신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

이 실험 절차의 전체적인 목표는 클론 형성 조건에서 신경구 형성 및 분화를 이용하여 특정 세포군 내의 신경 줄기세포 빈도를 측정하는 것입니다. 이 방법은 후보 신경 줄기세포 마커의 평가, 신경 줄기세포의 정제, 그리고 신경 줄기세포와 신경 전구세포의 구별과 같이 신경 줄기세포 분야에서 핵심적인 유용성을 갖습니다. 본 방법의 장점은 수행 기간이 13일로 기존의 신경 줄기세포 빈도 측정법보다 짧으며, 클론 조건 하에서 수행된다는 점입니다.

이 실험 절차를 시작하기 위해, 1일 차에 DMEM F12 배지와 B27, EGF, BFGF, 그리고 penicillin streptomycin을 혼합하여 NSC 성장 배지를 준비합니다. 그 다음, 1 mL의 NSC 성장 배지와 1 mL의 0.05 N 수산화나트륨(Sodium Hydroxide)에서 E14.5 마우스 신경구(neurospheres)를 상온에서 7분 동안 해리시킵니다. 세포가 부유 상태를 유지하도록 가끔 피펫팅하여 섞어준 뒤, 1 mL의 0.05 N 염산을 첨가하여 알칼리를 중화합니다.

그 후, trypan-blue 염색과 hemocytometer를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 이어서, 96-well dish의 100 µL NSC 성장 배지에 E14.5 마우스 neurosphere 세포를 mL당 50 cells 이하의 밀도로 분주합니다. 클론 neurosphere를 생성하기 위해 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 1주일 동안 배양합니다.

조건화 배지를 위한 신경구(neurosphere)를 배양하려면, 3일 차에 E14.5 마우스 신경구를 해리하고 단일 세포를 10 cm 배양 접시에 담긴 10 mL의 NSC 성장 배지에 20,000 cells/mL 밀도로 접종합니다. 그 후, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 5일 동안 배양하여 대량 배양된 신경구를 생성합니다. 8일 차에 0.01% poly-L-lysine 700 µL, 1 mg/mL 농도의 laminin 70 µL, 그리고 PBS 6,230 µL를 혼합하여 코팅 용액을 준비합니다.

다음으로, 10 cm 배양 접시를 7 mL의 poly-L-lysine laminin 용액으로 37 °C에서 2시간 동안 코팅합니다. 10 mL 세롤로지 피펫을 사용하여 대량 배양된 모든 신경구(neurosphere)를 15 mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 171 ×g로 1분 동안 신경구를 원심분리하고, 상층액을 완전히 제거합니다.

그 후, DMEM F12 배지에 B27과 FBS를 혼합하여 NSC 분화 배지를 준비합니다. 신경구(neurospheres)에 NSC 분화 배지 10 milliliters를 첨가하고, 파이펫으로 수차례 상하로 섞어 신경구를 재현탁합니다. 그런 다음 10 centimeter 배양 접시에서 poly-L-lysine laminin을 흡입하여 제거하고, PBS 10 milliliters로 한 번 세척합니다.

모든 신경구(neurosphere)를 poly-L-lysine laminin이 코팅된 10 centimeter 배양 접시에 옮기고, 신경구가 접시에 부착될 수 있도록 37 °C, 5%CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 8일 차에 현미경으로 각 웰에 형성된 신경구의 수를 측정합니다. 그런 다음 50웰 챔버 커버슬립의 각 웰에 10 µL의 poly-L-lysine laminin 코팅 용액을 처리하여 37 °C에서 2시간 동안 코팅합니다. 이어서, 각각 30 mL의 PBS가 담긴 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브 3개를 준비합니다.

멸균 핀셋을 사용하여 코팅된 50웰 챔버 커버슬립을 꺼내고, 코팅 용액을 씻어내기 위해 첫 번째 PBS 튜브, 두 번째, 그리고 세 번째 PBS 튜브에 차례대로 담급니다. 그 후, 챔버 커버슬립의 웰에 남아 있는 액체를 흡입하여 제거합니다. 96웰 디쉬의 각 웰에 들어 있는 모든 배지와 신경구(neurospheres)를 하나의 10 centimeter 배양 접시로 조심스럽게 옮깁니다.

피펫 컬럼을 2 µL로 설정하여 매번 단 하나의 신경구(neurosphere)만 선택되도록 합니다. 10 µL 피펫 팁이 장착된 P10 마이크로 피펫을 사용하여 현미경 하에서 샘플 신경구를 선택합니다. 신경구 선택 작업은 현미경 하에서 수행하거나, 층류 hoods(laminar flow hood) 또는 벤치 탑에서 수행할 수 있습니다. 그 다음, 선택한 신경구를 코팅된 50웰 챔버 커버슬립의 웰 중앙으로 옮깁니다.

챔버 커버슬립의 각 웰에 뉴로스피어가 포함될 때까지 해당 절차를 반복합니다. 그 후, 챔버 커버슬립의 각 웰에 10 µL의 NSC 분화 배지를 첨가합니다. 챔버 커버슬립을 10 cm 배양 접시에 넣습니다.

최대 2개의 챔버 커버슬립을 10 centimeter 디시에 넣을 수 있습니다. NSC 분화 배지가 마르는 것을 방지하기 위해 디시 가장자리를 따라 PBS를 피펫팅합니다. 챔버 커버슬립을 37 degrees Celsius, 5%CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

9일째에, 대량 배양된 뉴로스피어(neurospheres)의 조건화 배지를 15 milliliter 원뿔형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 20 milliliter 멸균 주사기를 사용하여 조건화 배지를 0.2 micrometer 필터로 여과해 세포나 부스러기를 제거합니다. 그 후, 여과된 조건화 배지를 다시 10 centimeter 배양 접시에 넣습니다.

그 후 멸균 핀셋을 사용하여 챔버 커버슬립을 처리된 배지 위에 샘플 신경구(neurospheres)가 아래를 향하도록 뒤집어 조심스럽게 놓습니다. 챔버 커버슬립을 37°C, 5% CO2 조건에서 3일 동안 배양합니다. 12일 차에 멸균 핀셋을 사용하여 10 cm 배양 접시에서 챔버 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다.

커버슬립을 PBS에 살며시 담가 컨디셔닝 배지를 씻어냅니다. 그런 다음, 커버슬립이 깨지지 않도록 주의하며 실리콘 가스켓을 천천히 조심스럽게 떼어냅니다. 분화된 신경구(neurospheres)가 부착되어 있는 면을 확인하십시오.

그 후, 커버슬립 크기로 자른 파라핀 필름 위에 4% paraformaldehyde 1 mm를 파이펫으로 분주합니다. 뉴로스피어가 paraformaldehyde와 접촉하도록 아래쪽을 향하게 하여 커버슬립을 파라핀 필름 위에 조심스럽게 올리고, 실온에서 20분 동안 뉴로스피어를 고정합니다. 본 과정에서는 단일 뉴로스피어를 선택하여 50웰 챔버 커버슬립에서 3일 동안 분화시켰습니다.

이것은 DAPI로 염색하고 GFAP, TUJ1 및 O4로 면역 염색한 삼분화능 신경구(tripotent neurosphere)의 대표 이미지입니다. 이 이미지는 DAPI, GFAP, TUJ1 및 O4의 중첩 영상을 보여줍니다. 이 프로토콜은 알려진 NSC 마커인 LeX가 NSC를 농축시키는 능력을 평가하는 데 사용됩니다. 이 그래프는 LeX 양성 및 LeX 음성 세포에 의해 생성된 단분화능, 이분화능 및 삼분화능 신경구의 비율을 보여줍니다. LeX 양성 세포는 LeX 음성 세포보다 유의미하게 더 많은 삼분화능 신경구를 생성합니다.

이 표는 LeX 양성 및 LeX 음성 세포의 NSC 빈도가 NFU와 삼분화능 신경구(tripotent neurospheres)의 백분율의 곱으로 계산되었음을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후, 신경줄기세포 빈도를 산출하기 위해 클론 조건에서 신경구를 배양하고 분화시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법을 수행할 때는 신경구의 최적의 성장 및 분화 조건을 보장하기 위해 갓 조제한 성장 및 분화 배지와 갓 조제한 코팅 용액을 사용하는 것이 중요합니다.

이 방법은 숙달되면 13일 만에 수행할 수 있으며, 이는 신경 줄기 세포 빈도를 산출하는 기존 방법들에 비해 단축된 시간입니다. 이 방법은 신경 콜로니 형성 세포 분석과 같은 기존 방법과 병행하여 새로운 줄기 세포를 농축하고 결정적인 신경 줄기 세포 마커를 식별하는 데 활용될 수 있습니다.