 (CLD), lactase 효소8코딩 lactase 유전자 (LCT)에 돌연변이 의해 발생 한 드문 상 염색체 열성 상태에 의해 lactase의 의학 중요성 강조. CLD와 새로운 태어난 아기 전시 거의 lactase 활동, 따라서 그들은 유 방 우유, 모든 다른 종류의 우유, 또는 유 당을 포함 하는 수식에 먹이 수 없습니다.
어린 시절, 동안 lactase 식 일반적으로 감소 된다; 그러나,이 감소 이유 다음 효소9표현 하 성인 전세계 계속의 약 35% 지리적으로, 변화 한다. Lactase, lactase 지 속성로 알려진의 지속적인된 표현 계속 다양 한 소스에서에서 우유 및 낙농 제품을 소화 하는 개인을 허용 한다. 반대로, 유 당 편협로 알려진 또한 성인 형 hypolactasia (ATH) 용기에 유 당을 분해 하는 무 능력에서 유래 lactase 식의 손실 될 수 있습니다. ATH는 빌드를 유 당 유 당 포함 된 식품의 섭취 다음 콜론에서의 특징 이다. 콜론, 축적 된 유 당 창 자 미생물 동물군, 수소, 메탄, 이산화탄소 등 가스를 방출 하 여 발효 이다. Lactase 효소 부족으로 개인에이 가스의 생산 촉진 복 부 bloating, 증가 자만심, 고통, 구역 질, 및 borborygmi (위 소리)7. 유 당 소화 관에서의 증가 수준을 또한 느슨한 발판 이어질 수 있습니다.
LCT 유전자 발현의 통제는 근처 MCM6 유전자의 introns에 있는 동 질 다 상으로 변조 됩니다. Lactase의 지속적인 식이 개인 수행 따라서 이유, 하는 동안 LCT 전사의 규정 아래 정상적인 보상 LCT 유전자 발현에 대 한 강한 원심 강화 기능 동 질 다 상 그리고 결과적으로 성인3유지 lactase 식입니다. 증강 동 질 다 상 긍정적으로 선택 된 가축과 낙 타 중동 지역에서의 순화에 따라 5 천 년 전을 제안 되었습니다9,10.
예를 들어 식단에서 유제품을 제거 하 여 유 당 섭취를 줄여 ATH에서 발생 하는 증상을 관리할 수 있습니다. ATH에 대 한 다른 접근 방법 및 CLD 위한 선택의 접근 lactase 보충, 약국에서 널리 사용할 수의 사용 이다. 이러한 보충제 lactase 촬영 하거나 유 당 포함 된 음식에 추가 수 있는 액체 또는 알 약 형태로 효 모와 박테리아 등의 다양 한 절연을 제공 합니다. 보충 유 당을 포도 당과 갈 락 토스 제품, 따라서 그들의 흡수를 허용 하 고 창 자에서 소화 되지 않은 유 당 기판의 축적을 방지 하는 식품에 존재의 비율은 것 이다.
규정식 도움으로 lactase 보충의 사용을 바탕으로, 첫 해 생물 의학 과학 또는 약 학 학생에 적합 한 간단한 enzymology 실험실 실험을 개발 했습니다. 이 실험실 실험은 상용 lactase 보충, 그리고 사용 하는 직교 활용-nitrophenol-베타-D-galactopyranoside (ONPG) lactase ( 여 glycosidic의 분열을 측정 하기 위한 색도계 끝점을 제공 하 그림 3)11. ONPG 역할 lactase 위한 인공 기질이 있는이 효소에 의해 가수분해 생산 직 nitrophenol D-갈 락 토스를 때. 후자의 제품은 노란색, 흡수 하는 420의 파장에 빛 nm. 420 nm 다음에서 흡 광도 변화를 측정 하 여 lactase ONPG의 노출,이 효소의 활동을 예측 가능 하다. 이 실험실 실험 효소 가수분해 효소 활동의 데모를 제공합니다. 추가 복제에서 서로 다른 조건에서 분석 실험을 수행 함으로써, 효소 반응 속도 론, 인간의 건강에 관련 된 행동에 효소의 귀중 한 실제 예제를 제공의 더 정교한 분석을 통합 가능 하다.

<table><tbody><tr><td>락타아제 정제</td><td>Lamberts</td><td>8511-60</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(분말)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>탈이온수에 용해되어 최종 농도 100mM까지</td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma</td><td>N1127</td><td>탈이온수에 용해되어 최종 농도 5mM까지</td></tr> 탄<tr><td>산나트륨</td><td>Sigma</td><td>451614</td><td>탈이온수에 용해되어 최종 농도 1M까지</td></tr><tr><td>탈 이온수</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>유봉 및 박격포</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Jenway 6315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계 큐벳</td><td>Jenway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex genie 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Thermo-Scientific</td> 저울 Thermo-Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

교육 연구소에 lactase 효소 활동 측정

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

효소를 작동 하는 방법, 이해 하 고 실제 사례에이 관련 된 다양 한 생물 학적 및 생물 의학 과학에 있는 학사 학위에 중대 하다. 이 따라 쉽게 첫 해 학부 약 학 학생에 대 한 개발 되었다 프로토콜과 효소 분석에 대 한 효소 반응 및 분석 절차에 엔트리 레벨 소개를 제공 합니다. 선택의 효소는 lactase,이 인간의 질병/제약 연습에 관련 된 상업적으로 이용 가능한 효소의 예를 나타냅니다. Lactase 식이 보충 정제에서 추출 되 고 lactase는 인공 기판의 가수분해에 따라 색도계 분석 결과 사용 하 여 평가 (ortho-nitrophenol-베타-D-galactopyranoside, ONPG). 직교 nitrophenol ONPG의 가수분해 분열 lactase 다음의 릴리스 420에 흡 광도 있는 변화에 의해 측정 됩니다, 그리고 및 효소 반응에 온도 효과 얼음, 실내 온도에 37에 반응 밖으로 운반 하 여 평가 ° C. 고급 분석은 다른 조건 하에서 효소의 활동을 평가 하 고 다른 시 약을 사용 하 여이 프로토콜을 사용 하 여 구현할 수 있습니다.

프로토콜의 섹션 2에 대 한 대표적인 결과 그림 4A에 표시 됩니다. Lactase 정제에서 추출 포함 된 반응 솔루션으로 ONPG 방출 분해는 노란색 동안 제어 반응 lactase 효소의 부재에서 명확한 남아 직교-nitrophenol. 그림 4B 정량화는 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플의 다음과 같은 분석 프로토콜의 섹션 4에서 임의의 단위를 사용 하 여 표시 합니다. 직교 nitrophenol의 생산은 반응은 얼음에 알을 품을 때 최저 / 최고 반응 37 ° c.에 실시
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> 그림 1 : 대장균 베타-galactosidase. (A)에서 대장균, 복잡 한 활성의 tetrameric 구조를 보여주는 베타-galactosidase의 결정 구조. (B) Allolactose (빨간색으로 표시)의 베타-galactosidase 활성 사이트에 바인딩된. PDB 1JZ84에서 생성 된 이미지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> 그림 2 : 의 lactase 효소 행동. 베타-D-갈 락 토스와 베타-D-포도 당을 생산 lactase에 의해 유 당 가수분해. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> 그림 3 : 의 직교 가수분해-nitrophenol- 베타 -D galactopyranoside. Lactase 베타-D-갈 락 토스와 직교-nitrophenol (색상에 노란색이), 420에 흡 광도의 측정에 의해 lactase의 활동의 추정을 허용 하 여 ONPG 가수분해 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> 그림 4 : ONPG 가수분해. ONPG 가수분해의 대표적인 결과, 420에 임의의 단위로 원시 흡 광도 보여주는 클래스에 워크시트에 기록 제어 및 반응 튜브 (A) 및 프로토콜의 섹션 4에서 대표 데이터를 보여주는 nm, 배경에 대 한 수정 및 3 다른 온도 (B)에서 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>실험 조건</td>
			<td>실험 변수</td>
		</tr>
<tr>
<td>온도</td>
			<td>0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>기질 농도</td>
			<td>0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>경쟁 저해</td>
			<td>5 mM ONPG 플러스 0 m m, 1 mM, 5 m m 또는 10 m m 유 당</td>
		</tr>
<tr>
<td>시간 의존</td>
			<td>0 s, 15, 30 s, 1 분, 5 분, 10 분, 20 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>열 변성</td>
			<td>Lactase 추출 시험 하기 10 분 전에 100 ° C에가 열</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 실험 상태를 확장 하는 잠재력. Lactase 생물학의 특정 측면을 조사 하는 3 중에 실시 하는 확장된 실험을 제안 했다.

Lactase의 효소 활동의이 당 유 당 catabolic 처리를 위해 필수적 이다. 여기, 식이 보조 제에 lactase의 활동 색도계 분석 결과 사용 하 여 분석 이다. 이 lactase, 효소 활동의 활동을 이해 하기 위한 실험 플랫폼으로 학생을 제공 합니다.

교육 연구소에 Lactase 효소 활동 측정

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

이 방법은 학생들에게 효소 반응을 제어하는 개념을 소개하는 유용한 도구입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 습식 실험실 경험이 거의 없는 학생들에게 적합하여 학생들이 관찰하고 해석할 수 있는 강력한 결과를 제공한다는 것입니다. 프로토콜을 시작하려면 15ml 튜브 서스펜션에 레이블을 지정합니다.효소 200mg이 함유된 락타아제 정제 1정을 절구와 절굿공이를 사용하여 균일한 분말로 부수십시오. 생성된 분말을 라벨이 부착된 튜브에 넣고 100밀리리터의 100밀리몰 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 다시 현탁합니다. 효소 추출을 최대화하기 위해 용액을 1분 동안 소용돌이치십시오.다음으로, 현탁액에서 1.5 밀리리터 관으로 1 밀리리터를 옮기고 10, 000 번 G로 1 분 동안 샘플을 회전시켜 고체 입자를 침전시킵니다. 500 마이크로리터의 상층액을 락타아제 추출물이라고 표시된 깨끗한 1.5 ml 튜브에 전달합니다. 100 밀리 몰 PBS의 390 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 튜브라고 표시된 반응 A.에 넣은 다음 100 마이크로 리터의 5 밀리 몰 ONPG 용액을 넣고 와류로 잘 섞습니다.추출물 10마이크로리터를 반응 A 튜브에 넣고 내용물을 와류로 만듭니다. 5분 동안 반응 혼합물을 자주 관찰하고 용액의 비색 변화를 기록하십시오. 두 개의 1.5 밀리리터 튜브를 설정하는데, 하나는 반응 B라고 표시되고 다른 하나는 대조군이라고 표시됩니다.반응 B 튜브에 100 밀리몰 PBS 390 마이크로리터, 100 밀리몰 PBS 400 마이크로리터를 제어 튜브에 추가한 다음 각 튜브에 5 밀리몰 ONPG 100 마이크로리터를 추가합니다. 볼텍싱으로 내용물을 혼합합니다. 반응 B 튜브에 10마이크로리터의 락타아제 추출물을 첨가하고 볼텍싱으로 혼합한 후 실온에서 1분 동안 반응을 진행시킵니다.1분이 경과하면 500마이크로리터의 1몰 탄산나트륨을 두 튜브에 첨가하여 pH를 증가시켜 반응을 중지함으로써 락타아제 효소를 억제합니다. 각 튜브에서 500마이크로리터를 깨끗한 분광 광도계 큐벳으로 옮기고 420나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 3개의 제어 튜브와 3개의 반응 튜브를 설정하고 섭씨 4도, 실온 및 섭씨 37도로 표시합니다.효소 추출물을 첨가한 후 튜브 1개를 얼음 위에, 1개는 실온에서, 다른 튜브 1개는 섭씨 37도의 예열된 수조에서 1분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 튜브에 500마이크로리터의 1몰 탄산나트륨을 첨가하여 반응을 중지합니다. 각 튜브에 대해 420나노미터에서 흡광도를 측정합니다.각 경우에 반응 값에서 제어 값을 빼고 값을 기록합니다. 프로토콜을 사용하면 ONPG가 가수분해되어 오르토 니트로페놀(ortho nitrophenol)이 방출됨에 따라 락타아제 정제의 추출물을 포함하는 반응 용액이 노란색으로 변하는 동안 대조군이 명확하게 유지됩니다. 분광 광도계를 사용하여 샘플을 분석 한 결과, 오르토 니트로 페놀의 생산은 얼음에서 반응을 배양 할 때 가장 낮고 섭씨 37도에서 반응을 수행 할 때 가장 높습니다.이 절차를 시도하는 동안 효소 추출물을 추가하기 전에 적절한 온도에서 반응을 일으키는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab(교육 실험실에서 락타아제 효소 활성) 측정

inducible 리진 탈카복실화효소의 활동은 톨루엔에 차등 용해도를 부가물을 형성 2,4,6 - trinitrobenzensulfonic의 소산으로 기판 L - 라이신과 제품 cadaverine을 반응에 의해 모니터링됩니다.

의 활동을 측정하는 어세이 대장균은 라이신 Decarboxyase을 Inducible

이 비디오는 젖산 탈수소효소를 사용하여 세포 용해물에서 젖산을 측정하기 위한 비색 분석에 대해 설명합니다. 이 효소는 젖산을 피루브산으로 변환하고, NAD를 테트라졸륨 염료와 반응하는 NADH로 변환하여 젖산을 정량화하기 위해 분광 광도계로 측정할 수 있는 착색 제품을 제공합니다.

테스트 샘플에서 젖산의 정량화를 위한 비색 분석

이 비디오는 포유류 세포에서 벌크 자가포식 격리 활성을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 전기천공법을 활용하여 젖산 탈수소효소(LDH)를 포함한 세포질 단백질을 방출합니다. 격리된 LDH 및 총 세포 LDH 분획은 LDH 격리를 평가하기 위해 결정되어 전체 벌크 격리 활성에 대한 통찰력을 제공합니다.

포유류 세포에서 벌크 자가포식 격리 활성(Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells) 정량화

이 동영상은 합성 4-메틸룸벨리페릴 기질을 사용하여 샘플에서 α-갈락토시다아제 A 및 산 α-글루코시다아제에 대한 효소 활성의 체외 측정을 보여줍니다.

α-갈락토시다아제 A 및 산 α-글루코시다아제 효소 활성의 체외 측정

우리는 생리 학적 및 병리학 관련 자극에 포상 세포 칼슘 신호와 세포의 손상을 검사의 목적을 위해 마우스에서 마우스의 췌장 포상 세포를 제조하는 재생 방법을 설명합니다. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

우리 nicotinatmide 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NAD(P)H) + H + 조직 샘플에서 직접 생성 하는 효소 효소 활동의 공간적 분포를 매핑하기 위한 프로토콜 설명.

매핑 대사: 조직에서 직접 젖 산 효소 활동 모니터링

조작된 nanomaterials에 독의 검출 nanomedicine 분야에서 대상 과제 중 하나를 나타냅니다. 여기, 우리는 나노 입자에서 잠재적인 내 오염 추정 세 가지 다른 랄 형식으로 구성 된 프레임 워크를 설명 하는 사례 연구를 제시.

나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여

효소 활동의 열 안정성은 쉽게 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 측정 됩니다. 대부분 단백질 안정성 분석 실험은 현재 측정 단백질 전개, 사용 하지만 효소 활동에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. ITC의 효소 활동의 안정성에 효소 수정 효과의 직접 측정을 수 있습니다.

등온선 적정 열 량 효소 안정성 측정

렌즈 개발은 다른 조직과 상호 작용을 포함한다. 여러 zebrafish 아이 돌연변이 비정상적으로 작은 렌즈의 크기가 특징입니다. 여기 우리는이 표현형은 본질적 원인이나 렌즈를 둘러싸고있는 조직과 결함이 상호 작용에 의한 있는지 여부를 확인하기 위해 렌즈 이식 실험을 보여줍니다.

렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

불안과 관련된 장애 (인트 리피드)의 치료를위한 가상 현실 지능형 멀티 센서 시스템에있는 프로젝트는 불안 관련 장애의 치료를위한 멀티 센서 컨텍스트 인식 가상 현실 시스템을 개발 목표로하고 있습니다.

임상 가상 현실의 생체 자기 제어의 사용 인트 리피드 프로젝트

학습하세요 락타아제 효소 활성 측정 방법을 생화학 교육용으로. 색소 분석법을 활용해 온도에 따른 효소 반응을 관찰하고 해석하는 실험 기술을 익힐 수 있습니다.

교육 연구소에 Lactase 효소 활동 측정

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