단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계
2016년 8월 13일
유체 구성 요소와 통합된 미세 가공 장치는 생체 내 미세 환경을 모방한 세포 연구를 위한 체외 플랫폼을 제공합니다. 우리는 단일 또는 공존하는 화학적/전기적/전단 응력 자극 하에서 세포 반응을 연구하기 위해 폴리메틸메타크릴레이트 기반 미세유체 칩을 개발했습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 세포가 환경 자극에 어떻게 반응하는지 관찰하기 위한 미세유체 장치를 설계하고 제작하는 것입니다. 이 방법은 화학 물질, 전단 응력, 전기장 등 다양한 환경 자극 하에서 세포가 어떻게 반응하는지와 같이 세포 생물학 및 생체 의학 공학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 튜브를 쉽게 제작하고 조립할 수 있다는 점입니다. 또한 이러한 미세유체 장치는 매우 뛰어난 성능으로 인비보(in-vivo) 조건을 구현할 수 있습니다. 이 절차의 시연은 저희 실험실의 학부생인 Tzu-Yuan Chou와 Dr. Julian Chung 실험실의 포스트닥터인 Hsien-San Hou가 맡게 됩니다. 먼저, 이산화탄소 레이저 스크라이버를 켜고 컴퓨터와의 연결 상태를 확인하십시오. 그런 다음 여기 표시된 패턴 중 하나와 같이 미리 그려진 크리스마스 트리 패턴을 스크라이버에 로드하십시오. 다음으로, PMMA 시트나 양면테이프 조각을 스크라이버 스테이지 위에 놓으십시오. 캘리브레이션 바와 가시 헬륨-네온 레이저를 사용하여 이산화탄소 레이저의 초점을 조정하십시오. 그런 다음 기판에 패턴을 새기십시오. 완료되면 패턴 기판을 들어 올려 불필요한 조각을 제거하고, 질소 스트림을 사용하여 표면에 남아 있는 잔해를 세척하십시오. 칩의 각 구성 요소에 대해 이 과정을 반복하십시오. 화학 전단 응력 미세유체 칩을 조립하십시오. 이를 위해 두 조각의 새겨진 양면테이프를 사용하여 화학 전단 응력 패턴이 형성된 PMMA 시트 세 장을 부착하십시오. 나사산과 구멍을 맞춘 후, 순간접착제를 사용하여 나사산이 있는 아크릴 어댑터를 칩의 가장 상단 PMMA 층에 부착하십시오. 이 어댑터들은 배지 입구, 출구 및 염다리(salt bridge) 커넥터 역할을 합니다. 그런 다음 칩 바닥에 0.7 mm 두께의 양면테이프를 한 장 더 추가하고, 칩을 10 cm 직경의 페트리 접시에 부착하십시오. 조립이 완료되면 칩을 진공 챔버에 넣어 하룻밤 동안 보관하십시오. 이제 화학-전기장 칩을 조립하십시오. 화학-전기장 칩을 위해 새겨진 PMMA 시트를 양면테이프로 10 cm 직경의 페트리 접시에 부착하십시오. 칩을 사용하기 전에 30분 동안 UV에 노출시켜 멸균하십시오. 다음으로, 플라스틱 튜브와 핑거 타이트 너트를 통해 칩의 입구를 3 ml PBS가 채워진 주사기에 연결하십시오. 같은 방식으로 출구를 폐액 튜브에 연결하십시오. 주사기의 플런저를 천천히 눌러 유체 채널에 PBS를 채우십시오(프라이밍). 주사기를 앞뒤로 밀어 기포를 제거한 다음, 칩을 인큐베이터에 넣어 하룻밤 동안 보관하십시오. 화학-전기장 칩을 설정하려면, 튜브형 너트에 3% agarose를 채워 염다리를 설정하십시오. 그런 다음 은/염화은(silver silver chloride) 전극을 튜브형 너트에 넣으십시오. 10% FBS가 보충된 D-MEM에서 폐암 CL1-5 세포를 90% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 배양하십시오. 그런 다음 배지를 흡입하여 제거하십시오. 미리 데워진 PBS로 세포를 한 번 세척하십시오. 그리고 10 cm 직경의 플레이트에 0.5% trypsin 완충액 2 ml를 추가하십시오. 세포를 다시 37
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개요
본 연구는 생체 내(in vivo) 미세환경을 밀접하게 모방하여 세포 연구를 위한 인비트로(in vitro) 플랫폼을 구현하는, 유체 구성 요소가 통합된 미세 가공 장치를 제시합니다. 본 연구는 다양한 자극에 대한 세포 반응을 조사하기 위해 설계된 폴리메틸메타크릴레이트 기반의 미세유체 칩에 중점을 둡니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미세유체기술
- 세포생물학
- 인 비트로 연구
배경
- 미세 가공 장치는 세포 환경 연구를 향상시킵니다.
- 유체 구성 요소는 실험 조건의 정밀한 제어를 가능하게 합니다.
- 세포 반응을 이해하는 것은 다양한 생물학적 응용 분야에서 매우 중요합니다.
- Polymethylmethacrylate는 미세 유체 응용 분야에 다용도로 사용되는 재료입니다.
연구 목적
- 제어된 환경에서 세포 반응을 연구하기 위한 플랫폼을 개발하는 것.
- 미세유체 기술을 사용하여 생체 내(in vivo) 조건을 모사하는 것.
- 화학적, 전기적 및 전단 응력 자극이 세포에 미치는 영향을 조사하는 것.
사용된 방법
- 폴리메틸메타크릴레이트를 이용한 미세유체 칩의 설계 및 제작.
- 실험 제어 능력 향상을 위한 유체 구성 요소의 통합.
- 세포 반응 평가를 위한 다양한 자극의 적용.
- in vivo 조건을 모사하기 위한 in vitro 실험.
주요 결과
- 세포 연구를 위한 미세유체 칩의 성공적인 개발.
- 환경 조건을 효과적으로 제어할 수 있는 능력을 입증함.
- 다양한 자극에 대한 뚜렷한 세포 반응을 관찰함.
- 세포와 미세 환경 간의 상호작용에 대한 통찰력을 제공함.
결론
- 미세유체 플랫폼은 세포 행동을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
- 연구 결과는 제어된 환경에서의 세포 반응에 대한 이해에 기여합니다.
- 향후 응용 분야에는 약물 테스트 및 질병 모델링이 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
화학적, 전기적 및 전단 응력 자극을 정밀하게 제어할 수 있는 미세유체 플랫폼은 복잡한 생체 내(in vivo) 미세환경을 모방함으로써, 표적 검증의 리스크를 낮추는 확장 가능한 바이오 제약 R&D 접근 방식을 제공합니다. 이러한 PMMA 기반 장치들은 공존하는 자극 하에서 세포 반응을 스크리닝하는 실험 처리량을 높여, 초기 발견 단계에서 기전적 통찰력을 제공합니다. 이 기술은 리드 화합물 도출에 자원을 투입하기 전, 보다 높은 예측 신뢰도를 가진 표적의 우선순위를 정하는 데 도움을 줍니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 화학적 구배, 전기장 및 전단 응력에 대한 세포 반응 조사를 가능하게 하여 질병 메커니즘에서 경로 관여도를 명확히 합니다.
- 운영적 가치: PMMA 기판을 통해 레이저 어블레이션(laser ablation)을 이용한 저비용의 신속한 제작이 가능하며, 이는 표적 가설 검증을 위한 반복적 설계를 지원합니다.
- 예측적 가치: 정의된 자극 하에서의 활성 산소종 생성 및 세포 이동을 정량화하여, 표적 위험 제거(de-risking)를 위한 기능적 판독값을 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 전단 응력 또는 전기장 구배를 동반한 5가지 농도 구배를 생성하여, 단일 장치에서 다중 파라미터 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 다중 자극 조건을 통합함으로써 실험 반복 횟수를 줄여, 화합물 또는 siRNA 라이브러리 스크리닝의 분석 효율을 향상시킵니다.
- 확장성: 표준 현미경 관찰 및 배양 워크플로우와 호환되어, 스크리닝 캐스케이드로의 도입이 용이합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: 미세환경 주도 표현형을 연구하기 위해 질환 관련 모델인 폐암 CL1-5 세포를 사용합니다.
- 기전적 리스크 감소: 화학적, 전기적 및 기계적 자극이 세포 반응에 기여하는 바를 분리하여 분석함으로써 병용 요법 전략 수립에 정보를 제공합니다.
- 전임상 정렬: 이동성 및 산화 스트레스와 같은 출력값은 전이 및 침습성과 관련된 주요 특징들과 상관관계를 보입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 미세유체 칩은 정량적이고 자극 반응적인 세포 표현형을 제공함으로써 타겟 검증과 초기 리드 스크리닝을 연결하는 발견 단계의 분석 플랫폼 역할을 합니다.
- 발견 생물학: 암 및 기타 질병 모델에서 미세환경 신호가 세포 행동을 어떻게 조절하는지에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 화학 물질 농도 및 물리적 자극 구배에 따른 세포 반응의 병렬 테스트를 가능하게 하여 실험당 데이터 밀도를 높입니다.
- 분석: 객관적인 비교를 위해 형광 기반 ROS 검출 및 타임랩스 이동 지표를 포함한 측정 가능한 결과물을 생성합니다.
- 중개 연구: 전이성 폐암 세포주를 사용하여 미세환경 반응과 질병 관련 침습성 표현형 간의 연관성을 분석합니다.
- 기업적 재사용: PMMA 기반 설계로 실험실 및 프로젝트 간 복제가 가능하여, 기계생물학 또는 약리학 연구에서 일관된 자극 전달이 가능합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 단일 또는 공존 자극의 제어된 적용을 가능하게 하여 변수별 기여도를 분리함으로써 기전상의 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 재현 가능한 구배 생성을 통해 자극 전달을 표준화하여, 반복 실험 간의 변동성을 최소화합니다.
- 전략적 가치: 생리학적으로 유의미한 조건에서 다중 파라미터 효능 및 독성 판독값을 제공함으로써 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 자극 특이적 세포 반응을 조절하는 화합물을 식별하여 리스크 조정 타겟 우선순위 설정을 지원합니다.
구현 시 고려 사항
- 미세유체 설계, PMMA의 레이저 어블레이션 및 유체 인터페이스 조립에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- CO2 레이저 스크라이버, UV 멸균 및 주사기와 튜빙 같은 유체 프라이밍 장비의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 팀 간의 세포 파종, 자극 적용 타이밍 및 판독 정규화의 표준화가 필요합니다.
- 다른 세포 유형에 적용할 경우, 전단 응력과 구배 무결성을 유지하기 위해 채널 크기와 유속의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실제적인 제한 사항으로는 프로토콜에 언급된 바와 같이 프라이밍 중 기포 형성 및 전기장 설정 시 전극 박리가 있습니다.
