청각 HEI-OC1 세포를 사용한 작업

이 프로토콜의 전반적인 목표는 HEI-OC1 세포에 대한 약리학적 약물의 효과를 연구하고 운동 단백질 프레스틴의 기능적 특성화를 지원하는 데 사용할 수 있는 HEI-OC1 세포에 대한 기본 절차를 설명하는 것입니다. HEI-OC1 세포는 전 세계의 많은 연구자들이 서로 다른 목표와 기술을 사용하여 다양한 실험에서 사용합니다. 바라건대, 여기에 설명된 절차가 이러한 연구를 비교할 수 있는 공통 기반을 제공할 수 있기를 바랍니다.

물론 이러한 실험 절차는 더욱 개선될 수 있습니다. 그러나 여기에 설명된 것과의 차이점은 모순될 수 있는 결과를 이해하고 설명하는 열쇠가 될 수 있습니다. 이 시연에서는 냉동 분취액에서 시작하여 널리 사용 가능한 기술로 다양한 연구를 수행할 수 있도록 샘플을 준비하는 것까지 HEI-OC1 세포로 작업하는 방법을 설명합니다.

이 절차를 시작하려면 액체 질소에서 동결 보존된 HEI-OC1 세포 바이알을 제거하고 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 바이알의 아래쪽 절반만 담그고 바이알에 소량의 얼음만 남을 때까지 해동시킵니다. 생물 안전 캐비닛에서 바이알 외부를 70% 알코올로 닦습니다.

그런 다음 바이알의 세포를 피펫으로 주입하고 10% FBS가 보충된 DMEM과 같은 10ml의 예열 성장 배지가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 전체 부피를 천천히 한 방울씩 전달합니다. 그런 다음 튜브를 5분 동안 원심분리하여 DMSO를 제거합니다. 5분 후, 상등액을 버리고 9ml의 신선한 성장 배지에 세포를 재현탁합니다.

끝이 튜브의 바닥에 닿도록 피펫과 배지 사이의 부유 세포를 3-4회 플럭스 및 역류하여 세포의 덩어리 또는 시트를 분해합니다. 그런 다음 성장 배지에 현탁된 세포의 총 부피를 100mm 직경의 처리되지 않은 플라스틱 세포 배양 접시에 놓습니다. 섭씨 33도에서 10%CO2로 세포를 배양합니다.

이 단계에서는 기존 배지를 제거하고 2ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포 단층을 0.25%트립신으로 덮습니다. 세포의 40%가 분리되었을 때 도립 현미경을 사용하여 세포를 검사합니다.

필요한 경우 배양 접시를 부드럽게 흔들어 남아 있는 세포를 방출합니다.세포를 재현탁하고 튜브를 5분 동안 원심분리하여 트립신을 제거합니다. 그 후, 상등액을 버리고 9 밀리리터의 신선한 성장 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 다음으로, 피펫과 배지 사이의 부유 세포를 플럭스 및 역류하여 피펫 끝이 튜브 바닥에 닿도록 3-4회

직경 100mm의 세포 배양 접시에 세포를 파종합니다. 섭씨 33도에서 10%CO2로 배양하고 계획된 실험에 필요한만큼 나누거나 새로운 재고를 생성합니다. 분화를 위해 HEI-OC1 세포가 약 80% confluence에 도달할 때까지 허용 조건에서 배양합니다.

그런 다음 섭씨 39도에서 5% CO2로 세포를 2-3주 동안 배양하고 격일로 배지를 교체하여 죽은 세포를 제거합니다. 자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포를 계수하여 이 절차를 시작하고 세포 농도를 필요한 값으로 조정합니다. 다음으로, 96웰 투명 평면 바닥 플레이트, 흰색 벽의 96웰 플레이트 또는 6웰 플레이트에 세포를 파종합니다.

특정 분석에서 필요한 경우, 관심 약물로 치료하기 전에 기질 부착을 위해 세포를 밤새 배양합니다. 그런 다음 유세포 분석 또는 다른 적절한 기술로 치료 결과를 측정합니다. 세포를 채취하려면 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 10ml로 두 번 씻습니다.

2ml의 효소가 없는 분리 용액을 넣고 섭씨 37도에서 5%CO2로 3분 동안 세포를 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 세포의 분리를 확인합니다. 필요한 경우 세포 배양 접시를 부드럽게 움직여 더 많은 세포를 분리하고 흔들지 않도록 주의합니다.

다음으로, 10ml의 DMEM과 10%FBS를 첨가하고 세포를 위아래로 부드럽게 5회 피펫팅합니다. 그런 다음 현미경으로 세포를 살펴보십시오. 세포의 80% 이상이 이미 분리된 경우 더 이상의 피펫팅이 필요하지 않습니다.

세포가 여전히 클러스터에 있는 경우 세포의 80% 이상이 더 이상 클러스터에 있지 않을 때까지 부드럽게 피펫팅을 계속합니다. 세포의 광학 제어는 부드러운 멤브레인 가장자리를 가진 많은 단일 원형 세포를 표시해야 합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 patch-clamp 및 NLC 측정을 진행합니다.

비허용 조건에서 배양된 HEI-OC1 세포는 세포 생존율이 매우 유의하게 감소했으며, 허용 조건에서의 세포 배양과 관련하여 세포 사멸도 동등하게 유의하게 증가했습니다. 이미 죽어 있거나 생존력이 감소한 세포에 대한 약물 효과는 건강한 세포에 대한 동일한 약물의 효과와 다를 수 있기 때문에 NP-HEI-OC1 세포에 대해 수행되는 모든 세포 독성 연구에서 배양 조건의 영향과 약물 효과를 구별하기 위해 상당한 노력을 기울여야 합니다. 따라서 특별히 분화된 세포가 필요하지 않은 실험에는 허용 조건에서 배양된 HEI-OC1 세포를 사용하는 것이 좋습니다.

여기에 표시된 컨포칼 이미지는 섭씨 33도와 섭씨 39도에서 배양된 HEI-OC1 세포에서 청각 운동 단백질 프레스틴의 발현을 확인합니다. 프레스틴은 대부분 허용 조건에서 성장하는 HEI-OC1 세포의 세포질에서 면역국소화되며, 더 분화된 세포의 원형질막에 더 집중되어 있습니다. 유세포 분석 연구는 두 조건 모두에서 프레스틴 발현의 뚜렷한 증가를 보여주었으며, 이는 전좌가 더 많은 프레스틴 분자의 합성을 동반한다는 것을 시사합니다.

반면, 전기생리학적 연구에서는 HEI-OC1 세포에서 섭씨 33도에서 성장하는 강력한 NLC를 보여주었으며, 피크 값이 감소하고 피크 커패시턴스에서의 전압이 세포가 1주 및 2주 동안 비허용 조건으로 이동함에 따라 더 탈분극된 값으로 이동했습니다. 흥미롭게도, 이러한 결과는 원형질막의 프레스틴 분자 밀도가 너무 높을 경우 운동 기능이 손상될 수 있음을 시사합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 잘 정립된 세포 배양 기술의 올바른 사용을 요구한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

또한 항생제 사용을 피하는 것을 잊지 마십시오. 또한 HEI-OC1 세포의 표현형과 반응은 배양 매개변수에 크게 의존한다는 점을 기억하십시오.