치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

본 방법론의 전반적인 목표는 조직 공학 응용을 위한 하이드로젤을 매우 용이하게 합성하는 것입니다. 이 방법은 3차원 세포 배양 시스템에서 높은 세포 생존율을 유지할 가능성과 같이 조직 공학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠른 반응을 이용하여 하이드로젤 시스템을 쉽게 수정함으로써 세포 생존 유지 능력을 향상시킬 수 있다는 점입니다.

이 기술의 응용 범위는 척수 손상 치료까지 확장되는데, 이는 스캐폴드 내에 탑재된 세포가 손상된 조직을 재건할 수 있기 때문입니다. 따라서 이 방법은 재생 의학으로서의 세포 치료법과 여러 방법론에서의 적용 가능성에 대해 중요한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 뼈, 심장, 연골과 같은 여러 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

RGD-azide 유도체를 합성하려면, 50 mg의 RGD를 1 M 수산화나트륨 1 mL에 녹입니다. 그런 다음 24 mg의 4-azidobutanoyl chloride를 2 mL의 tetrahydrofuran에 녹입니다. 0 °C에서 모든 RGD 용액을 4-azidobutanoyl chloride 용액에 한 방울씩 첨가합니다.

실온으로 되돌린 후 하룻밤 동안 교반합니다. 1 M HCl 1 mL를 첨가합니다. 회전 증발기를 사용하여 감압 상태에서 용매를 제거합니다.

샘플을 중수(deuterium oxide) 또는 D2O에 용해하여 얻어진 생성물을 양성자 핵자기 공명 분광법으로 분석합니다. PAA 알킨 수식을 수행하려면, 중량 대비 35% PAA 용액 200 mg을 증류수 15 mL에 용해합니다. 여기에 propargylamine hydrochloride 15.4 mg을 첨가합니다.

그다음 42.8 milligrams의 HOBt를 50 °C로 가열하여 아세토나이트릴과 증류수 1:1 비율의 용액 14 milliliters에 녹입니다. 상온에서 HOBt 용액 전체를 PAA 용액에 첨가합니다. 이어서 반응 혼합물에 53.6 milligrams의 EDC를 첨가합니다.

1 M HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조절하고, 반응 시스템을 상온에서 하룻밤 동안 교반합니다. 다음으로, 증류수 2 L에 염화나트륨 11.2 g을 녹입니다. 그런 다음 37% (w/w) HCl 200 µL를 첨가합니다.

분자량 컷오프(MWCO)가 3.5 kilodaltons인 막을 사용하여 용액을 투석합니다. 투석을 3일 동안 수행합니다. 투석액은 200 µL의 37% w/w HCl이 포함된 2 L의 갓 준비한 증류수로 매일 교체합니다.

최종 용액을 -80 °C에서 보관하십시오. 샘플을 D2O에 녹여 양성자 핵자기공명 분광법으로 기능화된 폴리머의 특성을 분석하십시오. PAA-RGD 폴리머를 합성하려면, 78 mg의 알킨 변성 PAA를 10 mL의 증류수에 녹이십시오.

그 다음 RGD-azide 유도체 25 milligrams를 5 milliliters의 tetrahydrafuran에 녹입니다. RGD 용액 전체를 고분자 용액에 첨가합니다. 이어서 요오드화 구리 2.2 milligrams를 첨가합니다.

그리고 2.2 mg의 sodium ascorbate를 첨가합니다. 생성된 혼합물을 60 °C에서 교반하며 밤새 환류시킵니다. 혼합물을 25 °C로 냉각합니다.

용액을 투석하려면, 2L의 증류수에 11.2g의 염화나트륨을 녹이고 37% (w/w) HCl 200µL를 첨가하십시오. 3일 동안 투석을 수행합니다. 200µL의 37% (w/w) HCl이 함유된 2L의 신선하게 준비된 증류수로 매일 투석액을 교체하십시오.

그 다음 최종 용액을 -80 °C에 둡니다. 생성된 PAA-RGD 폴리머를 구성 성분과 동일한 방식으로 분석하고 보관하십시오. 실온에서 9 mL의 인산 완충 식염수(PBS)에 40 mg의 카보머와 10 mg의 기능화된 PAA를 넣고 완전히 용해될 때까지 혼합합니다.

용액에 400 milligrams의 PEG를 첨가하고 45분 동안 계속 교반합니다. 교반을 중단하고 시스템을 30분 동안 침전시킵니다. 그 다음 1 molar 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.

얻어진 혼합물 5 mL에 agaros 파우더 25 mg을 추가합니다. 용액이 끓을 때까지 500 W의 마이크로파로 30초에서 1분 동안 조사합니다. 그 후 전자기 가열 장치를 이용하여 용액을 80 °C까지 가열합니다.

혼합물을 실온에 노출시켜 온도가 50 °C로 낮아질 때까지 둡니다. 그런 다음 PBS 5 mL를 첨가하여 1:1 부피 비율의 용액을 얻습니다. 지름이 1.1 cm인 스틸 실린더가 포함된 12-well 플레이트를 준비합니다.

용액에서 500 µL씩 분주하여 각 스틸 실린더에 넣습니다. 시스템의 겔화가 완전히 이루어질 때까지 플레이트를 45분 동안 정지 상태로 둡니다. 스테인리스 스틸 포셉을 사용하여 실린더를 제거해 하이드로겔을 회수합니다.

RGD 기능화 하이드로겔의 물리화학적 특성 분석에 관한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 마이크로파 조사 후 Carbomer 974P, PAA-RGD, PEG가 agarose와 함께 통계적 무작위 축중합 반응에 참여합니다. PEG와 agarose에 포함된 하이드록시기는 Carbomer 947P 및 PAA-RGD에 존재하는 카복실기와 반응하여 ACPEG-RGD 하이드로겔을 형성합니다.

유변학적 특성을 고려했을 때, 저장 탄성률이 손실 탄성률보다 약 한 자릿수 더 높게 나타났으며, 이는 해당 물질이 점성보다는 탄성적인 성질을 띠고 있음을 나타냅니다. 또한, 낮은 변형률 값에서는 탄성률에 의해 하이드로젤의 거동이 지배된다는 점이 명확히 관찰됩니다. 주사 전자 현미경 사진은 RGD 기능화된 하이드로젤 샘플과 기능화되지 않은 하이드로젤의 형태를 보여줍니다.

두 하이드로젤 모두 서로 연결된 기공들의 고도로 얽힌 구조를 가지고 있으며, 일부 큰 기공 내에 작은 기공들이 포함되어 있고 기공 벽에 섬유상 네트워크가 형성되어 있음이 확인되었습니다. 이러한 유사한 특성은 RGD의 존재가 폴리머 네트워크를 변화시키지 않음을 나타냅니다. 이러한 발전을 통해, 이 기술은 조직 공학 분야의 연구가 다른 여러 질환에서 이러한 세포 배양 시스템의 안정성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 하이드로젤을 기능화하여 줄기세포의 생존 능력을 유지하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.