π-π 스태킹 상호 작용에 의해 안정화 된 블록 공중 합체 미셀 준비하는 양친 매성 공중 합체의 음이온 중합

본 연구의 전반적인 목표는 고리 개방 음이온 중합을 통한 블록 공중합체 물질 합성에 필요한 핵심 단계들을 입증하고, 소수성 약물의 블록 공중합체 미셀 제형화를 위한 필수 연구 흐름을 보여주는 것입니다. 본 프로토콜은 음이온 중합에 의한 블록 공중합체 합성을 위해 필요한 단계 및 절차의 적절한 수행 방법을 설명합니다. 고리 개방 음이온 중합의 큰 장점은 높은 수율과 낮은 분산도로 물질을 합성할 수 있다는 점입니다.

또한 공정의 확장성도 중요합니다. 현재 다수의 약물이 제형 및 블록 공중합체 미셀에 의존하여 전임상 후기 단계 또는 임상 개발 단계에 있으며, 이는 고분자 약물 전달 분야에 있어 매우 흥미로운 시기입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전이에 필요한 시약과 재료를 준비하십시오. 분자량이 5,000인 methoxypolyethylene glycol의 무게를 잽니다. 마그네틱 바가 들어있는 건조된 플라스크에 mPEG를 넣고, 상단의 플러싱 어댑터를 격막(septum)으로 밀봉하십시오.

플라스크를 매니폴드에 연결하고, Argon으로 2~3분 동안 퍼지합니다. 밸브를 진공 위치로 돌려 플라스크를 퍼지합니다. 플라스크를 수동으로 회전시키면서, mPEG가 녹을 때까지 헤어드라이어 또는 히트건을 사용하여 반응 용기를 균일하게 건조합니다.

1분 후, 매니폴드의 밸브를 Argon 위치로 빠르게 여러 번 돌려 진공을 해제함으로써 플라스크를 냉각시킵니다. 고분자 매크로개시제를 약 2시간 동안 진공 상태로 둔 다음, 반응이 시작되기 전까지 Argon 분위기에서 유지합니다. 그다음, 후드 내 오븐에서 미리 건조시킨 고진공 증류 장치 두 개를 설치합니다.

한 장치의 장비는 DMSO 증류용이며, 다른 한 장비는 단량체인 phenyl glycerol ether 증류용입니다. 각각의 플라스크를 두 장치에 연결하고, 각 장치를 반구형 가열 맨틀 또는 오일 배스에 설치하십시오. 각 장치의 상단과 매니폴드에 냉각수를 연결하십시오.

각 장치가 고정되어 있고 밀폐가 잘 되었는지 확인하십시오. 밸브를 통해 진공을 가합니다. 온도 조절기로 가열 온도를 설정하고, 용액을 교반하기 시작합니다.

DMSO를 2시간 동안 순환 증류한 후, 고진공 밸브를 닫아 약 20 milliliters의 용액을 수집합니다. 그런 다음, 해당 분획을 플라스크로 방출하고 이 작업을 한 번 더 반복하여 나중에 수집할 대상 분획의 순도를 보장합니다. mPEG가 들어 있는 플라스크를 히트건으로 진공 가열하여 폴리머가 녹을 때까지 가열한 후, 다시 Argon으로 퍼지합니다.

2시간 후 고진공 밸브를 닫고 용매의 부피를 수집하십시오. 가열을 중단하고 매니폴드의 진공을 해제하십시오. 앞서 설명한 대로 챔버에 Argon을 주입하십시오.

아르곤 양압 하에서, 캐뉼라의 한쪽 끝을 메스실린더 또는 아르곤 분위기의 mPEG가 들어 있는 플라스크에 직접 연결하고, 반대쪽 끝을 갓 증류된 분획물에 조심스럽게 담급니다. 플라스크에 추가 버블러를 연결하고 아르곤 흐름을 차단한 뒤, 증류 장치의 아르곤 압력만을 이용합니다. 아르곤 압력으로 인한 사고를 방지하기 위해, 유리 콕을 1~2초 동안 열었다가 다시 닫아 DMSO의 흐름을 유지하며 전체 전이가 완료될 때까지 진행합니다.

다음으로, 아르곤 분위기 하에서, 세프텀으로 밀봉된 건조된 메스실린더의 한쪽 끝을 0.3 M 나프탈렌 칼륨 표준 용액에 캐뉼라로 연결합니다. 그 다음, 메스실린더에 버블러를 추가로 연결하고 실린더로 향하는 아르곤 흐름을 차단한 뒤, 아르곤 양압을 이용하여 표준 용액으로부터 0.3 M 나프탈렌 칼륨 5 mL를 캐뉼라를 통해 메스실린더로 옮깁니다. 매니폴드에서 또 다른 바늘을 실린더에 삽입하고, 추가했던 버블러를 제거합니다.

스톡 용액에 연결된 캐뉼라를 조심스럽게 제거하여 반응 플라스크에 빠르게 삽입하고, 추가 버블러를 연결합니다. 그다음, 앞서 설명한 대로 용액의 색이 어두워질 때까지 염기를 한 방울씩 첨가합니다. 색이 천천히 사라지면 어두운 색이 다시 나타날 때까지 염기를 추가로 투입하며, 모든 양을 전량 옮길 때까지 이 과정을 반복합니다.

앞서 설명한 대로, 폴리페놀 글리콜 에테르의 중합도가 약 18에서 20 유닛이 되도록 원하는 부피의 모노머를 반응 용기에 옮깁니다. 완전한 중합을 보장하기 위해 아르곤 분위기 하에서 지속적으로 교반하며 80 °C에서 48시간 동안 반응시킵니다. 색이 사라지는 것이 관찰될 때까지 1 N 염산과 메탄올을 몇 방울 첨가하여 반응을 정지시킵니다.

헥산으로 DMSO 용액에서 나프탈렌을 추출합니다. 감압 증류를 통해 DMSO 약 70 milliliters를 제거합니다. 슬러리 용액을 냉각시킨 후, THF 15 milliliters를 첨가합니다.

5,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 슬러리 용액에서 염을 제거합니다. 상층액을 옮긴 후, 차가운 diethyl ether 500 milliliters에 한 방울씩 첨가합니다. 여과 또는 원심분리를 통해 침전물을 수집합니다.

침전 과정을 두 번 반복한 후, 후드 내 실온에서 하룻밤 동안 침전물을 건조시키고, 이어서 30 °C의 진공 상태에서 24~48시간 동안 건조하여 85%의 수율을 얻습니다. 이제 공중합물은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 특성 분석을 수행할 준비가 되었습니다. doxorubicin 12 mg을 acetonitrile 1 mL에 녹입니다. triethylamine 10 µL를 첨가하고, 용액을 어두운 곳에서 2시간 동안 교반합니다.

공중합체 45 milligrams를 THF 1 milliliter에 녹이고 같은 시간 동안 교반합니다. 공중합체 용액을 독소루비신 용액에 첨가하고, 잔류 공중합체가 남아있는 바이알을 추가적인 THF 부피로 헹굽니다. 다음으로, 교반하면서 0.9% saline 15 milliliters가 들어있는 20 milliliter 바이알에 공중합체-약물 혼합물을 한 방울씩 첨가합니다.

용액을 투석 주머니로 옮기고, 0.9% saline 500 milliliters를 사용하여 투석합니다. 투석액을 15 milliliter 튜브로 옮긴 후, 5,000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다. 그런 다음, 상층액을 투석막이 포함된 초여과 시스템으로 옮깁니다.

교반 어댑터를 초여과 시스템에 넣고 뚜껑을 닫은 후, 질소 흐름을 열어줍니다. 블록 공중합체 미셀 용액을 4 mL 부피가 될 때까지 농축하고, 신선한 식염수 6 mL를 첨가합니다. 그런 다음, 블록 공중합체 미셀 용액을 다시 4 mL까지 농축하고, 챔버를 식염수 0.5 mL로 헹구어 용액에 추가합니다.

결과 용액을 추가로 사용하기 전까지 실온의 어두운 곳에 갈색 병에 넣어 보관하십시오. mPEG의 하이드록실기를 강하게 양성자화하여 mPEG 매크로개시제 상에서 페닐 글리세롤 에테르의 개환 음이온 중합을 통해 양친매성 이블록 공중합체를 제조하였습니다. 나프탈렌 칼륨을 라디칼 음이온으로 사용하여 페닐 글리세롤 에테르 단량체를 중합하였습니다.

젤 투과 크로마토그래피와 양성자 NMR 분광법 분석을 통한 블록 공중합체의 특성 분석 결과, 페닐 글리세롤 에테르의 중합도가 15단위이며 분자량 분포가 좁음을 확인하였습니다. 수성 매질에서 양친매성 블록 공중합체는 소수성 코어와 이를 둘러싼 친수성 쉘로 구성된 미셀을 형성하며 조립됩니다. 투과 전자 현미경을 통해 구형 형태임을 확인하였으며, 동적 광산란 분석 결과 수화역학적 직경은 25 nano meters였습니다.

Doxorubicin이 블록 공중합체 미셀 내에 성공적으로 캡슐화되었습니다. 용액 내의 유리 양성자화 약물과 비교했을 때, 형광 분광법으로 관찰된 doxorubicin의 자기 소광(self-quenching) 현상을 통해 약물이 고분자 미셀에 통합되었음을 확인하였으며, 약물 적재 용량은 최대 14%에 달했습니다. 블록 공중합체 미셀로부터의 doxorubicin 방출 프로파일은 중성 pH에서 이 제형의 우수한 안정성을 나타냈으며, 생리학적으로 관련 있는 조건 하에서 4일 동안 약물이 지속적으로 방출됨을 보여주었습니다.

이 기술을 숙달하면 제약 과학 전공 교육생들이 약물 전달에 적용할 이블록 공중합체(diblock copolymers) 합성을 준비하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 설명된 절차는 PEG를 개시제로 사용하는 광범위한 공중합체 합성에 적용 가능합니다. 본 과정에서는 무수 조건을 제공하여 고품질의 재료를 얻을 수 있도록 하는 우수 실험실 운영 기준(good laboratory practices)을 준수하는 데 중점을 두었습니다.

이 영상을 시청한 후, 시청자는 무수 조건 하에서 작업하는 방법에 대해 충분히 이해하고, 이러한 단계를 PEG 폴리에스테르 또는 PEG 폴리에스테르 재료의 합성에 적용할 수 있어야 합니다. 설명된 연구를 수행할 때, 잠재적으로 위험한 유기 용매 및 기타 시약과 함께 제어된 조건 하에서 작업하고 있다는 점을 기억하는 것이 필수적입니다. 또한, 모든 약물은 독성이 있으므로 필요한 예방 조치를 취하여 취급해야 합니다.

장갑, 실험복, 앞코가 막힌 신발을 착용하고, 약물을 칭량할 때는 마스크를 착용하십시오.