Name: 단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 학습하세요 화학, 전기, 전단 응력 자극에서 세포 응답을 관찰하기 위한 폴리메틸메타크릴레이트 기반 미세유체 칩 설계 및 제작 방법을. 이 기술은 생체 내 미세환경을 모방하여 세포 행동 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 계약 번호에 따라 대만 과학기술부의 재정 지원을 받았습니다. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), 아니오. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun) 및 National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). 저자는 또한 세포 배양실을 사용한 국립 대만 대학의 신흥 재료 및 첨단 장치 센터(Center for Emerging Material and Advanced Devices)에 감사를 표합니다.

1. 칩 설계 및 제조 <ol><li> 그리기 패턴은 상용 소프트웨어 (24)를 사용하여 PMMA 기판 및 양면 테이프에 절제합니다. <ol><li> 다섯 배양 영역 (도 1a 및도 1b)의 각각의 말단에 가변 폭의 &quot;크리스마스 트리&quot;패턴을 그리는, 화학 농도 및 전단 응력의 ​​효과를 연구한다. </li><li> 소금 교량이 더 유체 채널 (그림 2A와 2B)와 &quot;크리스마스 트리&quot;패턴을 그려, 화학 물질 농도와 전기장의 효과를 연구합니다. </li></ol></li><li> 스크 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 시트 또는 CO 2 레이저 스크 라이버에 해당 파일을로드하여 양면 테이프의 개별 패턴입니다. <ol><li> 레이저 스크 라이버를 켜고 컴퓨터와의 연결을 확인합니다. 패턴을 열고하면 상용 소프트웨어를 사용하여 절제합니다. </li><li> 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 시트 또는 양면 테이프 (을)를 배치스크 라이버의 무대 n 개의 탑. 교정 바와 가시 He-Ne 레이저를 사용하여 필요에 CO 2 레이저의 초점을 조정한다. </li><li> PMMA 시트 또는 테이프에 절제의 스크 라이버로 패턴을로드합니다. </li><li> , 디자인 시트 또는 테이프를 들고 불필요한 부분을 제거하고 질소 불고와 표면을 청소합니다. 주 : PMMA 시트의 두께는 1 mm이고, 상기 양면 테이프의 0.07 mm 또는 0.22 mm이다. </li></ol></li></ol> 2. 칩 조립 <ol><li> 슈퍼 접착제, 상단의 나사산과 구멍에 맞춰 칩의 최상위 층 (중간 나사산 길이 x 폭 x 높이 = 10mm X 10mm X 5mm) 아크릴 어댑터를 연결 - 대부분의 층. 이러한 어댑터는 입구 / 출구과 소금 브리지 커넥터 매체의 역할을한다. </li><li> 층류 후드 내부의 마이크로 유체 칩을 조립합니다. </li><li> 화학 - 전단 응력 미세 유체 칩 (CSS 칩)을 조립합니다. <ol><li> 에이ttach 스크라이브 양면 테이프 2 개를 사용하여 스크라이브 PMMA 시트 3 장. (도 1a 및도 1b). </li><li> 칩의 아래로 0.07 mm 두께의 양면 테이프의 또 하나의 조각을 추가하고 10cm 직경 페트리 접시에 칩을 부착합니다. </li><li> 밤새 진공 챔버 내의 조립체 칩을 넣어. </li></ol></li><li> 화학 - 전계 칩 (CEF 칩)를 조립하는 두께의 양면 테이프로 PMMA 시트를 부착 = 0.22 mm (도 2A 및 2B). <ol><li> 테이프의이 같은 조각을 사용하여 10cm 직경 페트리 접시에 스크라이브 PMMA 시트와 양면 테이프를 부착합니다. </li></ol></li><li> 후드 내부에 조립 된 칩을두고 살균 30 분 동안 UV에 노출. </li><li> 플라스틱 튜브를 손으로 조인 너트를 통해이 3 ml를 주사기로 입구를 연결합니다. 플라스틱 관, 손으로 조인 너트를 통해 폐기물 관에 콘센트를 연결합니다. 참고 : 오토 클레이브이전에 사용에 15 분 동안 121 ° C에서 모든 튜브와 너트입니다. </li><li> 천천히 PBS와 주요 유체 채널 주사기의 플런저를 우울. 거품을 제거하기 위해 앞뒤로 주사기를 밀어 넣습니다. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 하룻밤 인큐베이터 안에 칩을 넣어. 참고 :이 두 단계는 칩 내에 남아있는 거품을 칩을 씻어 제거하는 것을 목표로하고 있습니다. </li><li> 인큐베이터에서 칩을 가져 가라. </li><li> CEF 칩에 전기장을 생성하는 한천 소금 교량을 준비합니다. <ol><li> 마이크로파를 이용하여, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 버퍼 3 % 저 융점 아가로 오스를 녹인다. </li><li> 솔루션 단계적 소금 다리 채널로 아가로 오스 주입 및 솔루션이 응고되기 전에 전극을 삽입합니다. </li><li> 관 너트에 실버 / 실버 염화물 전극을 배치합니다. </li></ol></li><li> 둘 베코의 수정 EagleR (주사기 펌프에 주사기를 연결하고 지속적으로 배지 흐름17, 20 μL의 유량에서 10 분 동안 유체 채널로의 배지는 DMEM) / 분 PBS하기. </li></ol> 3. 셀 준비 및 실험 설정 참고 : 사전 따뜻한 1X PBS, 사용 전에 37 ° C의 물을 욕조에 배지 (DMEM 플러스 FBS), 트립신. <ol><li> 플레이트 (2) × 105 폐암 세포 CL1-5 더한 DMEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)가 공급되는 10cm 페트리 접시 25,26. 90 % 합류 할 때까지 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에 따라 내부의 세포를 인큐베이션. </li><li> 매체를 기음과 미리 예열 1X PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 세포에 0.05 % 트립신 버퍼 2 ML을 추가하고 세포를 분리하기 위해 37 ℃에서 2 분 3 기다립니다. </li><li> 15 ㎖의 멸균 된 원심 분리 튜브에 세포 이동 및 관에 배양 배지 6 ㎖에 추가한다. 조심스럽게 혼합 관을 거꾸로하고 hemocytomete에서 세포 수를 카운트하는 세포 함유 배지 5 μl를 꺼내아르 자형. </li><li> 300 X에서 튜브를 원심 분리기 5 분 g. 배지 1 ㎖에 10 6 세포를 일시 중단하고, 1 mL의 주사기에 세포 함유 배지를 배치했다. </li><li> 콘센트에서 미세 유체 칩에 셀 함유 배지를 주입하고, 용액이 오 문화 영역을 통해 모두 배포해야합니다. 2 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 인큐베이터에 따라 내부의 칩 부화. </li></ol> 4. 실험 설정 <ol><li> 인큐베이터에서 칩을 가지고 투명 인듐 주석 산화물 (ITO) 유리 히터의 상부에 배치. 주 : ITO 유리 열 커플러로부터의 피드백을 통해 37 ± 0.5 ℃의 온도를 유지하기위한 비례 적분 미분 (PID) 제어기로 연결되는 ITO는 히터 칩 사이에 단단히 고정. </li><li> 세포 이동 또는 고정 XY 스테이지를 추적 반전 현미경 전동 XY 스테이지 위에 칩 히터 어셈블리를ROS의 생성을 측정하기위한 반전 형광 현미경. </li><li> (배양 배지에 용해) 상대 농도가 0 및 1의 화학 용액 5 ㎖로 두 주사기를 채우기 다른 화학적 농도를 생성하고 원하는 유량 칩로 펌핑 다음 CSS 칩에 0.3 mL의 유속 1 시간 동안 / 분; 처음 20 분 동안 20 μL / 분의 유속에서 CEF 칩 다른 120 분 (총 시간 = 2 시간) 20 μL / hr의 유속이다. </li><li> CEF 칩에서 디지털 일안 반사를 통해, 문화 영역 2 매 15 분 이내 뷰의 특정 필드 (영상 범위)의 (DSLR) 카메라를, 세포 이동, 현미경의 XY 스테이지는 사진을 찍고 반복하는 프로그램을 추적 시간. </li><li> ROS의 생성을 측정하기 위해, 형광 기반 표시 -2&#39;- 7&#39;- dichlorodihydrofluoresce 디 아세테이트 (2&#39;- 7&#39;- DCFDA)를 사용한다. <ol><li> 분자 생물학 수준의 디 10 밀리미터에서 2&#39;-7&#39;-DCFDA의 재고를 준비메틸 설폭 사이드 (DMSO). 단지 혈청 (DMEM 5 μM)없이 DMEM에 DCFDA을 희석. 전위 아세틸 라제 백그라운드 시그널을 증가시키고 세포 내에서 신호를 줄일 수있다. </li><li> CSS의 칩 또는 CEF 칩 EF 자극 2 시간 후에 전단 응력 자극 1 시간 후, 20 μL / 분의 유속에서 칩에 2&#39;- 7&#39;- DCFDA (DMEM 5 μM)를 펌프 처음 20 분, 또 다른 20 분 동안 20 μL / hr의 유속. 세척, 20 분 동안 20 μL / hr의 유속으로 상기 칩 DMEM 펌프. </li><li> 형광 강도를 분석하기위한 배양 영역 내에서 소정의 영상 범위의 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 통해 사진을 찍어. </li></ol></li></ol> 화학 물질의 농도, 전단 응력 및 전기 분야의 5. 계산 <ol><li> CSS의 칩과 칩 CEF 모두에서, 다섯 배양 분야의 화학적 농도를 계산한다. 예를 들어, CONCENTR의 H 2 O 2를 주입하여관리 포인트 0 개의 입구에서 200 μM, 0, 25, 100, 175, 및 200 μM이 생성 농도. 주 : 모든 액체 분할 흐름을 원활하게하는 것이 동등 포크 주위 가정하여, 다섯 배양 영역의 상대적인 농도는 각각, 0, 1/8, 1/2, 7/8, 1이다. </li><li> CSS의 칩에 사용하여 배양 각 영역 내에서의 전단 응력 (τ)을 계산 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq1.jpg" /> Q는 유체 점도 η 체적 유량, 27은, H는 채널의 높이이고 w는 채널의 폭이다. 주 : 각 입구 (Q = 0.12 ㎖ / 분 각 배양 영역)에서 Q = 0.3 ㎖ / 분으로 설정함으로써 η = 0.0008 파 · S 배지, H = 1mm, 및 w = 1 ~ 4mm의 용 전단 응력은 0.0192 아빠에 0.0048 아빠 (4 mm 폭 영역)​​ (1 mm 폭 지역)의 범위로 계산된다. </li><li> 에서CEF 칩, σ는 배양액의 전기 전도도이며, I는 유체 채널을 통해 흐르는 전류이고 E = I / (ΣA의 EFF) (옴의 법칙)을 사용하여 배양 각 영역 내의 EF 강도를 계산 및 EFF 채널의 유효 단면적이다. 주 : 사용 σ는 = 1.38 Ω -1 m -1 배지 및 EFF = 0.22 mm (2) (폭 = 1 mm, 높이 = 0.22 mm)를 들어, EF 강도 E (MV / mm) = I (것으로 계산 A) 3.3 × 10 6 ×. <ol><li> 도 2D에 도시 된 바와 같이, 네 개의 (8 + 35 + 8) 세그먼트 중 하나 (5 + 35 + 5) 세그먼트 다섯 C 섹션 회로와 같은 등가 회로를 처리한다. 주 : 키르히 호프의 전압 법칙과 옴의 법칙에 따라이 병렬 회로를 분석함으로써, 오 문화를 통해 흐르는 전류는I (1)가 아래에서 위로 I 내지 5로서, I (영역 1) 약 0.49로 계산되고, 0.25 I (영역 2) 0.13 I (영역 (3)), 0.08 I (영역 4) 0.05 I를 (면적 5) 각각 I)은 전체 직류 (DC이다. 0.157 mA, 254의 EFS, 130, 67, 41, 26 MV / mm의 적용 직류로 다섯 가지 문화 영역 내에서 생성된다. 참고 : 미세 유체 네트워크의 단순화 된 전기 분석을 위해, 모든 유체 세그먼트는 자신의 길이에 비례 저항 저항으로 간주됩니다. </li></ol></li></ol> 6. 데이터 분석 참고 : 데이터 분석은 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 수행된다. <ol><li> ROS의 생산을 분석합니다. <ol><li> ImageJ에 소프트웨어를 실행합니다. 형광 이미지를로드 &quot;파일&quot;→ 열기로 이동하는 분석한다. </li><li> 메신저를 변경하려면 &quot;이미지&quot;→ &quot;입력&quot;→ &quot;16 비트&quot;로 이동그레이 스케일로 세. </li><li> 셀을 둘러싸 다각형을 그립니다. 셀의 평균 형광 강도를 측정하는 → &quot;측정&quot;을 &quot;분석&quot;로 이동합니다. </li><li> 3 개의 독립적 인 실험의 적어도 50 세포 세기를 수집하고, 평균의 표준 오차 (SEM)으로 평균 강도를 계산 6.1.3을 반복한다. </li><li> 각 실험 조건에 대한 6.1.1-6.1.4를 반복합니다. </li></ol></li><li> 세포 이동을 분석합니다. <ol><li> ImageJ에 소프트웨어를 실행합니다. 시간 = 0에서 촬영 된 이미지를로드 &quot;파일&quot;→ 열기로 이동하는 분석한다. </li><li> 셀을 둘러싸 다각형을 그립니다. (× 1, Y 1)과 세포의 질량 중심을 측정하는 → &quot;측정&quot;을 &quot;분석&quot;로 이동합니다. </li><li> 6.2.1- 6.2.2은 = 시간 t을 다른 이미지에서와 같은 세포의 질량 중심 (× 2, Y 2)를 측정하기 위해 반복합니다. </li><li> 의 (μm의 / 시간 단위) 이동 속도를 계산이 셀로 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq2.jpg" /> . </li><li> 3 개의 독립적 인 실험의 적어도 50 세포에서 이주 요금을 수집하고, 평균의 표준 오차 (SEM)으로의 평균 이동 속도를 계산하도록 반복 6.2.1-6.2.4. </li><li> 6.2.2과 6.2.3에서, 코사인 θ로이 세포의 마이그레이션 directedness을 계산하거나 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq3.jpg" /> , θ는 (양에서 음으로)인가 EF의 벡터 사이의 각도와 셀 (도 2G)의 끝 위치에 처음부터 벡터이다. </li><li> 3 개의 독립적 인 실험의 50 세포에서 마이그레이션 directedness를 수집하고 평균의 표준 오차 (SEM)과 평균 마이그레이션 directedness을 계산하기 위해 6.2.6를 반복합니다. </li><li> SEM와 평균 이동 속도와 각 실험 조건에 대한 SEM과 평균 마이그레이션 directedness을 계산합니다. 참고 : directedness+1 모든 세포가 캐소드 측으로 이주 것을 나타내고, 값 -1이 모든 셀이 양극 측으로 이주 것을 나타낸다. 무작위로 이동 셀 그룹의 directedness는 0에 가깝습니다. </li></ol></li><li> 셀 정렬을 분석합니다. <ol><li> ImageJ에 소프트웨어를 실행합니다. 이미지를로드하기 위해 &quot;파일&quot;→ &quot;열기&quot;로 이동하는 분석한다. </li><li> 타원과 세포 치료 및 세포의 장축을 나타 내기 위해 선을 그립니다. 라인과 수평 EF 방향 사이의 β 각도를 측정하는 → &quot;측정&quot;을 &quot;분석&quot;로 이동합니다. </li><li> 3 개의 독립적 인 실험의 50 세포에서 β를 수집 6.3.2를 반복 계산 평균 코사인 β 평균의 표준 오차 (SEM)와 함께. </li><li> 각 실험 조건에 대한 6.3.1-6.3.3를 반복합니다. 주 : 1의 β COS A는 모든 셀이인가 EF 평행하게 정렬되도록 표시하고, 0 값은 모든 셀 perpendicularl 정렬 것을 나타낸다인가 된 EF에 y를. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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PMMA 계 칩보다 복잡한 소프트 리소그래피를 필요 PDMS 기반의 칩에 비해 저렴하고 쉬운 방법이다 레이저 어블 및 기입을 사용하여 제조된다. 미세 유체 칩을 설계 한 후, 제조 및 조립은 5 분 이내에 수행 할 수 있습니다. 주의 실험을 수행에 지급해야 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 &quot;부착&quot;문제이다. 어댑터는 칩의 최상위 계층에 제대로 붙어해야합니다. 너무이인가되면 접착제 유체 채널로 누출 수 있고, 너무 적은 접착제가 사용되는 경우, 액체는 칩 밖으로 유출 할 수있다. 또한, 상기 PMMA 기판과 양면 테이프를 조립할 때, 그 액체 누출을 방지하기 위해 밀접 전체 칩을 눌러 압력을 적용하는 것이 중요하다. 두 번째는 &quot;버블&quot;문제이다. 기포를 제거하기 위해, 1X PBS 연속 20 μL / 분의 유속으로 1 또는 2 분 동안 유체 채널로 유입 된 후, 상기 칩은 P이고37 ° C에서 하룻밤 5 % CO 2에서 인큐베이터 안에 레이스. 유체 채널 내에 남아...

생체 내 세포 외 기질 (ECM), 탄수화물, 지질 및 기타 생체 세포를 포함하는 다양한 둘러싸여있다. 그들은 각종 성장 인자의 화학 그라디언트에 ECM과의 상호 작용 및 응답으로 마이크로 환경 자극에 반응하여 기능화. 세포 및 시약의 소비가 크고 세포 환경 (비순환) 고정 성장할 여기서 전통적으로, 시험 관내 세포 연구 세포 배양 접시에서 수행된다. 최근, 유체 구성 요소와 통합 마이크로 제조 장치는 더 많은 제어 방식으로 세포 연구에 대한 대안 플랫폼을 제공하고 있습니다. 이러한 장치는 세포 및 시약의 소비를 최소화하면서 화학적 및 물리적 자극의 정확한 미세 환경을 조성 할 수있다. 이 마이크로 유체 칩은 유리 기판, 실리콘 웨이퍼, 폴리 디메틸 실록산 제조 될 수있다 (PDMS) 중합체, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 기재 또는 polyethylenetere프탈레이트 (PET)를 1-3 기판들. PDMS 기반 디바이스는 장기간 세포 배양 및 연구에 적합하게 투명 생체 적합성 및 기체 투과성이다. PMMA 및 PET 기판을 레이저 제거와 쓰기를 사용하여 처리 할 저렴하고 쉽습니다. 미세 유체 장치는 세포가 서로 다른 화학적, 물리적 자극에 될 수 있습니다 안정적이고 제어 미세 환경 세포를 제공해야한다. 예를 들어, 마이크로 유체 칩은 세포의 주 화성을 연구하는 데 사용됩니다. 대신에 보이든 챔버와 모세관 4,5 이러한 소형 유체 장치는 세포의 행동 1,6,7을 공부 정밀 화학 그라디언트를 생성 할 수 있습니다 사용 전통적인 방법. 또 다른 예는 전기장 (EFS), 현상이라는 electrotaxis에서 세포의 방향 이동을 연구하는 것입니다. 셀 Electrotactic 동작은 신경 재생 8, 9 배 발생과 관련된 것으로보고 된그리고 10, 11 상처 치유. 많은 연구는 14,15 림프구 암세포 (12, 13)을 포함하는 다양한 세포 유형의 electrotaxis을 조사 백혈병 세포 (11)을 수행하고, 세포를 16 줄기되었다. 통상적으로, 배양 접시와 커버 유리는 EFS (17)를 생성하기위한 electrotactic 챔버를 구성하는 데 사용됩니다. 이러한 간단한 설정은 중간 증발과 부정확 한 EFS의 문제를 제기하지만, 그들은 동봉, 잘 정의 된 유체 채널 12,18,19의 미세 유체 장치에 의해 극복 될 수있다. 체계적으로 정밀 제어 및 전기 화학적 자극 하에서 세포 반응을 연구하기 위해, 동시에 복수의 자극을 가진 세포를 제공 할 수있는 미세 유체 소자를 개발하기 위해 아주 유용하게 사용될 것이다. 예를 들면은, 리튬 등. 하나 만들거나 화학 그라데이션 및 EFS (20)를 공존을위한 PDMS 기반 미세 유체 장치를보고했다. 카오는 등. DEVEFS 6 폐암 세포의 주 화성을 조절 유사한 미세 유체 칩을 눈 맞아 달아. 또한, 처리량, 허우 등의 알을 증가시킵니다. 설계 8 가지 조합 자극되고 (2 EF 강도 × 4 화학적 농도) 21 셀을 제공하는 PMMA 기반 멀티 - 이중 전계 칩 제조. 또한 전역을 증가시키고 전단 응력 자극을 추가하려면, 우리는 단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에 따라 세포 반응을 연구하기위한 두 PMMA 기반 미세 유체 장치를 개발했다. 소호 등의 알. 22, 23으로보고,이 장치는 생체 순환 시스템을 흉내 낸 연속 유체 흐름에 따라 다섯 가지 독립적 인 세포 배양 채널을 포함한다. 제 1 칩 (화학 전단 응력 칩 또는 CSS 칩) 다섯 대하여 0의 농도를 1/8, 1/2, 7/8, 및 1 배양 영역에서 발생하고, 전단 응력 구배이다되고 produ의다섯 문화 각 영역 내부 세드릭. 제 칩 전극 중 하나의 세트와이 주사기 펌프를 사용하여 (화학 - 전계 칩 또는 CEF 칩)에서, 다섯 EF 강도는 이러한 배양 영역 내에서 다섯 가지 화학 물질의 농도에 부가하여 발생된다. 수치 계산과 시뮬레이션 나은 설계를 수행하고 이러한 칩을 제공하고,이 장치의 내부에 배양 폐암 세포는 반응성 산소 종의 생성과 관련하여 자신의 응답을 관찰하는 단일 또는 공존 자극 (ROS) 적용을 받는다 마이그레이션 속도 및 마이그레이션 방향. 이 칩은 시간을 절약 세포는 다양한 마이크로 환경 자극에 어떻게 반응하는지 조사에 대한 높은 처리량과 신뢰할 수있는 장치로 입증된다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>접시에서 세포 분리</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>10 cm 세포 배양 Petri dish</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Bright-Line&nbsp; 헤마사이토</td><td>미터 시그마</td><td>Z359629</td><td>세포 계수 장비</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>맞춤형</td><td></td><td>미세유체 칩</td></tr><tr><td>어댑터</td><td>맞춤형</td><td></td><td>미세유체 칩</td></tr><tr><td>0.07/0.22mm 양면 테이프&nbsp;</td><td>3M</td><td>8018/9088</td><td>미세유체 칩</td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>시그마</td><td>A9414</td><td>솔트 브릿지</td></tr><tr><td>2'-7'-디클로로디하이드로플루오레시스 디아세테이</td>트 <td>시그마</td><td>D6883</td><td>세포 내 ROS 측정</td></tr><tr><td>인듐 주석 산화물 (ITO) 유리</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>히터</td></tr><tr><td>비례-통합-파생 컨트롤러&nbsp;</td><td>JETEC 전자 (주)</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>온도 컨트롤러</td></tr><tr><td>열 커플러</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td>온도 컨트롤러</td></tr><tr><td>CO2 레이저 스크라이버</td><td>레이저 도구 및 테크닉스 코퍼레이션</td><td>ILS2</td><td>미세유체 칩 제조</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>New Era</td><td>NE-300</td><td>펌핑 매체 및 화학 물질을 칩에</td></tr> 주입 <tr><td>전원 공급 장치</td><td>주요 과학&nbsp;</td><td>MP-300V</td><td>직류 공급</td></tr><tr><td>도립 현미경 Olympus</td><td></td><td>CKX41</td><td>세포 이동 모니터링</td></tr><tr><td>거꾸로 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>TS-100</td><td>모니터링 세포 이동 및 형광 신호 DSLR</td></tr><tr><td>카메라</td><td>Canon</td><td>60D</td><td>명시야 이미지 기록&nbsp;</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi1</td><td>형광 이미지 녹화&nbsp;</td></tr><tr><td>슈퍼 접착제</td><td>3M 스카치</td><td>7004</td><td>PMMA 기판에 어댑터 부착</td></tr><tr><td>AutoCAD</td>, <td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>미세유체 칩 설계</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>용해 DCFDA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td> 형<td>광 강도 및 세포 이동 정량화</td></tr></tbody></table>

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

미세 유체 장치의 pH, 온도, 염농도, 다른 물리적 또는 화학적 자극을 정밀하고 제어 가능한 세포 미세 환경을 조성 할 수있다. 이들은 일반적으로 주변 같은 생체 내에서 제공하여 시험 관내 세포의 연구를 위해 사용되어왔다. 이러한 현상은 세포의 특성과 기능을 이해하는데 중요하기 때문에 특히, 세포가 화학 그라디언트, 전기 필드 및 전단 응력에 대응하여 얼마나 많은 관심을 받고있다. 이 마이크로 유체 칩은 유리 기판, 실리콘 웨이퍼, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 중합체, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 기판, 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET) 기판에 제작 될 수있다. 이들 재료 중에서, PMMA 기판을 저렴하고 간편하게 레이저 어블 및 기입을 사용하여 처리 될 수있다. 몇 마이크로 유체 장치는 다수의 화학 물질을 생성하는 전기 자극을 공존 설계 및 제작 하였지만, 이들 중 어느 것도 고려되지 않았다충분히 목적을 선별 특히 실험적인 반복을 감소 시키는데 효율적입니다. 이보고에서는, 단일 또는 공존 화학적 / 전기적 / 전단 스트레스 자극에 따라, 반응성 산소 종의 생산 및 마이그레이션에, 세포 반응을 조사하는 두 PMMA 계 미세 유체 칩 우리의 설계 및 제작을 설명한다. 첫 번째 칩은 다섯 상대 농도를 생성 0, 1/8, 함께 각 영역 내에서 생산되는 전단 응력 구배와 문화 지역에서 1/2, 7/8, 1,. 두 번째 칩은 있지만, 각 문화 영역 내에서 생성 된 다섯 가지의 전계 강도와 같은 상대적으로 농도를 생성합니다. 이러한 장치는 정확하고 제어 가능한 마이크로 - 셀 환경을 제공 할뿐만 아니라, 매우 실험 처리량을 증가시키지.

화학 전단 응력 (CSS) 칩 CSS의 칩이 양면 테이프를 통해 함께 연결된 세 PMMA 시트 두께 1mm 각, 두께가 0.07 mm (도 1A 및 1B) 각각에 형성된다. 은 &quot;크리스마스 트리&quot;구조는 0의 다섯 상대 농도를 생성 1/8, 다섯 문화 분야에서 1/2, 7/8, 1. 체적 유량, 유체 점도 및 유체 채널의 사이즈에 관련된 크기로, 삼각형, 전단 응력 구배로 배양 영역을 설계함으로써, 각 영역 내에서 생성된다. 이 칩은 배양 폐암 CL1-5 세포 배양 접시에, 또 0.07 mm 두께의 양면 테이프로 부착하고, ROS의 생성은 다른 화학적 농도 및 전단 응력에 응답하여 관찰 하였다. 폐암 세포 내 ROS의 생성은 고도의 LU와 관련된NG 암 전이 개발 및 특정 화학 전단 ...

유체 구성 요소와 통합된 미세 가공 장치는 생체 내 미세 환경을 모방한 세포 연구를 위한 체외 플랫폼을 제공합니다. 우리는 단일 또는 공존하는 화학적/전기적/전단 응력 자극 하에서 세포 반응을 연구하기 위해 폴리메틸메타크릴레이트 기반 미세유체 칩을 개발했습니다.

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포가 환경 자극에 어떻게 반응하는지 관찰하기 위한 미세유체 장치를 설계하고 제작하는 것입니다. 이 방법은 화학 물질, 전단 응력, 전기장 등 다양한 환경 자극 하에서 세포가 어떻게 반응하는지와 같이 세포 생물학 및 생체 의학 공학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 튜브를 쉽게 제작하고 조립할 수 있다는 점입니다. 또한 이러한 미세유체 장치는 매우 뛰어난 성능으로 인비보(in-vivo) 조건을 구현할 수 있습니다. 이 절차의 시연은 저희 실험실의 학부생인 Tzu-Yuan Chou와 Dr. Julian Chung 실험실의 포스트닥터인 Hsien-San Hou가 맡게 됩니다. 먼저, 이산화탄소 레이저 스크라이버를 켜고 컴퓨터와의 연결 상태를 확인하십시오. 그런 다음 여기 표시된 패턴 중 하나와 같이 미리 그려진 크리스마스 트리 패턴을 스크라이버에 로드하십시오. 다음으로, PMMA 시트나 양면테이프 조각을 스크라이버 스테이지 위에 놓으십시오. 캘리브레이션 바와 가시 헬륨-네온 레이저를 사용하여 이산화탄소 레이저의 초점을 조정하십시오. 그런 다음 기판에 패턴을 새기십시오. 완료되면 패턴 기판을 들어 올려 불필요한 조각을 제거하고, 질소 스트림을 사용하여 표면에 남아 있는 잔해를 세척하십시오. 칩의 각 구성 요소에 대해 이 과정을 반복하십시오. 화학 전단 응력 미세유체 칩을 조립하십시오. 이를 위해 두 조각의 새겨진 양면테이프를 사용하여 화학 전단 응력 패턴이 형성된 PMMA 시트 세 장을 부착하십시오. 나사산과 구멍을 맞춘 후, 순간접착제를 사용하여 나사산이 있는 아크릴 어댑터를 칩의 가장 상단 PMMA 층에 부착하십시오. 이 어댑터들은 배지 입구, 출구 및 염다리(salt bridge) 커넥터 역할을 합니다. 그런 다음 칩 바닥에 0.7 mm 두께의 양면테이프를 한 장 더 추가하고, 칩을 10 cm 직경의 페트리 접시에 부착하십시오. 조립이 완료되면 칩을 진공 챔버에 넣어 하룻밤 동안 보관하십시오. 이제 화학-전기장 칩을 조립하십시오. 화학-전기장 칩을 위해 새겨진 PMMA 시트를 양면테이프로 10 cm 직경의 페트리 접시에 부착하십시오. 칩을 사용하기 전에 30분 동안 UV에 노출시켜 멸균하십시오. 다음으로, 플라스틱 튜브와 핑거 타이트 너트를 통해 칩의 입구를 3 ml PBS가 채워진 주사기에 연결하십시오. 같은 방식으로 출구를 폐액 튜브에 연결하십시오. 주사기의 플런저를 천천히 눌러 유체 채널에 PBS를 채우십시오(프라이밍). 주사기를 앞뒤로 밀어 기포를 제거한 다음, 칩을 인큐베이터에 넣어 하룻밤 동안 보관하십시오. 화학-전기장 칩을 설정하려면, 튜브형 너트에 3% agarose를 채워 염다리를 설정하십시오. 그런 다음 은/염화은(silver silver chloride) 전극을 튜브형 너트에 넣으십시오. 10% FBS가 보충된 D-MEM에서 폐암 CL1-5 세포를 90% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 배양하십시오. 그런 다음 배지를 흡입하여 제거하십시오. 미리 데워진 PBS로 세포를 한 번 세척하십시오. 그리고 10 cm 직경의 플레이트에 0.5% trypsin 완충액 2 ml를 추가하십시오. 세포를 다시 37

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세포 캡처 및 문화를 활성화할 수 있습니다 microfluidic 장치의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는 이러한 microfluidic 채널 내에서 홈과 같은 패턴 microstructures는 셀 수있는 부두 내에서 낮은 전단 응력 영역을 작성하는 데 사용됩니다.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

우리는 클린 룸이나 부드러운 리소그래피 필요없이 여러 독특한 변종에 유사한 동적 조건을 적용 할 수있는 마이크로 유체 장치를 생산하는 간단한 방법을 제시한다.

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미세 유체 기술은 셀 변형능을 검사 할

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

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생리적 맥박성 전단 응력과 진동성 고혈당 하에서 내피 기능 장애를 모델링하는 마이크로플루이딕 시스템

학습하세요 화학, 전기, 전단 응력 자극에서 세포 응답을 관찰하기 위한 폴리메틸메타크릴레이트 기반 미세유체 칩 설계 및 제작 방법을. 이 기술은 생체 내 미세환경을 모방하여 세포 행동 연구에 활용됩니다.

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

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