Name: 청각 HEI-OC1 세포를 사용한 작업 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 학습하세요 HEI-OC1 세포 배양 및 약물 독성 연구 방법을. 마우스 청각 세포계를 활용한 prestin 단백질 기능 분석과 표준화된 실험 절차를 통해 청각 연구의 재현성을 높입니다.

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이 작업은 NIH 보조금 R01-DC010146 및 R01-DC010397의 지원을 받았습니다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

1. 세포 배양 주 : 모든 세포 배양 프로토콜 적절한 세포 배양 기술을 이용하여 수행되어야한다 (: 실험실 편람, 볼륨 I 10 참조 용으로 세포 생물학의 제 3 장을 참조). HEI-OC1 세포는 적절한 부착 및 성장에 대한 세포 배양 접시의 추가 코팅 또는 치료를 필요로하지 않는다. 아주 중요한 : 세포 배양을 위해 유리 접시를 사용하지 않는; 표현형 및 약리학 적 약물로 세포의 생물학적 반응은 (게시되지 않은 G Kalinec &amp; F Kalinec)을 변경한다; 기존의 플라스틱 세포 배양 요리 (재료 / 장비의 표 참조)을 권장합니다. 오염을 방지하기 위해 무균 기술에 특별한주의를 지불하지만, HEI-OC1 세포와 항생제 (예를 들어, 암피실린 또는 스트렙토 마이신)를 사용하지 않습니다. 필요한 경우 인 HeLa 및 HEK-293 세포 HEI OC1-8, 다른 세포주 수와 이전 시험에서 대조군으로 사용되었지만, 암포 테리 신 B를 사용이 목적을 위해 허용합니다. <ol><li> 냉동 HEI-OC1 세포의 소생 참고 맥리는 13,14 vascularis에서이 프로토콜은, 동일한 유전자 도입 11,12 코르티 기관에서의 이러한 OC-K3, 우리 실험실에서 개발 된 마우스 및 SV-K1에서 다른 세포주와 함께 사용될 수있다. <ol><li> 액체 N 2에서 냉동 보관 HEI-OC1 세포의 병을 제거하고 37 ℃의 물을 욕조에 넣습니다. 바이알의 하반부 잠수함과 얼음의 소량 만이 병에 남아 때까지 해동 할 수있다. 70 % 알코올로 유리 병의 외부를 닦습니다. </li><li> (둘 베코 변형 이글 배지와 같은 예열 성장 배지 10 ㎖를 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 천천히 전체 부피 (~ 1.5 × 105 세포 / ㎖)을 적가 방식으로, 바이알로부터 세포를 피펫 및 배달 DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. </li><li> t를 버리고, 5 분간 300-500 XG에서 튜브를 원심 분리하여 DMSO를 제거그 상층 액을 다시 현탁 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS)의 9 ml의 세포. 매질과 반대로, 튜브의 바닥을 터치 피펫의 팁 서너 번 피펫에서 부유 세포의 광속 환류 덩어리 또는 세포를 해리하는 시트. </li><li> 100mm 직경의 비 처리 플라스틱 세포 배양 접시에서 배양 배지에 현탁하고 세포의 총 부피를 놓는다. </li><li> 10 % CO 2 (허용 조건)와 33 ° C에서 세포를 품어. </li></ol></li><li> HEI-OC1 세포의 계대 주 : 합류하기 전 (~ 80 %) 세포가 죽어 배양을 방지하기 위해 정지하고 계대 배양하게한다. 이 프로토콜은 또한 맥리에서 13, 14을 vascularis, 코르티 11, 12, 및 SV-K1의 기관에서 이러한 OC-K3와 같은 형질 전환 마우스에서 우리 실험실에서 개발 된 다른 세포주, 사용할 수 있습니다. <ol><li> PBS 2 ㎖로 세포를 오래된 매체를 제거하고 씻는다. &lt;/ 리&gt; <li> 표면적이 25cm 당 1 mL로하여, 0.25 % 트립신 용액으로 세포 단층을 커버. 세포의 40 % 이상이 분리되어야 다음 단계로 이동한다. 필요한 경우, 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 검사하고, &quot;때리고 또는 탭&quot;나머지 부착 세포를 분리 부드럽게 문화 요리를. 참고 : 세포 사망에이를 수 있습니다 오랜 기간 동안 트립신으로주의; 충분한 및 전송 된 셀 것 계획된 연구 부족.하지 </li><li> 1.1.3에 설명 된 절차에 따라, 세포를 재현 탁하고, 15 ml의 원추형 튜브에 옮긴다. </li><li> 300-500 XG에서 5 분 동안 원심 분리, 배지를 버리고 새로운 성장 배지로 세포를 수집하고, 적어도 네 개의 100mm 직경의 세포 배양 접시 그들을 시드. 접시 당 셀의 수는 회수 된 세포의 양에 의존 할 것이다. 10 % CO 2 (P-HEI-OC1)와 33 ° C에서 세포를 품어을 위해 필요한 다시 여러 번 분할계획된 실험이나 새로운 주식을 생성. </li><li> 재고 준비를 들어, 250-550 ml의 세포 배양 플라스크으로 100mm 직경의 요리를 교체; 실험을 위해, 작은 접시 또는 멀티 웰 플레이트보다 적합 할 수있다. </li><li> 그들이 도달 할 때까지 차별화를 들어, ~ 허용 조건에서 80 %의 합류를 HEI-OC1 세포를 배양; 다음 2 ~ 3 주 동안 5 % CO 2 (NP-HEI-OC1)를 39 ° C로 요리를 이동합니다. 참고 : 세포가 점진적으로 확산 죽어 중지됩니다. 죽은 세포를 제거하기 위해 매일 매체를 변경합니다. 더 이상 세포가 실험에 사용할 수 없습니다 일반적으로 4 ~ 주 후, 세포의 원래의 수에 따라. 세포가 NP 조건에서 배치로 분화 빨리 시작되지만 모든 셀은 동일한 속도로 분화. 중요한 것은 정성을 제공, (그림 4를 대표 결과를 참조) 분화 과정에서 발현 및 막 지역화 증가 prestin분화의 정도를 정량적으로 표시. </li></ol></li></ol> 2. 약물 세포 독성 연구 참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 (그림 1을 대표 결과를 참조)을 권장합니다. <ol><li> 세포 생존율 (MTT 분석) <ol><li> 1.2에 기술 된 절차에 따라 P-HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다. </li><li> 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요! </li><li> 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 제조 업체의 프로토콜 다음 MTT 분석을 수행합니다. 대개이 분석을위한 프로토콜은 다음과 같은 단계를 가지고 : <ol><li> 각 웰에 MTT 시약의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 보라색 ​​염료가 보일 때까지 2 ~ 4 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 다음 각 웰에 MTT 세제 시약 100 μl를 추가합니다. 판을 흔들지 마십시오. </li><li> 접시를 덮고 37 ℃에서 2 시간 4의 어둠 속에서 그것을 둡니다. </li><li> 블랭크 (단독 성장 배지)을 포함하여, 각 웰에 570 nm에서 흡광도를 측정하기위한 마이크로 플레이트 리더를 사용. 생존율 100 %의 대조군 세포의 평균 OD를 사용하여 데이터를 정규화한다. </li></ol></li></ol></li><li> 카스파 3/7 활성화 분석 참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다. <ol><li> 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다. </li><li> WH에 세포를 시드(100 μL 아니라 당) 96 웰 플레이트를 ITE 벽으로, 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요! </li><li> 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 각 제조 업체의 프로토콜 다음 카스파 분석을 수행합니다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고 <ol><li> , 시약을 준비들을 잘 혼합하고 실온에 평형 수 있습니다. </li><li> 배양기에서 세포를 제거하고, 플레이트를 실온으로 평형을 허용한다. </li><li> 같은 피펫 팁 다른 샘플을 포함 우물을 터치하지 않음으로써 교차 오염되지 않도록주의하면서 각 웰에 시약의 표시 금액을 추가합니다. </li><li> 접시를 덮고 300 ~ 500 rpm으로 접시 통을 사용하여 30 초 동안 혼합한다. </li><li> 적어도 30 분 동안 실온에서 플레이트를 인큐베이션. Determin경험적으로 최적의 잠복기를 전자. 실내 온도가 온도 변동이 발광 판독에 영향을 미칠 것이기 때문에, 항온 배양기를 사용하여 변동하는 경우. </li><li> 물론 각각의 발광을 측정하고 카스파 제 활성화의 100 %로 대조군 세포의 평균 발광을 사용하여 값을 정상화. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 분열 (증식) <ol><li> 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × 105 세포 / ml로 농도를 조정한다. </li><li> 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 허용 조건에서 하룻밤 배양 한 다음 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요! </li><li> 처리 1 시간 후에는, 각각의 웰에 제조 100X BrdU의 1 μL를 추가 (5- 브로 모 -2&#39;- deoxyuri) 솔루션을 식사, 33 ° C에서 인큐베이터에 번호판을 반환합니다. </li><li> 12, 24, 48 시간 후, 해당 판에서 기존 매체를 제거하고 PBS 잘 한 번 각을 씻는다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따르는 세포 증식 분석을 수행한다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고 <ol><li> / 정착 포함 제조자의 프로토콜에 표시된 변성 용액을 세척 완충액, 일차 항체 검출 용액 이차 항체 검출 용액 및 BrdU의 솔루션 시약을 준비한다. </li><li> 제조자의 프로토콜에 명시된 양으로, 각 웰에 고정 / 변성 용액을 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 플레이트를 유지한다. </li><li> 고정 / 변성 용액을 제거하고 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도 차 항체를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 유지한다. </li><li> 기본 개미와 솔루션을 제거ibody, 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척 한 다음 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도에서 차 항체를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 이차 항체와 함께 플레이트를 유지한다. </li><li> 보조 항체 솔루션을 제거 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 기판을 추가합니다. 실온에서 10 분간 배양 한 후, 정지 액을 합한다. 주의 : 색상의 변화를 제어; 용액이 매우 어두운지면, 10 분의 표준 현상 시간 전에 반응을 정지. </li><li> 정지 솔루션을 추가 30 분 이내에 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 독성 참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다. <ol><li> 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어. </li><li> 치료 끝에PBS로 세포를 세 번 세척하고, 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 표면적이 25cm 당 1 ml의 분리를 사용. </li><li> 분리 후, 수집하고 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠릿, 상층 액을 제거하고 세포 독성 분석에 포함 된 시약으로 어둠 속에서 15 분 동안 세포를 염색. </li><li> 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 라이브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다. </li></ol></li><li> 노화 <ol><li> 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어. </li><li> 신뢰할 수있는 결과를 제공하는 것으로 알려져 Debacq-Chainiaux 외. (15) 또는 다른 방법에 의해 기재된 프로토콜 유세포하여 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 양성 세포의 수를 결정한다. 유동 세포 계수를위한 간단한 프로토콜은 다음이다 : <ol> &lt;리&gt; 실험 치료 끝에, PBS로 세포를 세 번 세척하고 허가 조건에서 1 시간 동안 세포 배양 배지에 100 nM의 Bafilomycin A1 그들을 부화. </li><li> ~ 33 μM의 최종 농도 C12FDG을 추가하고 1-2 시간 동안 세포를 배양 계속합니다. </li><li> 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 표면적이 25 cm2로 당 한 용액을 사용하여 수확 PBS로 두 번 세포를 씻어, 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여이를 펠릿. </li><li> 얼음 - 냉각 PBS로 세포를 재현 탁하고 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유세포 포지티브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다. </li></ol></li></ol></li><li> 자식 작용 <ol><li> HEI-OC1 셀 제어 결핍 1.2에 기재된 절차를 수행하여 (48 시간 동안 혈청을 박탈) 표준 프로토콜 다음 웨스턴 블롯 그들을 처리 모은다. 일반적으로 웨스턴 블롯을위한 프로토콜은 다음과 같은 일이분기 EPS : <ol><li> 1.0 × 105 세포 / ml의 농도로 6 웰 플레이트에 시드 HEI-OC1 세포. 24 및 / 또는 48 시간 후, 빙냉 PBS로 세포를 세척 하였다. </li><li> 를 Lyse와 TNESV 버퍼 (1 % NP40, 50 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 100 mM의 NaCl을, 2mM의 EDTA, 1 mM의 나 3 VO 4) 얼음에 5 분간 프로테아제 억제제 칵테일과 1 ㎜ PMSF 200 μL. </li><li> (각 웰의 바닥을 긁어) 세포를 모으고 4 ℃에서 5 분 동안 16,800 XG에서 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮긴다. </li><li> 상청액을 수집하고 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 정량화. </li><li> 단백질을 변성 5 분 동안 5 배 로딩 버퍼와 각 샘플에 1 mM의 DTT과 종기를 추가합니다. </li><li> 4-12 %의 겔에서 SDS-PAGE를 사용하여 샘​​플을 실행하고 PVDF 막에 전송할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 60 분 동안 트윈 20 0.1 %와 TBS-T에서 5 % 무 지방 건조 우유와 세포막을 차단합니다. </li><li> 주 개미와 4 ° C에서 하룻밤 멤브레인을 품어ibodies. </li><li> 다음 날, TBS-T로 광범위하게 막을 세척하고, 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) (1 : 1,500)에 접합 보조 IgG 항체와 함께 품어 1 시간 동안. </li><li> 강화 된 화학 발광 (ECL) 감지 시스템과 면역 반응을 감지합니다. 표준 : (10 %의 무 지방 건조 우유, TBS-T에서 000 일) GAPDH를 사용하여 단백질의 발현 수준을 정상화. </li></ol></li><li> 웨스턴 블롯에서의 발현을 조사하는 적어도 그러한 Beclin-1과 같은 LC3B 자식 작용의 두 가지 지표 (통상적으로 1 : 2.5 %의 BSA와 TBS-T 1000 희석). GAPDH 또는 액틴 등의 단백질 발현의 제어를 찾을 것을 잊지 마십시오. </li><li> 이러한 공개 도메인 NIH 이미지 또는 ImageJ에 (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)와 같은 디지털 오 스캐너 또는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 농도계 관심있는 단백질의 발현을 평가한다. </li></ol></li></ol> HEI-OC1 세포 3. 전기 생리학 실험 <ol><li>수확 세포 참고 : 사용 세포가 50 % -80 %의 포화 상태에서 100mm 직경 배양 접시에 성장합니다. 트립신, Accutase하는 cetic 산 (PBS-EDTA)를 ETRA thylene D iamine t uffered의 알린 + 전자 나 효소가없는 솔루션, 또는 P hosphate-는 gigaseals의 수와 질에 심각한 영향없이 세포를 해제 사용할 수있다 . 그러나 어떤 경우에는, 트립신 처리 세포가 더 약해한다. 이러한 경우에, 세포는 실험을 시작하기 전에 약 30 분 동안 회복 할 수있다. <ol><li> 10 ml의 칼슘없이 PBS 2 + Mg를 2 +로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 3 분 동안 요리를 같은 비 효소 세포 분리 솔루션으로 효소가없는 분리기 용액 2 ㎖를 추가하고 품어. </li><li> 세포의 분리를 확인하기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다. 필요한 경우, 이동 CELL 배양 접시 더 세포를 분리하지만 가볍게 할. 참고 : 접시를 흔들지 마십시오. </li><li> DMEM + 10 % FBS 10 ML을 추가하고 부드럽게 및 10 ml의 피펫 다섯 번 아래로 세포를 피펫. </li><li> 현미경으로 세포 봐. 셀&gt; 80 %가 이미 (싱글)을 분리하는 경우, 더 피펫 팅이 필요하지 않습니다. 세포 클러스터 여전히 경우 80 % 이상의 세포가 하나가 될 때까지, 부드럽게 피펫 팅을 반복한다. </li><li> 100 XG에 2 분, 15 ML 원뿔 튜브에 원심 분리기를 정지 세포의 ~ 10 ml에 배치하고 상층 액을 버린다. </li><li> 세포를 재현 탁하기 - 외부 기록 솔루션 ~ 200 μl를 사용 (증류수로 310 mOsm 라이 보 비츠의 L-15 배지는 305로 조정). 셀의 광 제어 부드러운 막 가장자리 많은 단일 라운드 셀을 표시해야합니다. </li></ol></li><li> 패치 클램프 및 NLC 측정 <ol><li> 패치 클램프와를 사용하여 전압 의존 비선형 용량의 측정 (NLC)을 수행dequate 증폭기 및 소프트웨어뿐만 아니라 표준 전기 생리 학적 방법. 내부 (intrapipette) 용액 사용 150 밀리미터의 KCl, 1 ㎜의 MgCl 2, 0.1 mM의 EGTA, 2 mM의 ATP-마그네슘으로서, 0.1 mM의 GTP-나트륨, 10 mM의 HEPES; 트리스와 7.2로 산도를 조정합니다. </li><li> 현미경, 라운드 부드러운 막 가장자리 하나, 건강한 셀을 선택합니다. 세포 표면에 유리 피펫의 끝을 첨부하여 막 저항을 확인한다. 이는 1 ~ 2 ㎛, 피펫 팁의 내경 (ID)에 대응하는 약 3-6 수 MΩ이어야한다. </li><li> 조심스럽게 세포의 세포막에 대한 마이크로 피펫 팁을 누른 다음 흡입을 적용합니다. 100 기가 옴 (기가 시일) - 세포막의 일부 (10)의 순서로 전기 저항을 발생 피펫으로 흡입한다. </li><li> 흡입 펄스와 세포막을 파괴하여 전체 셀 조건을 확립한다. </li><li> 제어 9로, 같은 HEK-293과 같은 prestin을 표현하지 않는 세포를 사용하여. 참고 : 현재 응답은 5 kHz에서 필터링해야하고, 수정 잔류 직렬 저항의 효과를했다. 모든 데이터 수집 및 분석은 가장 일반적으로 로크 증폭기가 포함 된 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. 용량 함수는 막 전압 16 비선형 전하 관한 두 상태 볼츠만 함수의 1 차 도함수에 장착 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 기존 또는 잠재적인 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 보고서에서 우리는 어떻게 문화 HEI-OC1 세포에 대해 설명하고 약물 유발 세포 독성의 메커니즘을 평가하기 위해 그들을 사용하고 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사. 기술적 방법은, 그러나, 다른 연구에 쉽게 적응 될 정도로 일반적이다. 여기에 설명 된 모든 프로토콜은 잘 확립 된 세포 배양 기술 (10)의 올바른 사용을 필요로한다. 그냥 다른 세포주와 마찬가지로, HEI-OC1 세포와 함께 작업하는 인증 된 생물 안전 캐비닛, 냉장 원심 분리기, 물 목욕, 세포 배양 검사에 대해 하나의 반전 현미경 및 계산 셀에 대한 제대로 갖추고 세포 배양 설비를 필요로 hemocytometric 기술을 사용하는 경우. 고유 한 요구 사항은, 그러나, NP-HEI-OC1 세포 39 ° C / 5 % CO 2에서 P-HEI-OC1 세포를 33 ° C / 10 % CO 2에서 두 가습 인큐베이터, 한...

코르티 1의 하우스 귀 연구소 - 오르간은 (HEI-OC1) 세포를 형질 전환 마우스 1, 2의 청각 기관에서 파생됩니다. 33 ° C / 10 % CO 2 (허용 조건)에서이 형질 전환 마우스에서 어떤 세포의 배양은 역 분화 가속 확산을 트리거하는 불멸화 유전자의 발현을 유도; 39 ° C / 5 % CO 2 이상의 HEI-OC1, 세포사 2,3의 경우에, 증식, 분화를 감소하고 (비 허가 조건) 리드 세포 이동. HEI-OC1 세포를 복제하고, 10 년 전을 통해 우리의 실험실에있어서, 초기 연구는 특정 같은 prestin, 마이 오신 7A, Atoh1, BDNF, calbindin 및 칼 모듈 린 등의 인공 와우 유모 세포의 마커뿐만 아니라, 지원의 마커를 표현하는 지적했다 넥신 (26) 및 섬유 모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 등이 세포. 따라서, 평 OC1이 commo을 나타낼 수 있음을 시사되었다코르티 2의 기관의 감각과지지 세포 n 개의 전구. 페니실린과 같은 비 ototoxic 간주 약물, 2,3하지 않았다 동안 병렬 연구는 이러한 세포에서 카스파 제 -3 활성화 유도 시스플라틴 (cisplatin), 겐타 마이신과 스트렙토 마이신과 같은 ototoxic 약물을 원형 강력한 증거를 제공했다. 따라서,이 세포주는이 독성과 가능성이 독성하거나 새로운 pharmacological 약물 otoprotective 특성 선별 과정에도 세포 및 분자 메커니즘을 조사하기 시험 관내 시스템이 제안되었다. HEI-OC1 세포는 지난 10 년에 출판 이상의 백오십 연구에 사용 된 것으로 추정된다. 다른 약물의 잠재적 프로 - 세포 사멸 효과를보고하는 것은,이 세포주를 포함하는 대부분의 연구의 중요한 목표 이었지만, 자식 작용 및 노화와 같은 다른 중요한 세포 공정은 단지 HEI-OC1 세포 4-7 조사하기 시작했다. 나는NA는 우리의 실험실 (8)의 최근 연구는, 우리는 자주 병원에서 사용되는 다른 약물 약물에 의해 유도 된 세포 죽음, 생존, 증식, 노화와 자식 작용에 대한 데이터의 포괄적 인 세트를 수집하는 HEI-OC1 세포를 사용했다. 또한 동일한 처리를 수신하는 HEK-293 (인간 배아 신장 세포)와 헬라에서 해당 (인간 상피 세포)와 HEI-OC1 세포의 응답의 일부를 비교 하​​였다. 우리의 결과는 HEI-OC1 세포 연구중인 메커니즘 중 적어도 하나에 특유의 투여 량 및 시간 의존적 감도 특징적인 방식으로 각각의 약물에 반응 것으로 나타났다. 또한 실험 결과의 정확한 해석은 하나 이상의 기술 8과 평행 연구를 수행 할 필요하다고 그 연구에서 강조 하였다. 다른 연구에서는 prestin의 기능적 응답하여, 인공 모발 외부 셀 모터 단백질 (OHCs) 9를 평가 HEI-OC1 세포의 사용을 검토 </s&gt;입니다. 우리는 허용 (P-HEI-OC1) 및 비 - 배양 HEI-OC1 셀 내의 prestin 발현 패턴뿐만 아니라 비선형 커패시턴스 (NLC) 및 전체 셀 패치 클램프 실험을 유동 세포 계측법 및 공 초점 레이저 주사 현미경 연구보고 허용 (NP-HEI-OC1) 조건. 우리의 결과는 표기된 NP-HEI-OC1 세포에서 시간 의존적으로 총 prestin 발현 세포막 파악 증가 모두. 흥미롭게도 또한 발견 총 세포 발현에 상당한 변화없이 세포질로 세포막에서 전좌 나 + K + ATPase의 감소와 상관 관계가 NP-HEI-OC1 세포의 세포막에 prestin 지역화 증가. 또, P-HEI-OC1 세포는 강력한 NLC는 세포막에 존재 prestin 분자의 밀도가 증가 할 때 감소 된 운동 기능을 prestin하는 관련 있다고 설명했다. 요컨대, 이러​​한 결과는 강하게 HEI-OC의 유용성을 지원1 세포는 청각 단백질을 조사합니다. 이 비디오 기사에서 우리는 어떻게 약물 유발 세포 독성 및 방법의 메커니즘 / S를 평가하는 방법은 세포 독성 연구에 대한 (P-HEI-OC1) 허용 조건에서 성장 세포를 사용하는 것이 편리하다 왜 문화 HEI-OC1 세포에 설명 전기 생리 연구를 수행하기 위해 (예를 들어, 패치 클램프, 비선형 커패시턴스 (NLC))는 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사한다.

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1 셀</td><td></td><td></td><td>모든 분석 키트, 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>Class II 생물 안전 작업대</td><td>: The Baker Company</td>, <td>Sterilgard III</td><td>및</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PREVIOUS 2 COLUMNS에</td></tr> 표시된 회사는 <tr><td>도립 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXAMPLES 및 기타 유사한</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>제품만 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>세포 인큐베이터 2개, 33°C에 1개; C/10% CO2 및 39°C에 다른 사람; C/5% CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시, PS, 100 mm x 20 mm, 통풍구 포함</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시, PS,&nbsp; 60 mm x 15 mm, 통풍구 포함&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 조직 배양 플라스크&nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 조직 배양&nbsp; 플라스크 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 6 웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 조직 배양 플레이트, 96 웰, 뚜껑이 있는 평평한 바닥</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-웰 화이트, 투명 바닥</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브와 캡 Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브와 캡-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 의 변형된 독수리' s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 매체, 페놀 없음 레드</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>트립신, 0.25%&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT 세포 증식 분석 키트</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 분석 키트&nbsp;</td><td>키트 Promega</td><td>&nbsp; G8091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU 세포 증식 분석 키트&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>비효소 세포 해리 용액&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit Promega</td><td></td><td>&nbsp; G8741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII 기기&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>&nbsp; FACSAriaIII</td><td>, 488 nm 여기(블루 레이저)</td></tr><tr><td>가 있는 디지털 블롯 스캐너,</td><td>LI-COR</td>, <td>C-DiGit</td><td></td></tr>, <tr><td>전기영동 및 블로팅 유닛</td>, <td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr>, <tr><td>Spectra Max 5 Plate Reader, Soft Max Pro 5.2 소프트웨어가 포함된</td><td>Molecular Devices</td>, <td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td>, <td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Puller for preparation용 패치 전극</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

청각 hei-oc1 세포를 사용한 작업

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1은 연구 목적으로 사용할 수 있는 몇 안 되는 마우스 청각 세포주 중 하나입니다. 원래 이독성 약물 스크리닝을 위한 체외 시스템으로 제안된 이 세포는 약물 활성화 세포사멸 경로, 자가포식, 노화, 세포 보호 메커니즘, 염증 반응, 세포 분화, 약리학적 약물의 유전 및 후성유전학적 효과, 저산소증의 영향, 산화 및 소포체 스트레스, 분자 채널 및 수용체의 발현을 조사하는 데 사용되었습니다. 달팽이관 유모 세포의 몇 가지 중요한 표지자 중에서도 HEI-OC1 세포는 외부 유모 세포의 패러다임 운동 단백질인 프레스틴을 내인성으로 발현합니다. 따라서 이 중요한 청각 단백질의 새로운 기능적 측면을 밝히는 데 매우 유용할 수 있습니다. HEI-OC1 세포는 매우 견고하며, 이들의 배양은 일반적으로 큰 합병증을 일으키지 않습니다. 그러나 스트렙토마이신이나 기타 항생제를 함유한 일반적인 항균 칵테일의 사용을 피하고, 세포 증식을 자극하기 위해 33°C에서 배양하고, 세포 분화를 유발하기 위해 39°C에서 배양하는 것과 같은 몇 가지 특별한 조건이 필요합니다. 여기에서는 HEI-OC1 세포를 배양하는 방법과 세포 증식, 생존력, 사멸, 자가포식 및 노화와 같은 일반적인 분석에서 HEI-OC1 세포를 사용하는 방법, 패치 클램프 및 비선형 커패시턴스 측정을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

최근 출판물의 몇에서 우리는 몇 가지 일반적으로 사용되는 약물 약물 HEI-OC1 세포의 반응을 평가뿐만 아니라 prestin 기능 8,9을 조사하기위한 연구의 포괄적 인 세트를보고했다. 이 연구에서 우리는 이전 섹션에 설명 된 모든 프로토콜을 사용했다. 이들 이전 연구의 결과들 중 하나는 HEI-OC1 세포가 비 - 허용 조건에서 배양하는 것이 있었다 (39 ° C / 10 % CO 2 = NP-HEI-OC1)가 세포 생존 능력에 매우 크게 감소하고 똑같이 현저한 증가를 보였다 세포 죽음, 허가 조건에서 배양 된 세포에 대해서 (33 ° C / 10 % CO 2 = P-HEI-OC1) (도 1). 따라서, 어떤 세포 독성 연구는 배양 조건의 영향에서 식별 약물 효과에 상...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1)은 현재 연구 목적으로 사용할 수 있는 몇 안 되는 마우스 청각 세포주 중 하나입니다. 이 프로토콜은 HEI-OC1 세포를 사용하여 약리학적 약물의 세포독성 효과와 내이 단백질의 기능적 특성을 조사하는 방법을 설명합니다.

청각 HEI-OC1 세포를 사용한 작업

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 청각 세포에 대한 약리학적 약물의 효과를 연구하고 모터 단백질인 prestin의 기능적 특성 분석을 돕는 데 사용될 수 있는 HEI-OC1 세포의 기본적인 취급 절차를 설명하는 것입니다. HEI-OC1 세포는 전 세계의 많은 연구자들에 의해 서로 다른 목적과 기술을 사용하는 다양한 실험에 활용되고 있습니다. 본 문서에서 설명하는 절차들이 이러한 연구들을 서로 비교 가능하게 만드는 공통된 기초를 제공할 수 있기를 바랍니다.물론, 이러한 실험 절차는 더욱 개선될 수 있습니다. 하지만 본 문서에 기술된 절차와의 차이점은 상충될 수 있는 결과를 이해하고 설명하는 핵심 요소가 될 수 있습니다. 본 시연에서는 냉동 분주액(aliquot) 상태에서 시작하여, 널리 사용되는 기술로 다양한 연구를 수행할 수 있도록 HEI-OC1 세포 샘플을 준비하는 방법을 설명하겠습니다.이 절차를 시작하려면, 액체 질소에서 냉동 보존된 HEI-OC1 세포 바이알을 꺼내 37 °C의 워터배스에 넣습니다. 바이알의 하단 절반만 담그고, 바이알 내부에 소량의 얼음만 남을 때까지 해동합니다. 생물안전작업대 내에서 바이알 외부를 70% 알코올로 닦아냅니다.그 다음, 바이알에서 세포를 피펫으로 취해 10% FBS가 첨가된 DMEM과 같이 미리 데워둔 성장 배지 10 mL가 들어있는 15 mL 원뿔형 튜브에 전체 부피를 천천히 한 방울씩 떨어뜨려 넣습니다. 이어서, 튜브를 5분 동안 원심 분리하여 DMSO를 제거합니다. 5분 후, 상층액을 버리고 세포를 9 mL의 신선한 성장 배지에 재부유시킵니다.피펫 팁이 튜브 바닥에 닿게 하여 현탁된 세포를 피펫과 배지 사이에서 3~4회 반복적으로 옮겨 섞어줌으로써 뭉쳐 있거나 층을 이룬 세포 덩어리를 분리합니다. 그 다음, 성장 배지에 현탁된 세포 전체 부피를 직경 100 millimeter의 처리되지 않은 플라스틱 세포 배양 접시에 넣습니다. 세포를 33 °C, 10% CO2 조건에서 배양합니다.이 단계에서는 기존 배지를 제거하고 2 mL의 PBS로 세포를 세척합니다. 그다음, 세포 단층을 0.25% trypsin으로 덮습니다. 세포의 40%가 떨어져 나왔을 때 도립 현미경을 사용하여 세포 상태를 확인합니다.필요한 경우, 배양 접시를 부드럽게 흔들어 남아 있는 부착 세포들을 떼어냅니다. 튜브를 5분 동안 원심 분리하여 세포를 재현탁하고 트립신을 제거합니다. 그 후, 상층액을 버리고 9 mL의 신선한 성장 배지에 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 피펫 팁이 튜브 바닥에 닿게 하여 현탁된 세포를 피펫과 배지 사이로 3~4회 반복적으로 옮겨주며 세포 덩어리나 층을 분산시킵니다.세포를 100 mm 직경의 세포 배양 접시에 접종합니다. 33 °C, 10% CO2 조건에서 배양하며, 계획된 실험이나 새로운 스톡 제작을 위해 필요한 만큼 분할 배양합니다. 분화를 위해 HEI-OC1 세포를 허용 조건에서 약 80% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 배양합니다.그런 다음, 세포를 39 °C, 5% CO2 조건에서 2~3주 동안 배양하고, 죽은 세포를 제거하기 위해 이틀마다 배지를 교체합니다. 자동 세포 계수기 또는 혈구계(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하여 이 절차를 시작하고, 세포 농도를 필요한 값으로 조정합니다. 다음으로, 세포를 96-well 투명 평底 플레이트, 흰색 벽면 96-well 플레이트 또는 6-well 플레이트에 접종합니다.특정 분석법에서 요구되는 경우, 관심 약물을 처리하기 전 기질 부착을 위해 세포를 하룻밤 동안 배양하십시오. 그 다음, 유세포 분석법이나 다른 적절한 기술을 사용하여 처리 결과를 측정하십시오. 세포를 회수하려면 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 10 milliliters로 세포를 두 번 세척하십시오.효소 미포함 분리 용액(detacher solution) 2 mL를 넣고 37 °C, 5% CO2 조건에서 세포를 3분 동안 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 세포의 분리 여부를 확인합니다. 필요한 경우, 세포 배양 접시를 부드럽게 움직여 더 많은 세포를 분리시키되, 흔들리지 않도록 주의하십시오.다음으로, 10% FBS가 포함된 DMEM 10 milliliters를 첨가하고 파이펫으로 세포를 다섯 번 부드럽게 위아래로 섞어줍니다. 그 후, 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포의 80% 이상이 이미 분리되었다면, 더 이상의 파이펫팅은 필요하지 않습니다.세포가 여전히 덩어리진 상태라면, 세포의 80% 이상이 덩어리에서 벗어날 때까지 조심스럽게 파이펫팅을 계속합니다. 광학적으로 관찰했을 때 세포들이 매끄러운 막 가장자리를 가진 단일 원형 세포 형태로 많이 보여야 합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 패치 클램프 및 NLC 측정을 진행합니다.비허용 조건에서 배양된 HEI-OC1 세포는 허용 조건에서 배양된 세포와 비교했을 때 세포 생존력은 매우 유의미하게 감소하고, 세포 사멸은 그만큼 유의미하게 증가하는 것으로 나타났습니다. 이미 사멸 중이거나 생존력이 감소한 세포에 미치는 약물 효과는 건강한 세포에 미치는 동일 약물의 효과와 다를 수 있으므로, NP-HEI-OC1 세포를 이용한 모든 세포독성 연구에서는 약물의 효과와 배양 조건의 효과를 구분하는 데 상당한 노력을 기울여야 합니다. 따라서 분화된 세포가 특별히 필요하지 않은 실험에는 허용 조건에서 배양된 HEI-OC1 세포를 사용할 것을 권장합니다.여기에 제시된 공초점 이미지들은 33 °C 및 39 °C에서 배양된 HEI-OC1 세포에서 청각 운동 단백질인 prestin의 발현을 확인시켜 줍니다. 허용 조건에서 성장하는 HEI-OC1 세포의 경우 prestin이 주로 세포질에 면역 국소화되는 반면, 더 분화된 세포에서는 세포막에 더 집중되어 있음에 유의하십시오. 유세포 분석 연구 결과, 두 조건 모두에서 prestin 발현이 뚜렷하게 증가한 것으로 나타났으며, 이는 전위(translocation)가 더 많은 prestin 분자의 합성을 동반했음을 시사합니다.반면에, 전기생리학적 연구 결과 33 °C에서 배양된 HEI-OC1 세포에서 강력한 NLC가 관찰되었으며, 세포를 비허용 조건에서 1주 및 2주 동안 배양함에 따라 피크 값이 감소하고 피크 커패시턴스 전압이 더 탈분극된 값으로 이동하는 것이 나타났습니다. 흥미롭게도, 이러한 결과는 형질막 내 prestin 분자의 밀도가 너무 높을 경우 운동 기능이 저하될 수 있음을 시사합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 잘 확립된 세포 배양 기술을 정확하게 사용하는 것이 중요하다는 점을 유의하십시오.또한, 항생제 사용을 피하십시오. 아울러 HEI-OC1 세포의 표현형과 반응은 배양 조건에 따라 크게 달라질 수 있음을 유의하시기 바랍니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

포유류의 달팽이관에있는 내부 헤어 셀 리본 버렸네에서 청각 신경 섬유 dendrites에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음.

달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의​​해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

인공 와우 (CI를) 청각 신경에 직접 전기 자극으로 청각 수 있습니다. 그러나 가난한 빈도와 강도 해상도의 CI와 청각의 품질을 제한합니다. 여기에서 우리는 청각 연구와 미래의 CI 개발을위한 대안 전략으로 생쥐에서 청각 신경의 optogenetic 자극을 설명합니다.

청각 신경의 자극 Optogenetic

동물 모델의 달팽이관에 이독성 물질을 도입하는 다양한 방법이 있습니다. 제시된 것은 이독성 물질을 둥근 창 틈새에 전달하기 위한 수술 프로토콜입니다. 이 절차는 신뢰할 수 있고, 표적화된 달팽이관 내 병변을 생성하며, 마이크로아키텍처에 대한 기계적 손상을 방지합니다. 달팽이관 자가 수리/재생에 대한 검사가 가능합니다.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

불멸의 다능 난이전구세포(iMOP) 세포와 이암 분화를 유지하기 위한 현재 프로토콜에 대해 설명합니다.  감각 상피(sensory epithelia)와 나선형 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)으로의 분화를 나타내는 배양 조건과 분자 마커가 강조되어 있습니다.

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이 프로토콜에는 출생 후 쥐 새끼에서 청각 brainstem 응답을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 외부 머리 세포의 기능 개발 조사, 고립 된 외부 머리 세포에 기록 하는 전체 셀 패치 클램프 실험 절차 단계별 설명 합니다.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

달팽이 관 임 플 란 트의 동물 모델 영구 난청 전기 자극 치료의 기술 기반 지식을 사전 수 있습니다. 이 연구는 급성 굉음을 쥐 청각 brainstem 응답 기능 평가 있는 전극 배열 인공 와우 이식 수술 프로토콜을 제공합니다.

인공 와우 수술 및 C57BL/6 마우스에 전기 evoked 청각 Brainstem 응답 기록

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성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

여기서 우리는 호핑 프로브 이온 전도 현미경 검사법 (HPICM)에 대한 프로토콜을 제시, 라이브 청각 헤어 셀에서 스테레오실리의 나노 스케일 이미징을 허용하는 비 접촉 스캐닝 프로브 기술.

살아있는 포유류 청각 머리 세포에 있는 나노 규모 해상도를 가진 스테레오실리모들 화상 진찰

미니어처 돼지(미니 돼지)는 인공와우 연구에 이상적인 대형 동물 모델입니다. 미니 돼지의 인공와우 이식 수술은 인간과 유사한 생체 시스템에서 새로운 전극 어레이 및 수술 접근법의 안전성과 잠재적 성능에 대한 초기 증거를 제공하는 데 활용될 수 있습니다.

미니어처 돼지: 인공와우 연구를 위한 대형 동물 모델

여기에서, 우리는 마우스에서 일차 달팽이관 유모 세포를 분리하고 배양하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 처음에는 Corti의 장기를 현미경으로 신생아(3-5일령) 쥐 달팽이관에서 절개했습니다. 이어서, 세포를 효소에 의해 단일세포 현탁액으로 절단하고, 배양에서 며칠 후에 면역형광을 이용하여 확인하였다.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

학습하세요 HEI-OC1 세포 배양 및 약물 독성 연구 방법을. 마우스 청각 세포계를 활용한 prestin 단백질 기능 분석과 표준화된 실험 절차를 통해 청각 연구의 재현성을 높입니다.

청각 HEI-OC1 세포를 사용한 작업

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