Name: 치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 학습하세요 RGD-기능화 하이드로겔 합성 방법으로 조직 공학 및 세포 치료에 활용하세요. CuAAC와 마이크로파 보조 폴리콘덴세이션을 사용하여 척수 손상 치료와 재생 의학 연구에 적용할 수 있습니다.

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저자는 언어 편집을위한 유익한 토론을위한 교수 마우리 치오 MASI 미스 키아라 Allegretti에게 감사의 말씀을 전합니다. 저자의 연구는 반도 히오바니 Ricercatori 2010 (Ministero 델라 경례 GR-2010-2312573)에 의해 지원됩니다.

주 : 수신 한 화학 물질이 사용된다. 선형 RGD 구입되지만 FMOC 표준 고체상 펩타이드 합성 16, 19에 의해 제조 될 수있다. 용제는 분석 등급의이다. 투석 차단 동일 3,500 다 승 M과 멤브레인의 사용을 요구한다. 합성 된 화합물 1 400 메가 헤르츠 분광기하여 클로로포름에 기록 H NMR 스펙트럼 (CDCl3 중) 또는 용매와 같은 산화 중수소 (D 2 O)을 특징으로하고, 화학적 이동은 백만 분의 δ 값으로보고된다. 또한, 하이드로 겔을 KBr 펠렛 기술을 이용하여 FT-IR 분석을 실시하고 그 물리적 특성은 37 ° C에서 반전 된 테스트 튜브를 사용하여 평가 겔화 과정을 포함한다. 4 Azidobutanoyl 1. 합성 염화 1 <ol><li> 디클로로 메탄 10 ㎖ 및 디메틸 포름 아미드 0.5 ㎖에 azidobutanoic -4- 카복실산 (3.90 mmol)을 500 mg의 녹인다. </li><li> 0 ° C에서 상기 용액을 냉각빙욕을 사용. </li><li> 교반하면서, 반응계를 서서히 적가 디클로로 메탄 5 ㎖에 옥 살릴 클로라이드 (5.85 mmol)을 505 μl를 첨가하고. </li><li> 빙욕을 사용하여 0 ℃에서 1 시간 후, 실온으로 복귀. </li><li> 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 제거 하였다. </li><li> CDCl3 중 16 샘플을 용해시키고, 1 H-NMR 분광법에 의해 얻어진 생성물을 특성화. </li></ol> 파생 RGD-아 지드 2의 2. 합성 <ol><li> 1 M NaOH를 1 ml의 RGD 50 밀리그램 (0.145 밀리몰)을 녹인다. </li><li> 테트라 히드로 푸란 2 ㎖에 1 (0.16 밀리몰)에 24 mg의 녹인다. </li><li> 빙욕을 사용하여 0 ℃에서 적가 한 용액에 RGD 용액 모두를 추가한다. </li><li> 실온으로 돌아가서 밤새 교반. </li><li> 1 M 염산 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 제거 하였다. </li><li> OBT를 특성화ained 1 H-NMR 분광법으로 제품, D 2 O (16)에 시료를 용해. </li></ol> 3. PAA 알킨 수정 (3) <ol><li> 증류수 15 ml의에서 PAA 용액 (2.8 mmol)의 W / W 35 % 200 mg을 녹이고. </li><li> propargylamine 하이드로 클로라이드 (0.20 mmol)을 15.4 mg을 추가합니다. </li><li> 1 v / V를 아세토 니트릴 : 1의 14 ml의 1- 히드 록시 벤조 트리아 졸 수화물 42.8 mg의 (의 HOBt, 0.28 밀리몰)을 녹이고 50 ℃로 가열하여 증류수 솔루션을. </li><li> 실온에서 PAA 수용액으로의 HOBt 용액 전부를 추가한다. </li><li> 반응 혼합물에 ethyldimethylaminopropylcarbodiimide 53.6 mg의 (EDC, 0.28 밀리몰)을 추가한다. </li><li> 5.5로 pH를 조정하고, 실온에서 밤새 반응 시스템을 교반하고 1 M 염산을 사용한다. </li><li> 솔루션을 투석. 증류수 2 L의 염화 나트륨 11.2 g을 용해하고 염산 W / W 37 % 0.2를 가하여. 3.5 kDa의 컷오프의 승 M의 멤브레인을 사용하여 상기 용액을 투석. </li><li> PERFO3 일 동안 RM 투석. 염산 w / w 37 %, 0.2 mL를 함유 갓 준비한 증류수 2 L 매일 투석액을 변경한다. </li><li> -80 ° C에서 최종 솔루션을 저장합니다. 제조사의 프로토콜에 따른 동결 건조기로 동결 건조. </li><li> D 2 O (16)의 샘플을 용해시키고, 1 H-NMR 분광법으로 기능화 중합체 특성화. </li></ol> PAA-RGD 4. 합성 고분자 (4) <ol><li> PAA 78 mg을 증류수 10ml에 알킨 3 (1.083 밀리몰)을 수정 녹인다. </li><li> 테트라 히드로 푸란 5 ㎖에 RGD 지드 유도체 2 (0.0722 mmol)를 25 mg의 녹인다. </li><li> 고분자 용액에 RGD 솔루션을 모두 추가합니다. </li><li> 요오드화 구리 (0.0116 mmol) 및 아스 코르 빈산 나트륨 2.2 mg의 (0.0111 mmol)을 2.2 mg을 추가합니다. </li><li> 교반하면서 60 ℃에서 생성 된 혼합물을 밤새 환류시켰다. </li><li> 25 ℃로 혼합물을 냉각. </li><li> Dialyz솔루션을 전자. 증류수 2 L의 염화 나트륨 11.2 g을 용해하고 염산 W / W 37 % 0.2를 가하여. 3.5 kDa의 컷오프의 승 M의 멤브레인을 사용하여 상기 용액을 투석. </li><li> 사흘 동안 투석을 수행합니다. 염산 w / w 37 %, 0.2 mL를 함유 갓 준비한 증류수 2 L 매일 투석액을 변경한다. </li><li> -80 ° C에서 최종 솔루션을 저장합니다. 제조사의 프로토콜에 따른 동결 건조기로 동결 건조. </li><li> D 2 O (16)의 샘플을 용해시키고, 1 H-NMR 분광법에 의해 얻어진 생성물을 특성화. </li></ol> 5. RGD-작용 하이드로 젤 합성 <ol><li> PBS를 준비. 증류수 50 ml의 PBS 염 645 mg을 용해. </li><li> 실온에서, 카보 머, 40 mg의 PBS (단계 5.1)의 용액에 9 관능 4 PAA 10 ㎎을 혼합 완전히 용해 (30 분)까지. </li><li> 솔루션에 PEG 400 mg을 추가하고 45 분 동안 교반 유지. </li><li> 교반을 중지하고 시스템이 30 분 동안 정착 할 수 있습니다. </li><li> 7.4으로 산도를 조정 1 N 수산화 나트륨을 사용합니다. </li><li> 얻어진 혼합물을 5 ml에, 아가로 오스 분말 25 mg을 추가합니다. </li><li> 일반적으로 30 초와 1 분 사이의 시간 동안, 끓는까지 500 W에서 마이크로파 방사선 시스템을 조사하고, 전자 기적으로 80 ° C까지 가열한다. </li><li> 온도가 50 ° C로 감소 될 때까지 상온에 노출 된 혼합물을두고 1의 용액을 수득하기 위해, PBS (단계 5.1) 5 mL를 추가 한 체적 비율. </li><li> 1.1 cm의 직경 (12) 멀티 웰 플레이트 포함 강철 실린더를 준비합니다. </li><li> 용액으로부터 500 ㎕를 분취 액을 가지고 각각의 강철 실린더에 배치합니다. </li><li> 시스템을 완전히 겔화 될 때까지 45 분 동안 휴식을 남겨주세요. </li><li> 하이드로 겔을 얻기 위해 스테인리스 집게를 사용하여 실린더를 제거한다. </li></ol> 치료 도구 6.로드 (의약품 또는 세포) <ol><li> 일을 반복5.1-5.7 주당 순이익. </li><li> 1 부피 비율 (이미 졸 상태로) 혼합물을 37 ℃에 도달 할 때, 1에서 최종 시스템을 얻기 위해, 원하는 약액 또는 세포 배양을 포함하는 용액 5 mL를 추가한다. </li><li> 반복 물리적 겔 내에서 포획 biocompounds와 고분자 네트워크를 얻을 수 5.9-5.12 단계를 반복합니다. </li></ol> 7. 하이드로 겔 특성 <ol><li> FT-IR 분석 <ol><li> 젤 형성 후, 24 시간 동안 증류수 250 mL를 상기 synthetized 하이드로 하나 소크. </li><li> 하이드로 겔이 침수되는 수성 용지를 제거하고 동결 건조 액체 N 2. </li><li> 을 KBr 펠릿 법에 따른 하이드로 겔 샘플을 라미네이트. <ol><li> 마노의 박격포로 KBr을 가득 주걱을 추가합니다. 하이드로 겔 샘플을 소량 취하고을 KBr 분말과 혼합합니다 (KBr을 양 또는 주걱의 선단을 덮도록 충분한 약 0.1 %). </li><li> 분말이 미세하고 균일 한 때까지 혼합물을 갈기. &lt;/ 리&gt; <li> 적외선 펠렛을 형성을 KBr 펠렛 키트를 사용한다. 수동 실험실 프레스를 사용하여 분말을 누릅니다 : 10t의 압력 용량의 3 분 후 5t 동일한 압력 용량에서 3 분. </li><li> 모양으로 균일하고 투명한 최종 펠렛을 얻기 위해 압력을 해제합니다. 적외선 샘플 홀더에 펠렛을 삽입하고 스펙트럼 (16)를 실행합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 겔화 연구 <ol><li> PBS 900 μL와 2 ML의 microcentrifuge 관을 채우고 37 ° C 평형. </li><li> 하이드로 겔을 형성하고 37 ℃에서 부화 제조 된 고분자 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> 튜브를 전환하고 겔이 1, 2, 5, 10 및 20 분에서 관찰 흐르면. 겔은 겔화 시간으로 흐르지 않는 시간을 기록한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없으며 이 원고를 준비하는 데 어떠한 대가도 받지 않았다고 밝혔습니다.

알킨 부분을 사용한 PAA 중합 후 변형과 아지드 그룹을 사용한 RGD 기능화는 폴리머와 펩타이드 사이의 안정적인 결합 형성을 보장합니다. 실제로, 트리아졸은 1,2,3-트리아졸 고리의 1,4 위치에 부착된 탄소 원자 사이의 단단한 연결 단위 역할을 하며 가수분해 또는 다른 방식으로 절단될 수 없습니다. 또한, 트리아졸은 벤제노이드 및 관련 방향족 헤테로사이클과 같은 다른 고리형 구조와 달리 산화 및 환원이 극히 어렵습니다24. 이러한 방식으로 PAA-RGD 생성물의 화학적 불안정성은 하이드로겔 합성의 실험 조건에서 거의 없습니다. 펩타이드는 화학 결합의 특성으로 인해 3D 고분자 네트워크에 접목되며 물리적으로 갇히지 않습니다(따라서 시스템을 떠날 수 있음).
알킨 PAA는 아민 유도체를 얻기 위해 EDC 및 HOBt가 있는 수용액에서 프로파르길아민을 사용하여 제조됩니다. 실험 결과는 PAA에 결합되는 삼중 결합의 백분율이 사용된 아민의 양에 비례한다는 것을 ...

하이드로 겔은 천연 또는 합성, 및 독특한 입체 구조 특징 친수성 가교 중합체에 의해 형성되는 삼차원 네트워크이다. 이 장치는 약물 전달, 조직 공학, 유전자 사업자와 스마트 센서 1, 2의 생물 의학 분야에서 점점 더 매력적이다. 실제로, 높은 수분 함량뿐만 아니라 유동 학적 및 기계적 특성들에게 연조직 미세 환경을 모방 수용성 사이토킨 또는 성장 인자의 전달을 위해 그들에게 효과적인 도구를 만들기에 적합한 후보를 만든다. 가장 유망한 사용 중 하나는 세포 및 생물 활성 화합물을 담지 주사 생체 같다. 생체 외 및 생체 내 실험 3,4에서 관찰 하이드로 겔은 잡고 정확하게 생리 관련 방식으로 줄기 세포 규제 신호를 제공함으로써 세포 생존 및 제어 줄기 세포 운명을 향상시킬 수 있습니다. 이것의 주요 장점은 가능성신체를 통해 모든 마이그레이션 및 대상 목표 (5)를 잃고, 순환 토런트로 지역과 extravasates 잎 세포의 양을 최소화 (현장에서) 접종의 영역 내 주입 된 세포를 유지합니다. 삼차원 네트워크 하이드로 겔의 안정성은 고분자 사슬 6 간의 공유 결합 또는 응집력에 의해 형성의 가교 부위에 기인한다. 이 프레임 워크에서는 직교 선택적 화학 고분자 사슬에 적용이 하이드로 겔 공연 (7)을 개선 할 수있는 다목적 도구입니다. 실제로, 적절한 화학기를 갖는 중합체의 변형은 세포 생존 및 조직 형성에서의 사용을 향상시키기 위해 적절한 화학적, 물리적 및 기계적 성질을 제공하도록 도울 수있다. 동일한 방식으로, 기술 중 RGD 펩티드의 사용은 세포 부착 및 생존율의 개선을 허용 겔 매트릭스 내에 세포 성장 인자를로드한다. RGD는 구성된 트리 펩티드이다지금까지 아르기닌, 글리신, 아스파르트 산, 가장 효과적인 인해 종종 하나 이상의 세포 부착 수용체를 처리 할 수있는 능력 및 세포 정박 동작 생존 8,9에 생물학적 충격 트리 펩티드를 사용. 본 연구에서는 RGD-작용 하이드로 겔의 합성은 친절 세포 미세 환경에 대한 충분한 생화학 적 특성을 특징으로 네트워크를 설계하는 목적으로 연구되고있다. 하이드로 젤 합성 마이크로파 방사선의 사용은 부반응을 최소화하고, 종래의 열 공정 (10)에 비해 짧은 시간에 높은 반응 속도 및 수율을 얻을 수있는 간단한 방법을 제공한다. 이 방법은 중합체의 상호 작용 및 반응 시스템 (11) 내의 유기 용매의 부재에 의한 정제 단계 및 수율 멸균 하이드로 겔을 필요로하지 않는다. 따라서, 어떤 모드 때문에 고분자 네트워크에 연결 RGD의 높은 비율을 보장합니다ifications 겔 형성에 관련된 고분자 화학 그룹으로 요구된다. 카르복실기, PAA와 카보 머, 하이드 록실 그룹, PEG에서 아가 로스에서 중축 합 반응을 통해 하이드로 겔 입체 구조를 야기. 언급 된 중합체는 척수 손상 수리먼트 (12) 하이드로 겔의 합성에 사용된다. 이러한 장치는 이전에보고 된 생체 적합성뿐만 아니라 많은 생체 조직들 및 요변 특성에 유사한 기계적 물리 화학적 특성을 보여, 13, 14 일. 또한, 그들은 주입의 영역에서, 현장에서 현지화 된 상태로 유지됩니다. 이 연구에서, PAA의 카르복실기 알킨 잔기 (도 1)를 수정하고 RGD 지드 화합물 구조 (CH 2) N으로 준비된 화합물과 트리 펩티드 단기 -NH (2)의 반응을 이용한 합성 - N 3 (&lt;강한&gt; 그림 2). 그 후, 수정 된 PAA는 CuAAC 클릭 반응 15-17 (그림 3)를 통해 RGD-아 지드 유도체와 반응한다. 구리 (I) 촉매를 사용하여 반응 속도 및 선택성 둘 다의 주요 개선 리드. CuAAC 반응은 유기 합성에서 폭넓게 중합체 과학 분야에서 사용된다. 이는 작용기 고효율 및 높은 내성을 결합하고, 유기 용매의 사용에 의해 영향을받지 않는다. 높은 선택성, 빠른 반응 시간 및 간단한 정제 과정은 원하는 부분 (18)을 이식 성 중합체, 블록 공중 합체 또는 사슬의 획득을 허용한다. 이 클릭 전략은 가능한 최종 생화학 응용 프로그램에 따라 물리 화학적 특성을 사용자 정의 할 수 중합 후 폴리머를 수정할 수 있습니다. CuAAC 실험 조건은 쉽게 (구리의 산화가 최소한으로 발생할 수있는 반면, 반응이 물에 민감하다) 재현, 그리고 자연이다졸 형성된 제품의 안정성을 보장한다. 구리 금속의 사용으로 인해 세포에 대한 잠재적 인 독성 효과 및 생물학적 미세 환경에서 중요한 점으로 간주 될 수 있지만, 투석 촉매 잔기의 완전한 제거를 허용하도록 정제 방법으로 사용된다. 마지막으로, PAA는 RGD 세포 또는 약물 담체로서 이러한 시스템의 잠재적 기능을 확인하기 위해 조사되는 하이드로 겔의 합성 (도 4) 및 생성 된 네트워크의 물리 화학적 특성에 사용되는 변성. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" /> 그림 1 : PAA는 알킨의 합성을 수정 알킨 그룹과 PAA의 작용의 방식을,. &quot;N&quot;은 카르복실기가 propargylamine와 반응에 단량체를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" /> 그림 2 :.. RGD-아 지드 합성 RGD-아 지드 유도체의 합성 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" /> 그림 3 : 반응을 클릭 제도 RGD-아 지드 유도체 및 알킨-PAA 사이 클릭 반응의.. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" /> 그림 4 : 히드로 겔 SYNThesis. RGD 작용 하이드로 겔 합성 절차. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>폴리(아크릴산) 용액 평균 Mw ~100,000, H2O</td><td>시그마 알드리치</td><td>523925</td><td>CAS 9003-01-4</td></tr><tr><td>폴리(에틸렌 글리콜) 2,000</td><td>시그마 알드리치</td><td>84797</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>카보미어 974P</td><td>Fagron</td><td>1387083</td><td></td></tr><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>Invitrogen 주식 회사</td><td>16500-500</td><td>UltraPure Agarose</td></tr><tr><td>RGD 펩타이드</td><td>abcam</td><td>ab142698</td><td></td></tr><tr><td>4-azidobutanoic acid</td><td>Aurum Pharmatech</td><td>Z-2421</td><td>&nbsp; CAS 54447-68-6</td></tr><tr><td>옥살릴 클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>O8801</td><td>CAS 79-37-8</td></tr><tr><td>프로파르길아민 염산염 95%</td><td>시그마 알드리치</td><td>P50919</td><td>CAS 15430-52-1</td></tr><tr><td>구리(I) 요오드화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>3140</td><td>CAS 7681-65-4</td></tr><tr><td>아스코르브산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>Y0000039</td><td>CAS 134-03-2</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>투석 멤브레인</td><td>스펙트럼 실험실, Inc.</td><td>132725</td><td>Spectra/Por 3 투석 멤브레인&nbsp; 표준 RC 튜빙 MWCO : 3.5 kD</td></tr></tbody></table>

치료 응용 프로그램을위한 도구로 rgd-작용 히드로 겔의 합성

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

고분자를 생체 재료로 사용하면 치료 응용 분야에서 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 특히, 생체 적합성, 기계적 특성 또는 세포 생존력을 개선할 수 있는 화합물로 고분자 사슬을 변형하고 기능화할 수 있는 가능성은 생물 의학 분야의 새로운 과제를 해결할 수 있는 새로운 재료의 설계를 가능하게 합니다. 고분자 기능화 전략을 통해 클릭 화학은 고분자 장치의 세포 호환성 및 약물 전달 특성을 개선하는 강력한 도구입니다. 이와 유사하게, 생물학적 환경의 독성 또는 오염과 같은 잠재적인 부작용을 피하기 위해 멸균 도구를 사용해야 하는 생물 의학의 근본적인 필요성은 마이크로파 지원 전략에 대한 관심을 불러일으키고 있습니다.
클릭 화학과 마이크로파 지원 방법의 조합은 생체 의학 응용 분야에서 원하는 기능과 향상된 성능을 가진 생체 적합성 하이드로겔을 생산하는 데 적합합니다. 이 연구는 RGD 기능성 하이드로겔을 합성하는 것을 목표로 합니다. RGD(아르기닐글리실아스파르트산)는 세포 접착 단백질을 모방하고 세포 표면 수용체에 결합하여 하이드로겔의 3D 고분자 네트워크 내에서 세포를 위한 쾌적한 미세환경을 만들 수 있는 트리펩타이드입니다. RGD 기능화는 Huisgen 1,3-쌍극자 고리추가(huisgen 1,3-dipolar cycloaddition)를 통해 발생합니다. 일부 PAA 카르복실기는 알킨 부분으로 변형되는 반면, RGD는 펩타이드 서열의 말단 잔기로서 아지도산으로 기능화됩니다. 마지막으로, 두 제품 모두 펩타이드를 PAA에 영구적으로 연결하기 위해 구리 촉매 클릭 반응에 사용됩니다. 이 변형 중합체는 카보머, 아가로스 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 함께 사용되어 하이드로겔 매트릭스를 합성합니다. 3D 구조는 마이크로파 보조 중축합을 통해 PAA의 카르복실기와 아가로스 및 PEG의 카보머 및 하이드록실기를 포함하는 에스테르화 반응으로 인해 형성됩니다. 겔화 메커니즘의 효율성은 높은 수준의 RGD 기능화를 보장합니다. 또한 이 기능화된 네트워크 내에서 치료용 화합물 또는 생물학적 도구를 로드하는 절차는 매우 간단하고 재현 가능합니다.

n은 카르복실기, 아민과 반응 단량체 라벨도 1에 나타내었다 같이 PAA의 알킨 유도체를 효율적으로, 폴리 아크릴산 및 propargylamine에서 합성된다. 제품의 아이덴티티는 1 H-NMR 분광법으로 확인 하였다. (5) 삼중 결합 변성 PAA의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig5.jpg" /> 그림 5 : PAA의 1 H-NMR 스펙트럼은 알킨을 수정 알킨 부분에 관련된 신호가 강조 <stron...

세포 및 약물 전달을 위한 장치로서 RGD 기능성 하이드로겔을 합성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 알킨 변성 폴리아크릴산(PAA)과 RGD-아지드 유도체 사이의 구리 촉매 알카인-아지드 고리첨가(CuAAC)가 포함됩니다. 하이드로겔은 마이크로파 보조 중축합을 사용하여 형성되며 물리화학적 특성이 조사됩니다.

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

본 방법론의 전반적인 목표는 조직 공학 응용을 위한 하이드로젤을 매우 용이하게 합성하는 것입니다. 이 방법은 3차원 세포 배양 시스템에서 높은 세포 생존율을 유지할 가능성과 같이 조직 공학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠른 반응을 이용하여 하이드로젤 시스템을 쉽게 수정함으로써 세포 생존 유지 능력을 향상시킬 수 있다는 점입니다.이 기술의 응용 범위는 척수 손상 치료까지 확장되는데, 이는 스캐폴드 내에 탑재된 세포가 손상된 조직을 재건할 수 있기 때문입니다. 따라서 이 방법은 재생 의학으로서의 세포 치료법과 여러 방법론에서의 적용 가능성에 대해 중요한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 뼈, 심장, 연골과 같은 여러 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.RGD-azide 유도체를 합성하려면, 50 mg의 RGD를 1 M 수산화나트륨 1 mL에 녹입니다. 그런 다음 24 mg의 4-azidobutanoyl chloride를 2 mL의 tetrahydrofuran에 녹입니다. 0 °C에서 모든 RGD 용액을 4-azidobutanoyl chloride 용액에 한 방울씩 첨가합니다.실온으로 되돌린 후 하룻밤 동안 교반합니다. 1 M HCl 1 mL를 첨가합니다. 회전 증발기를 사용하여 감압 상태에서 용매를 제거합니다.샘플을 중수(deuterium oxide) 또는 D2O에 용해하여 얻어진 생성물을 양성자 핵자기 공명 분광법으로 분석합니다. PAA 알킨 수식을 수행하려면, 중량 대비 35% PAA 용액 200 mg을 증류수 15 mL에 용해합니다. 여기에 propargylamine hydrochloride 15.4 mg을 첨가합니다.그다음 42.8 milligrams의 HOBt를 50 °C로 가열하여 아세토나이트릴과 증류수 1:1 비율의 용액 14 milliliters에 녹입니다. 상온에서 HOBt 용액 전체를 PAA 용액에 첨가합니다. 이어서 반응 혼합물에 53.6 milligrams의 EDC를 첨가합니다.1 M HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조절하고, 반응 시스템을 상온에서 하룻밤 동안 교반합니다. 다음으로, 증류수 2 L에 염화나트륨 11.2 g을 녹입니다. 그런 다음 37% (w/w) HCl 200 µL를 첨가합니다.분자량 컷오프(MWCO)가 3.5 kilodaltons인 막을 사용하여 용액을 투석합니다. 투석을 3일 동안 수행합니다. 투석액은 200 µL의 37% w/w HCl이 포함된 2 L의 갓 준비한 증류수로 매일 교체합니다.최종 용액을 -80 °C에서 보관하십시오. 샘플을 D2O에 녹여 양성자 핵자기공명 분광법으로 기능화된 폴리머의 특성을 분석하십시오. PAA-RGD 폴리머를 합성하려면, 78 mg의 알킨 변성 PAA를 10 mL의 증류수에 녹이십시오.그 다음 RGD-azide 유도체 25 milligrams를 5 milliliters의 tetrahydrafuran에 녹입니다. RGD 용액 전체를 고분자 용액에 첨가합니다. 이어서 요오드화 구리 2.2 milligrams를 첨가합니다.그리고 2.2 mg의 sodium ascorbate를 첨가합니다. 생성된 혼합물을 60 °C에서 교반하며 밤새 환류시킵니다. 혼합물을 25 °C로 냉각합니다.용액을 투석하려면, 2L의 증류수에 11.2g의 염화나트륨을 녹이고 37% (w/w) HCl 200µL를 첨가하십시오. 3일 동안 투석을 수행합니다. 200µL의 37% (w/w) HCl이 함유된 2L의 신선하게 준비된 증류수로 매일 투석액을 교체하십시오.그 다음 최종 용액을 -80 °C에 둡니다. 생성된 PAA-RGD 폴리머를 구성 성분과 동일한 방식으로 분석하고 보관하십시오. 실온에서 9 mL의 인산 완충 식염수(PBS)에 40 mg의 카보머와 10 mg의 기능화된 PAA를 넣고 완전히 용해될 때까지 혼합합니다.용액에 400 milligrams의 PEG를 첨가하고 45분 동안 계속 교반합니다. 교반을 중단하고 시스템을 30분 동안 침전시킵니다. 그 다음 1 molar 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.얻어진 혼합물 5 mL에 agaros 파우더 25 mg을 추가합니다. 용액이 끓을 때까지 500 W의 마이크로파로 30초에서 1분 동안 조사합니다. 그 후 전자기 가열 장치를 이용하여 용액을 80 °C까지 가열합니다.혼합물을 실온에 노출시켜 온도가 50 °C로 낮아질 때까지 둡니다. 그런 다음 PBS 5 mL를 첨가하여 1:1 부피 비율의 용액을 얻습니다. 지름이 1.1 cm인 스틸 실린더가 포함된 12-well 플레이트를 준비합니다.용액에서 500 µL씩 분주하여 각 스틸 실린더에 넣습니다. 시스템의 겔화가 완전히 이루어질 때까지 플레이트를 45분 동안 정지 상태로 둡니다. 스테인리스 스틸 포셉을 사용하여 실린더를 제거해 하이드로겔을 회수합니다.RGD 기능화 하이드로겔의 물리화학적 특성 분석에 관한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 마이크로파 조사 후 Carbomer 974P, PAA-RGD, PEG가 agarose와 함께 통계적 무작위 축중합 반응에 참여합니다. PEG와 agarose에 포함된 하이드록시기는 Carbomer 947P 및 PAA-RGD에 존재하는 카복실기와 반응하여 ACPEG-RGD 하이드로겔을 형성합니다.유변학적 특성을 고려했을 때, 저장 탄성률이 손실 탄성률보다 약 한 자릿수 더 높게 나타났으며, 이는 해당 물질이 점성보다는 탄성적인 성질을 띠고 있음을 나타냅니다. 또한, 낮은 변형률 값에서는 탄성률에 의해 하이드로젤의 거동이 지배된다는 점이 명확히 관찰됩니다. 주사 전자 현미경 사진은 RGD 기능화된 하이드로젤 샘플과 기능화되지 않은 하이드로젤의 형태를 보여줍니다.두 하이드로젤 모두 서로 연결된 기공들의 고도로 얽힌 구조를 가지고 있으며, 일부 큰 기공 내에 작은 기공들이 포함되어 있고 기공 벽에 섬유상 네트워크가 형성되어 있음이 확인되었습니다. 이러한 유사한 특성은 RGD의 존재가 폴리머 네트워크를 변화시키지 않음을 나타냅니다. 이러한 발전을 통해, 이 기술은 조직 공학 분야의 연구가 다른 여러 질환에서 이러한 세포 배양 시스템의 안정성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후에는 하이드로젤을 기능화하여 줄기세포의 생존 능력을 유지하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

이 비디오는 연쇄 중합 및 하이드로 겔의 합성을 가능하게, 폴리 (에틸렌 글리콜) 메타 크릴 레이트 신속하고 효율적인 방법을 도시한다. 그것은 유사하게 작용의 효율성을 평가하는 문제 해결 및 고급 수정에 대한 제안을 제공하고, 일반 하이드로 겔의 특성 기술을 설명하는 펩티드, 세부 일반적인 분석 방법으로 메타 크릴의 기능을 소개하는 방법을 보여줍니다.

전자 레인지를 이용한 폴리의 기능화 (에틸렌 글리콜) 및 체인 중합 및 하이드로 겔 형성에있는 사용을위한 온 수지 펩티드

우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

프로토콜 분해성 thermoresponsive hydrogels hydrazone 대량 규모, 미, 그리고 나노, 젤 나노 입자 및 nanofibers의 준비에 대 한 후자에 고분자 올리고의 cross-linking에 따라 제작에 대 한 설명 합니다.

자기 조립, 분해 Thermoresponsive Hydrogels 반응 압출, 마이크로, 통해 여러 길이 가늠 자에를 조작 하 고 전기

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

현재 bilayer 문화 모델 vivo에서 microenvironments 모방 기능 생체 외에서 연구에 대 한 허용 하지 않습니다. 폴 리 에틸렌 글리콜과 산화 아연 템플릿 메서드를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다 ultrathin biomimetic 지하실 막의 개발을 가변 강성, 다공성와 밀접 하 게 비보에 모방 하는 생 화 확 적인 구성 세포 외 매트릭스입니다.

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

이 프로토콜은 주사용, 초분자 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 생체 재료의 합성 및 제형을 설명합니다. 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 납품을 위한 이러한 물질의 적용이 입증된다.

세포 및 약물 전달 응용 을 위한 주사용 수급 분자 고분자 고분자 나노 입자 하이드로겔

여기에 제시된 프로토콜은 강력한 접착성 하이드로겔 젤라틴 o-니트로소벤즈알데히드(젤라틴-NB)의 합성을 보여줍니다. Gelatin-NB는 빠르고 효율적인 조직 접착 능력을 가지고 있어 상처 표면을 보호하기 위해 강력한 물리적 장벽을 형성할 수 있으므로 부상 복구 생명 공학 분야에 적용될 것으로 기대됩니다.

강력한 접착력 하이드로겔, 젤라틴 O-니트로소벤즈알데히드의 합성

여기에서 우리는 외부 액상 없이 매크로 스케일 하이드로겔 매트릭스에 cell-free 단백질 합성 반응을 포함하기 위한 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

거시적 규모의 하이드로겔에 cell-free 단백질 합성 반응을 임베딩하는 방법

학습하세요 RGD-기능화 하이드로겔 합성 방법으로 조직 공학 및 세포 치료에 활용하세요. CuAAC와 마이크로파 보조 폴리콘덴세이션을 사용하여 척수 손상 치료와 재생 의학 연구에 적용할 수 있습니다.

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

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